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摘要：本文从细胞生物学方面阐述了无融合生殖甜菜M14绒毡层异常导致花粉败育的机理、通过解剖花药及压片法技术观察小孢子发生机制，利用生物学手段化学诱导的方法，克隆部分与绒毡层特异表达相关的基因，无融合生殖型和减数分裂型同时存在于甜菜M14之中，运用生物技术手段实现绒毡层对无融合生殖甜菜花粉发育的调控未能成功，花粉败育率达80%左右j
关键词：无融合生殖;绒毡层;花粉败育
无融合生殖甜菜（apomixis）是指通过种子进行繁殖的特殊的无性繁殖方式【1】，产生的子代基因型与亲本精确相同，因此，能固定杂种优势，具有重要的应用前景。
研究表明，绒毡层细胞发育过程中的任何异常，都可能直接或间接导致花粉粒的败育，形成雄性不育[2.31植物绒毡层作为花药壁最内层细胞，是向花粉母细胞运输物质的枢纽，对花粉母细胞及后期小孢子的正常发育起着至关重要的作用【4】。绒毡层细胞径向膨大，细胞内含物极少，其营养无法满足自身发育需要，反而通过径向伸长以吸取小孢子四分体中营养，导致小孢子营养流失不能正常生长发育而形成花粉败育[5】。研究无融合生殖甜菜绒毡层细胞发育对花粉败育机理的影响，将有助于对无融合生殖甜菜的深入研究，在遗传育种方面研创优良品系同样具有非常重要的意义。目前为止，国内外尚未发现对无融合生殖甜菜M14花粉败育机理的研究分析及报道，因此，启动了本项研究工作。
1材料及方法
1.1试验材料
黑龙江大学生命科学学院甜菜课题组于1988年开始利用栽培甜菜与野生白花甜菜杂交，由于当时选择了适宜的非整倍体初级三体PT6（W+ 1C，2n =18+1）作为杂交亲本，提供了一个不减数配子（2n）与引种于英国皇家植物园的带有无融合生殖特性的野生种白花甜菜（Beta corolliflora ZOSS，cccc，2n=4x =36）杂交。获得了一株真实杂种（VVCC，2n= 36）的杂种F1代，利用PT6回交，经过细胞学和形态学鉴定表明：共获得9种类型的单体附加系系列，其中M14株系为带有白花甜菜第9号染色体的栽培型甜菜单体附加系，表明将带有无融合生殖基因的一条白花甜菜染色体转移到栽培甜菜（ PT6）中，使原来只能进行有性生殖的栽培甜菜可以高效表达无融合生殖特性[6-7]。本文中的M14传递率高达96. 5%能稳定传递后代，经过十余年的杂交工作首次在世界上获得带有一条白花甜菜染色体的栽培型（Ⅸ）甜菜单体附加系M14（Beta vulgaris L，VV+1C、2n=18+1），通过胚胎学判定为兼性无融合生殖【8】。单体附加系甜菜M14近100%传递和异缘三倍体甜菜（wc）传递率达80%以上的材料均属世界首创，为进一步克隆无融合生殖基因提供极具研究价值的优质实验材料【9-10】。
1.2试验方法
在夏季6-7月份，到田间取甜菜的花序，用卡诺固定液固定24h，再转入70%酒精中放人4℃冰箱长期固定。通过解剖镜将花药分离，用盐酸乙醇混合液1：1解离，石炭酸品红染色，压片，使细胞分散并处在同一平面内，不重叠以便于观察、统计计数及分析。用丁香油（ clove oil）封片。在OLYMPUS-BX51型荧光显微镜下通过荧光显微镜技术观察和摄影并进行统计处理和数据分析。制片观察分析样本，以证明花粉败育情况和无融合生殖甜菜小孢子发生机制。
利用100-150ppm的利用100-150ppm的2，4-D、萘乙酸（ NAA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、激动素（KT）及秋水仙素等植物生长激素，在甜菜M14和异缘三倍体甜菜（wc）开花季节（6-8月），用微型喷雾器喷洒在正在开花的花序枝条上，选取不同株系的异缘三倍体甜菜（wc）和单体附加系甜菜M14，同一株系以不同分支为单位，喷洒200 - 500朵花，10月份按不同处理分别收取种子，冬季温室播种按镜检方法统计传递率。
2结果与分析
2.1无融合生殖甜菜M14不同花序传递率分析
随机选取3株甜菜，每株取5 -10个花序，各株系不同花序的单体附加系后代传递率高且差异较小。传递率分别为96 5%、95 2%和94 7%。说明单体附加系甜菜传递率高而稳定。
