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【摘 要】 目的：建立测定五味子合剂中五味子醇甲的含量测定方法。方法：采用HPLC法，色谱柱为Agilent EtlipseXDB-C18（5μm，4.6×150mm），流动相为乙腈-0.5%冰醋酸水溶液（60
∶40），流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为250nm，进样量为10μL，以外标法定量。结果：五味子醇甲在进样量0.128～3.194μg之间与峰面积值呈现良好的线性关系，相关系数r=0.9993，平均回收率为97.70%，RSD为1.6%（n=6）。結论：该法操作简便快捷，重复性及稳定性良好，结果准确可靠，可作为控制五味子合剂质量的方法。
【关键词】 五味子合剂;五味子醇甲;HPLC;含量测定
【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2019）11-0022-03
Determination of Schisandrin A in Wuweizi Mixture by HPLC
QIN Kaiyu1 WU Min1 GAN Yangying2 ZHANG Bei1 LI Junwei1 XIAO Xiuzhen1 ZHANG Zhi1*
1.Liuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guangxi， Liuzhou 545001， China; 2.YuLin Center for Food and Drug Control，Yulin 537000，China
Abstract：Objective To establish a method for the determination of schisandrin A in Wuweizi Mixture.Methods The chromatographic column was Agilent Etlipse XDB-C18 （5μm，4.6×150mm）， the mobile phase was acetonitrile-0.5% glacial acetic acid aqueous solution （60∶40）， the flow rate was 1.0mL. min-1， the column temperature was 30℃， the detection wavelength was 250nm， the injection volume was 10μL， and the external standard method was used for quantitative analysis. Results There was a good linear relationship between schisandrin A and peak area in the range of 0.128～3.194μg. The correlation coefficient r=0.9993， the average recovery rate was 97.70%， and RSD was 1.6%（n=6）.Conclusions The method is simple， rapid， reproducible and stable. The results are accurate and reliable. It can be used as a method to control the quality of Wuweizi Mixture.
Keywords：Wuweizi Mixture ; Schisandrin A ; HPLC ; Determination
五味子合剂是柳州市中医医院的一代老中医的验方，由五味子和黄芪等中药提炼组成。为棕黄色澄明液体，味甜、微酸，具有补气镇静的功效，常用于神经衰弱、失眠、健忘、营养不良等疾病。其中，五味子在该配方中位列君药，起主导作用。五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实，习称北五味子，具有敛肺止咳、固肾纳气;滋养肝肾、强健筋骨;固精止遗、涩肠止泻;生津止渴、益气敛汗;滋肾宁心，调解酒毒的临床功效[1-2]。五味子入药始载于《神农本草经》，列为上品，后在《图经本草》和《名医别录》均有记载和考证，具有极高的药用价值。现代研究表明[3-4]五味子具有增加机体免疫力，清除氧自由基、抑制脂质过氧化，诱导肿瘤细胞凋亡，升高白细胞等药理作用。五味子中所含的木脂素类成分是其主要的有效活性成分，其中以含量较高的五味子醇甲为代表[5-6]，有研究表明[7]五味子醇甲对急性炎症小鼠模型和免疫抑制小鼠模型增强效果显著。鉴于五味子合剂疗效确切、应用广泛，口碑较好，而原质量标准中仅有理化鉴别，无含量测定项，且未见报道以其有效成分五味子醇甲的含量测定为定量控制指标，对其内在质量控制性不足，因此为了提高五味子合剂的质量标准，本实验对五味子合剂中五味子醇甲的含量进行初步研究，建立了五味子合剂中五味子醇甲的HPLC含量测定方法，为评价五味子合剂的质量提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 U3000高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）;Synergy超纯水机（美国Millipore公司）;XS-205Du电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。