无融合生殖甜菜单体附加系（ VV+1C，2n=19）在开放传粉條件下繁殖时，可结实形成种子传递后代，连续多年传递率检查，产生频率变化范围在6 .83% - 13 70%，而异缘三倍体甜菜（ wc，2n=27）的传递率变化在24 86% - 27 08%.二倍体甜菜（w，2n=18）变化在55 76% - 60 33%。结果证明，异缘三倍体甜菜和单体附加系甜菜是可以高频稳定传递的，但传递过程中会同时产生少量的非整倍体和二倍体，从而异缘三倍体甜菜（ vvc，2n=27）的传递率和后代观察中无融合生殖后代可分为两种类型：无融合证明材料具有兼性无融合生殖特性。
2.2不同激素的影响结果
利用激素刺激试图提高无融合生殖传递率，用2，4-D、萘乙酸（ NAA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3），激动素（KT）及秋水仙素等植物生长激素的溶液喷洒在花期的无融合生殖甜菜的花序。根据处理的花数与结实粒数之比，计算出结实率与普通栽培甜菜比较，无融合生殖甜菜的结实率都比较低，一般小于10%。不同激素处理结果2，4-D结实率较高，45.1% -91 .6%。萘乙酸（NAA）结实率大5 3%-91 6%。其他激素诱发结实率都较低，不同株系之间也有差异。虽然激素诱发刺激结实，增加了结实效率，但所结实空壳率很高，出苗率很低，说明化学刺激诱发了花萼的发育而不能提高无融合生殖甜菜的传递效率。
3讨论
从无融合生殖甜菜的利用来看，希望获得稳定传递的无融合生殖类型，证实来自白花甜菜的一条染色体或染色体组决定了无融合生殖或兼性无融合生殖。但实验过程中发现材料存在两种类型：无融合生殖型和减数分裂型。之前对无融合生殖不够深入了解，没有控制好两种类型的传递。由于减数分裂型甜菜接受外来花粉的能力较强，因此，在后代中产生了各种非整倍体的现象。
在高频传递具有无融合生殖基因的背景下，由于该甜菜结实率较低，希望通过化学诱发提高传递率和结实率。表面上看种子膨大了，但实际上并没有形成胚而发育成种子。种子膨大的结果是激素刺激了萼片的发育，而没有促进胚珠的形成和发育。不能真正提高无融合生殖的传递率。当然不排除药物浓度不恰当及药物种类选择的不适宜，还有可能是与试验的次数少有关。为了进一步证实无融合生殖花粉败育的机理，还应当进一步深入研究。
参考文献
【1】Nogler G A.Genetics of apospory in apomictic. Ranuncu-lus auricomus V.Conclusio ns Bot Helv，1984，94： 411 - 422
【2】刘丽萍，刘巧红.唐艳.陶鑫.甜菜染色体操纵材料遗传学特性及经济性状的研究【J】黑龙江大学自然科学学报，2017，34（06）：708 - 713
【3】Huang MD. Hsing Yl， Huang AH .Transcriptomes of theanther sporophyte availability and uses 【J】Plant Cell Physiol，2011， 52（ 09）：1459 -1466
【4】Pacini E.Tapetum character states： analytical keys for tape-tum types and activities[J】Can J Bot，1997， 75（09）： 1448 -1459
[5】刘丽萍，刘巧红，闫赓，郭德栋单体附加系甜菜及空中搭载实验材料相关性状的研究【J】中国农学通报，2018，34（30）：37 - 41
[6]郑佳玲，刘丽萍远缘杂交甜菜M14野生基因相关性状的研究【J】吉林农业，2018，（20）：052-054
【7】郭德栋，康传红，刘丽萍等异缘三倍体甜菜（ VVC）无融合生殖的研究【J】中国农业科学，1999，（04）：113-114
【8】梅其文，胡伟明，吴烨东，李海英甜菜M14品系特异表达基因ESTs的生物信息学分析【J】黑龙江大学自然科学学报，2007，（05）.