1.2 试药 五味子合剂（批号：20170121，柳州中医院制剂室制备）。五味子醇甲对照品（批号：110857-200304，中国药品生物制品检定所）;甲醇（色谱纯，批号：UN1230，默克股份两合公司）、乙腈（色谱纯，批号：UN1648，默克股份两合公司），冰醋酸（优级纯，批号：10000218，国药集团化学试剂有限公司），乙酸乙酯（色谱纯，批号UN1173，默克股份两合公司），水为超纯水。 2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Ag-ilent EtlipseXDB-C18柱（5μm，4.6mm×150mm）;流动相：乙腈-0.5%冰醋酸溶液（60∶40）;流速：1.0mL/min;柱温：30℃;检测波长：250nm;进样量为10μL。在此条件下，理论塔板数以五味子醇甲峰计算应不低于5000。
2.2 对照品溶液制备 精密称取五味子醇甲15.97mg，置25mL量瓶中，加适量甲醇超声使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，搖匀，即得。（浓度为0.6388mg/mL）。
2.3 供试品溶液制备 精密量取五味子合剂10mL，用乙酸乙酯萃取两次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10mL量瓶中并定容，过滤，取续滤液，即得。
2.4 阴性对照溶液制备 按处方比例分别称取除五味子以外的其余药味，按制备工艺制备阴性样品，按“2.3供试品制备方法”制备阴性对照溶液。
2.5 干扰实验 分别精密吸取上述五味子醇甲对照品溶液、五味子合剂供试品溶液和阴性对照溶液各10μL，在上述色谱条件下，供试品中五味子醇甲与对照品色谱峰保留时间一致，并与相邻色谱峰分离度大于1.5，阴性无干扰。色谱图如图1所示。
2.6 线性关系考察 分别精密量取上述五味子醇甲对照品溶液（浓度为0.6388mg/mL）0.2、0.5、1、2、5mL定容到10mL，精密吸取10μL，注入高效液相色谱仪，测定五味子醇甲的峰面积，以五味子醇甲的浓度（x）为横坐标，其峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为y=0.426x-0.075，r=0.9993。结果表明五味子醇甲进样量在0.128～3.194μg之间与峰面积值呈现良好的线性关系。
2.7 精密度试验 精密吸取五味子醇甲对照品溶液（浓度为0.6388mg·mL-1）10μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录五味子醇甲图谱及峰面积，结果五味子醇甲平均峰面积值RSD为0.4%。表明该液相色谱仪的精密度良好。
2.8 稳定性试验 精密量取五味子合剂（批号为20170121）10mL，按“2.3供试品制备方法”制备，按“2.1”项下色谱条件，分别于1、2、4、6、12、24h进样，记录图谱及数据并计算其含量，考察五味子合剂供试品溶液的稳定性。结果显示：在24h内五味子醇甲平均含量RSD为1.6%。表明五味子合剂供试品溶液在24h内具有良好的稳定性。
2.9 重复性试验 取同一批五味子合剂6份（批号为20170121），分别精密量取10mL，按“2.3供试品制备方法”制备，按2.1项下色谱条件测定五味子醇甲峰面积并计算其含量，考察方法的重复性。结果五味子醇甲平均含量为0.058mg/mL，RSD为1.8%。表明该方法的重复性良好。
2.10 加样回收试验 取已知含量（含量为0.058mg/mL）的五味子合剂6份，每份精密量取5mL，置分液漏斗中，再加入浓度为0.6388mg/mL的五味子醇甲对照品溶液0.5mL，自“用乙酸乙酯萃取两次”起，按“2.3供试品溶液制备”方法处理，按“2.1”项下色谱条件测定五味子醇甲峰面积并计算回收率，平均回收率为97.70%，RSD为1.6%，表明该方法系统误差较小。结果见表1。
2.11 样品含量测定
分别取6个不同批次的五味子合剂各一份，每份精密量取10mL，按“2.3供试品制备方法”制备，按“2.1”项下色谱条件测定五味子醇甲峰面积并计算其含量。结果见表2。
3 讨论
五味子是五味子合剂中的君药，五味子中有效成分的含量直接影响到药品的疗效。2015年版《中国药典》一部将五味子醇甲作为评价五味子质量的指标成分，规定其含有量不低于0.4%[1]。药典中含五味子的中成药中也多采用五味子醇甲含量测定来作为质量控制指标[8-9]。故本实验以五味子醇甲为质量控制指标[10]。在对本品五味子醇甲的分离试验中，考察了甲醇-水为流动相进行测定，目标峰与杂质峰分离不太理想，故改用乙腈-0.5%冰醋酸溶液（60∶40）为流动相，目标峰五味子醇甲与杂质峰分离效果比较理想，且与相邻色谱峰分离度大于1.5。在200～400nm波长范围内进行扫描，结果在218nm和250nm波长处有最大吸收，故以250nm为检测波长，与2015版《中国药典》一部规定一致。该法操作简便快捷，重复性及稳定性良好，结果准确可靠，可作为控制五味子合剂质量的方法。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：66.
[2]方雅靖.五味子临床功效探究[J].中国民族民间医药，2007，18（21）：78.
[3]代晓光，宋琳.五味子现代药理作用及临床应用研究进展[J].中医药信息，2017，34（5）：121-124.
[4]于凤文，刘春梅.中药五味子的研究[J].中国民族民间医药，2007，18（5）：278-280.
[5]贝雷，刘娟，王力，等.野生与栽培北五味子中五味子醇甲的含量测定[J].黑龙江医药科学，2010，2（33）：14-154.
[6]李洪兵.敛肺止汗药五味子的化学成分和药理作用[J].中国民族民间医药，2012，21（14）：57-59.
[7]吴伦，陈晓宇，于浩然，等.五味子醇甲的抗炎免疫作用研究现 [J].代中药研究与实践，2017，31（5）：18-21.
[8]杨劝生，孙亚红，汪霞平.安神宁中五味子甲素含量测定研究[J].中兽医医药杂志，2017，36（1）：31-33.
[9]易延逵，蔡光先，杨永华.HPLC法测定神安颗粒中五味子醇甲含量的研究[J].天然产物研究与开发.2014，26（11）：1815-1818.
[10]吴浩善，张冬月，虞小静，等. HPLC法同时测定不同产地五味子中5种木脂素类成分的含量[J]中国民族民间医药，2018，27（5）：9-13.
∶40），流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为250nm，进样量为10μL，以外标法定量。结果：五味子醇甲在进样量0.128～3.194μg之间与峰面积值呈现良好的线性关系，相关系数r=0.9993，平均回收率为97.70%，RSD为1.6%（n=6）。結论：该法操作简便快捷，重复性及稳定性良好，结果准确可靠，可作为控制五味子合剂质量的方法。
【关键词】 五味子合剂;五味子醇甲;HPLC;含量测定
【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2019）11-0022-03
Determination of Schisandrin A in Wuweizi Mixture by HPLC
QIN Kaiyu1 WU Min1 GAN Yangying2 ZHANG Bei1 LI Junwei1 XIAO Xiuzhen1 ZHANG Zhi1*
1.Liuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guangxi， Liuzhou 545001， China; 2.YuLin Center for Food and Drug Control，Yulin 537000，China
Abstract：Objective To establish a method for the determination of schisandrin A in Wuweizi Mixture.Methods The chromatographic column was Agilent Etlipse XDB-C18 （5μm，4.6×150mm）， the mobile phase was acetonitrile-0.5% glacial acetic acid aqueous solution （60∶40）， the flow rate was 1.0mL. min-1， the column temperature was 30℃， the detection wavelength was 250nm， the injection volume was 10μL， and the external standard method was used for quantitative analysis. Results There was a good linear relationship between schisandrin A and peak area in the range of 0.128～3.194μg. The correlation coefficient r=0.9993， the average recovery rate was 97.70%， and RSD was 1.6%（n=6）.Conclusions The method is simple， rapid， reproducible and stable. The results are accurate and reliable. It can be used as a method to control the quality of Wuweizi Mixture.
Keywords：Wuweizi Mixture ; Schisandrin A ; HPLC ; Determination
五味子合剂是柳州市中医医院的一代老中医的验方，由五味子和黄芪等中药提炼组成。为棕黄色澄明液体，味甜、微酸，具有补气镇静的功效，常用于神经衰弱、失眠、健忘、营养不良等疾病。其中，五味子在该配方中位列君药，起主导作用。五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实，习称北五味子，具有敛肺止咳、固肾纳气;滋养肝肾、强健筋骨;固精止遗、涩肠止泻;生津止渴、益气敛汗;滋肾宁心，调解酒毒的临床功效[1-2]。五味子入药始载于《神农本草经》，列为上品，后在《图经本草》和《名医别录》均有记载和考证，具有极高的药用价值。现代研究表明[3-4]五味子具有增加机体免疫力，清除氧自由基、抑制脂质过氧化，诱导肿瘤细胞凋亡，升高白细胞等药理作用。五味子中所含的木脂素类成分是其主要的有效活性成分，其中以含量较高的五味子醇甲为代表[5-6]，有研究表明[7]五味子醇甲对急性炎症小鼠模型和免疫抑制小鼠模型增强效果显著。鉴于五味子合剂疗效确切、应用广泛，口碑较好，而原质量标准中仅有理化鉴别，无含量测定项，且未见报道以其有效成分五味子醇甲的含量测定为定量控制指标，对其内在质量控制性不足，因此为了提高五味子合剂的质量标准，本实验对五味子合剂中五味子醇甲的含量进行初步研究，建立了五味子合剂中五味子醇甲的HPLC含量测定方法，为评价五味子合剂的质量提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 U3000高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）;Synergy超纯水机（美国Millipore公司）;XS-205Du电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。