关键词：无融合生殖;绒毡层;花粉败育
无融合生殖甜菜（apomixis）是指通过种子进行繁殖的特殊的无性繁殖方式【1】，产生的子代基因型与亲本精确相同，因此，能固定杂种优势，具有重要的应用前景。
研究表明，绒毡层细胞发育过程中的任何异常，都可能直接或间接导致花粉粒的败育，形成雄性不育[2.31植物绒毡层作为花药壁最内层细胞，是向花粉母细胞运输物质的枢纽，对花粉母细胞及后期小孢子的正常发育起着至关重要的作用【4】。绒毡层细胞径向膨大，细胞内含物极少，其营养无法满足自身发育需要，反而通过径向伸长以吸取小孢子四分体中营养，导致小孢子营养流失不能正常生长发育而形成花粉败育[5】。研究无融合生殖甜菜绒毡层细胞发育对花粉败育机理的影响，将有助于对无融合生殖甜菜的深入研究，在遗传育种方面研创优良品系同样具有非常重要的意义。目前为止，国内外尚未发现对无融合生殖甜菜M14花粉败育机理的研究分析及报道，因此，启动了本项研究工作。
1材料及方法
1.1试验材料
黑龙江大学生命科学学院甜菜课题组于1988年开始利用栽培甜菜与野生白花甜菜杂交，由于当时选择了适宜的非整倍体初级三体PT6（W+ 1C，2n =18+1）作为杂交亲本，提供了一个不减数配子（2n）与引种于英国皇家植物园的带有无融合生殖特性的野生种白花甜菜（Beta corolliflora ZOSS，cccc，2n=4x =36）杂交。获得了一株真实杂种（VVCC，2n= 36）的杂种F1代，利用PT6回交，经过细胞学和形态学鉴定表明：共获得9种类型的单体附加系系列，其中M14株系为带有白花甜菜第9号染色体的栽培型甜菜单体附加系，表明将带有无融合生殖基因的一条白花甜菜染色体转移到栽培甜菜（ PT6）中，使原来只能进行有性生殖的栽培甜菜可以高效表达无融合生殖特性[6-7]。本文中的M14传递率高达96. 5%能稳定传递后代，经过十余年的杂交工作首次在世界上获得带有一条白花甜菜染色体的栽培型（Ⅸ）甜菜单体附加系M14（Beta vulgaris L，VV+1C、2n=18+1），通过胚胎学判定为兼性无融合生殖【8】。单体附加系甜菜M14近100%传递和异缘三倍体甜菜（wc）传递率达80%以上的材料均属世界首创，为进一步克隆无融合生殖基因提供极具研究价值的优质实验材料【9-10】。
1.2试验方法
在夏季6-7月份，到田间取甜菜的花序，用卡诺固定液固定24h，再转入70%酒精中放人4℃冰箱长期固定。通过解剖镜将花药分离，用盐酸乙醇混合液1：1解离，石炭酸品红染色，压片，使细胞分散并处在同一平面内，不重叠以便于观察、统计计数及分析。用丁香油（ clove oil）封片。在OLYMPUS-BX51型荧光显微镜下通过荧光显微镜技术观察和摄影并进行统计处理和数据分析。制片观察分析样本，以证明花粉败育情况和无融合生殖甜菜小孢子发生机制。
利用100-150ppm的利用100-150ppm的2，4-D、萘乙酸（ NAA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、激动素（KT）及秋水仙素等植物生长激素，在甜菜M14和异缘三倍体甜菜（wc）开花季节（6-8月），用微型喷雾器喷洒在正在开花的花序枝条上，选取不同株系的异缘三倍体甜菜（wc）和单体附加系甜菜M14，同一株系以不同分支为单位，喷洒200 - 500朵花，10月份按不同处理分别收取种子，冬季温室播种按镜检方法统计传递率。
2结果与分析
2.1无融合生殖甜菜M14不同花序传递率分析
随机选取3株甜菜，每株取5 -10个花序，各株系不同花序的单体附加系后代传递率高且差异较小。传递率分别为96 5%、95 2%和94 7%。说明单体附加系甜菜传递率高而稳定。
无融合生殖甜菜单体附加系（ VV+1C，2n=19）在开放传粉條件下繁殖时，可结实形成种子传递后代，连续多年传递率检查，产生频率变化范围在6 .83% - 13 70%，而异缘三倍体甜菜（ wc，2n=27）的传递率变化在24 86% - 27 08%.二倍体甜菜（w，2n=18）变化在55 76% - 60 33%。结果证明，异缘三倍体甜菜和单体附加系甜菜是可以高频稳定传递的，但传递过程中会同时产生少量的非整倍体和二倍体，从而异缘三倍体甜菜（ vvc，2n=27）的传递率和后代观察中无融合生殖后代可分为两种类型：无融合证明材料具有兼性无融合生殖特性。
2.2不同激素的影响结果
利用激素刺激试图提高无融合生殖传递率，用2，4-D、萘乙酸（ NAA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3），激动素（KT）及秋水仙素等植物生长激素的溶液喷洒在花期的无融合生殖甜菜的花序。根据处理的花数与结实粒数之比，计算出结实率与普通栽培甜菜比较，无融合生殖甜菜的结实率都比较低，一般小于10%。不同激素处理结果2，4-D结实率较高，45.1% -91 .6%。萘乙酸（NAA）结实率大5 3%-91 6%。其他激素诱发结实率都较低，不同株系之间也有差异。虽然激素诱发刺激结实，增加了结实效率，但所结实空壳率很高，出苗率很低，说明化学刺激诱发了花萼的发育而不能提高无融合生殖甜菜的传递效率。
3讨论
从无融合生殖甜菜的利用来看，希望获得稳定传递的无融合生殖类型，证实来自白花甜菜的一条染色体或染色体组决定了无融合生殖或兼性无融合生殖。但实验过程中发现材料存在两种类型：无融合生殖型和减数分裂型。之前对无融合生殖不够深入了解，没有控制好两种类型的传递。由于减数分裂型甜菜接受外来花粉的能力较强，因此，在后代中产生了各种非整倍体的现象。
在高频传递具有无融合生殖基因的背景下，由于该甜菜结实率较低，希望通过化学诱发提高传递率和结实率。表面上看种子膨大了，但实际上并没有形成胚而发育成种子。种子膨大的结果是激素刺激了萼片的发育，而没有促进胚珠的形成和发育。不能真正提高无融合生殖的传递率。当然不排除药物浓度不恰当及药物种类选择的不适宜，还有可能是与试验的次数少有关。为了进一步证实无融合生殖花粉败育的机理，还应当进一步深入研究。
参考文献
【1】Nogler G A.Genetics of apospory in apomictic. Ranuncu-lus auricomus V.Conclusio ns Bot Helv，1984，94： 411 - 422
【2】刘丽萍，刘巧红.唐艳.陶鑫.甜菜染色体操纵材料遗传学特性及经济性状的研究【J】黑龙江大学自然科学学报，2017，34（06）：708 - 713
【3】Huang MD. Hsing Yl， Huang AH .Transcriptomes of theanther sporophyte availability and uses 【J】Plant Cell Physiol，2011， 52（ 09）：1459 -1466
【4】Pacini E.Tapetum character states： analytical keys for tape-tum types and activities[J】Can J Bot，1997， 75（09）： 1448 -1459
[5】刘丽萍，刘巧红，闫赓，郭德栋单体附加系甜菜及空中搭载实验材料相关性状的研究【J】中国农学通报，2018，34（30）：37 - 41
[6]郑佳玲，刘丽萍远缘杂交甜菜M14野生基因相关性状的研究【J】吉林农业，2018，（20）：052-054
【7】郭德栋，康传红，刘丽萍等异缘三倍体甜菜（ VVC）无融合生殖的研究【J】中国农业科学，1999，（04）：113-114
【8】梅其文，胡伟明，吴烨东，李海英甜菜M14品系特异表达基因ESTs的生物信息学分析【J】黑龙江大学自然科学学报，2007，（05）.