1.2 试药 五味子合剂（批号：20170121，柳州中医院制剂室制备）。五味子醇甲对照品（批号：110857-200304，中国药品生物制品检定所）;甲醇（色谱纯，批号：UN1230，默克股份两合公司）、乙腈（色谱纯，批号：UN1648，默克股份两合公司），冰醋酸（优级纯，批号：10000218，国药集团化学试剂有限公司），乙酸乙酯（色谱纯，批号UN1173，默克股份两合公司），水为超纯水。 2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Ag-ilent EtlipseXDB-C18柱（5μm，4.6mm×150mm）;流动相：乙腈-0.5%冰醋酸溶液（60∶40）;流速：1.0mL/min;柱温：30℃;检测波长：250nm;进样量为10μL。在此条件下，理论塔板数以五味子醇甲峰计算应不低于5000。
2.2 对照品溶液制备 精密称取五味子醇甲15.97mg，置25mL量瓶中，加适量甲醇超声使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，搖匀，即得。（浓度为0.6388mg/mL）。
2.3 供试品溶液制备 精密量取五味子合剂10mL，用乙酸乙酯萃取两次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10mL量瓶中并定容，过滤，取续滤液，即得。
2.4 阴性对照溶液制备 按处方比例分别称取除五味子以外的其余药味，按制备工艺制备阴性样品，按“2.3供试品制备方法”制备阴性对照溶液。
2.5 干扰实验 分别精密吸取上述五味子醇甲对照品溶液、五味子合剂供试品溶液和阴性对照溶液各10μL，在上述色谱条件下，供试品中五味子醇甲与对照品色谱峰保留时间一致，并与相邻色谱峰分离度大于1.5，阴性无干扰。色谱图如图1所示。
2.6 线性关系考察 分别精密量取上述五味子醇甲对照品溶液（浓度为0.6388mg/mL）0.2、0.5、1、2、5mL定容到10mL，精密吸取10μL，注入高效液相色谱仪，测定五味子醇甲的峰面积，以五味子醇甲的浓度（x）为横坐标，其峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为y=0.426x-0.075，r=0.9993。结果表明五味子醇甲进样量在0.128～3.194μg之间与峰面积值呈现良好的线性关系。
2.7 精密度试验 精密吸取五味子醇甲对照品溶液（浓度为0.6388mg·mL-1）10μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录五味子醇甲图谱及峰面积，结果五味子醇甲平均峰面积值RSD为0.4%。表明该液相色谱仪的精密度良好。
2.8 稳定性试验 精密量取五味子合剂（批号为20170121）10mL，按“2.3供试品制备方法”制备，按“2.1”项下色谱条件，分别于1、2、4、6、12、24h进样，记录图谱及数据并计算其含量，考察五味子合剂供试品溶液的稳定性。结果显示：在24h内五味子醇甲平均含量RSD为1.6%。表明五味子合剂供试品溶液在24h内具有良好的稳定性。
2.9 重复性试验 取同一批五味子合剂6份（批号为20170121），分别精密量取10mL，按“2.3供试品制备方法”制备，按2.1项下色谱条件测定五味子醇甲峰面积并计算其含量，考察方法的重复性。结果五味子醇甲平均含量为0.058mg/mL，RSD为1.8%。表明该方法的重复性良好。
2.10 加样回收试验 取已知含量（含量为0.058mg/mL）的五味子合剂6份，每份精密量取5mL，置分液漏斗中，再加入浓度为0.6388mg/mL的五味子醇甲对照品溶液0.5mL，自“用乙酸乙酯萃取两次”起，按“2.3供试品溶液制备”方法处理，按“2.1”项下色谱条件测定五味子醇甲峰面积并计算回收率，平均回收率为97.70%，RSD为1.6%，表明该方法系统误差较小。结果见表1。
2.11 样品含量测定
分别取6个不同批次的五味子合剂各一份，每份精密量取10mL，按“2.3供试品制备方法”制备，按“2.1”项下色谱条件测定五味子醇甲峰面积并计算其含量。结果见表2。
3 讨论
五味子是五味子合剂中的君药，五味子中有效成分的含量直接影响到药品的疗效。2015年版《中国药典》一部将五味子醇甲作为评价五味子质量的指标成分，规定其含有量不低于0.4%[1]。药典中含五味子的中成药中也多采用五味子醇甲含量测定来作为质量控制指标[8-9]。故本实验以五味子醇甲为质量控制指标[10]。在对本品五味子醇甲的分离试验中，考察了甲醇-水为流动相进行测定，目标峰与杂质峰分离不太理想，故改用乙腈-0.5%冰醋酸溶液（60∶40）为流动相，目标峰五味子醇甲与杂质峰分离效果比较理想，且与相邻色谱峰分离度大于1.5。在200～400nm波长范围内进行扫描，结果在218nm和250nm波长处有最大吸收，故以250nm为检测波长，与2015版《中国药典》一部规定一致。该法操作简便快捷，重复性及稳定性良好，结果准确可靠，可作为控制五味子合剂质量的方法。
参考文献
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[8]杨劝生，孙亚红，汪霞平.安神宁中五味子甲素含量测定研究[J].中兽医医药杂志，2017，36（1）：31-33.
[9]易延逵，蔡光先，杨永华.HPLC法测定神安颗粒中五味子醇甲含量的研究[J].天然产物研究与开发.2014，26（11）：1815-1818.
[10]吴浩善，张冬月，虞小静，等. HPLC法同时测定不同产地五味子中5种木脂素类成分的含量[J]中国民族民间医药，2018，27（5）：9-13.