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[摘要]透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是人体组织成分之一，广泛存在于人体皮肤、软骨组织、韧带以及眼睛玻璃体中，具有良好的生物相容性、亲水性、粘弹性及低免疫原性。生物工程生产的交联透明质酸钠凝胶具有相似的生物学特性，是目前最常用的注射微整手术填充材料之一。该文首先回顾了注射整形行业的发展历史，同时分析了交联透明质酸钠凝胶在整形行业的应用，包括面部除皱、隆鼻颏、瘢痕修复等部分，重点阐述了整形手术用交联透明质酸钠凝胶质量控制的方法，包括交联剂残留量、透明质酸钠含量、溶胀度、蛋白质含量、重金属含量以及分子量等。结合国内外交联透明质酸钠凝胶的研究动态，提出了今后的发展前景。
[关键词]透明质酸;交联透明质酸钠凝胶;注射整形;质量控制
[中图分类号]R622 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2020）12-0185-05
Research Progress of Quality Control Methods in the Standard of Cross-linked Sodium Hyaluronate Gel for Plastic Surgery
YU Hao1，2，JIANG Ai-li1，LI Min1，2，FU Bu-fang2，WANG Zhao-xu2
（1.Yantai University， Yantai 264000，Shandong，China;2.National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 102629，China）
Abstract：Hyaluronic acid （HA） is one of the components of human tissues. It is widely present in human skin， cartilage tissues， ligaments， and vitreous eyes.It has good biocompatibility，hydrophilicity， viscoelasticity，and low immunogenicity.The cross-linked sodium hyaluronate gel produced by bioengineering has similar biological characteristics and is currently one of the most commonly used filling materials for injection microsurgery.This article first reviews the development history of the injection plastic surgery industry，and analyzes the application of cross-linked sodium hyaluronate gel in the plastic surgery industry， including facial wrinkle removal， rhinoplasty， scar repair and other parts， focusing on the use of plastic surgery The method of quality control of sodium hyaluronate gel includes the residual amount of crosslinking agent， sodium hyaluronate content， swelling degree， protein content， heavy metal content and molecular weight. Combining the research development of cross-linked sodium hyaluronate gel at home and abroad， the future development prospects are proposed.
Key words：hyaluronic acid;cross-linked sodium hyaluronate gel; injection shaping; quality control
透明質酸（Hyaluronic acid，HA）是由双糖单位重复排列而成的线性高分子直链多糖聚合物，是细胞外基质的重要成分，其分子量可达107Da[1]。由于其高度粘弹性、保湿性以及生物相容性等优势广泛应用于眼科显微手术、关节炎治疗、药物释放及组织工程等生物材料领域[2]。为赋予HA更强的流变学性能及其抗酶解能力对其进行改性，HA分子中功能羟基、羧基、N-乙酰氨基以及还原末端是可被化学修饰的四个部位。其中，在已报道文献中最常见的是对羟基和羧基的交联[3]，常见的交联方式包括席夫碱反应、硫醇修饰HA以及酶催化交联HA等[4]。如今，注射整形行业快速发展，利用生物材料来修复老化皮肤是皮肤科和整形外科的常用方法，首选材料即是HA的化学交联衍生物。较低浓度的交联透明质酸即可吸水膨胀，在压力的作用下，交联透明质酸钠凝胶流动性以及注射器内推挤力都符合注射填充材料的要求[5]。
自美国食品药品监督管理局（FDA）于2003年12月批准HA用于面部除皱以来，HA已逐步成为最常用的皮肤填充材料[6-7]。美国整形外科学会（American Society of Plastic Surgeons，ASPS）汇总得出，2018年在美国进行软组织填充剂注射美容者高达267万，其中以HA作为软组织填充剂占比79%以上[8]。面部填充剂主要作用在皮肤静态皱纹、面部软组织缺陷及其组织轮廓改善。交联透明质酸由三维网络结构支撑，以提供防止透明质酸酶分解的化学屏蔽或活性氧，因此，比未交联的HA在体内存留时间长，临床效果可维持18个月左右，且不良反应发生率较低[9]。除此之外，在组织工程技术修复不规则组织器官缺损的解决方案中，可注射交联透明质酸凝胶的优势是可配合微创手术、创伤面积小、凝胶可流动性强以及可填满整个缺损部位等[10]。通过交联反应拓宽了HA的应用范围，同时也使得新型交联产品的应用价值大幅度提升。
1 注射整形发展历史
最早的填充注射微整出现在1893年，面部填充材料选择自体脂肪。优势是具有较好的生物相容性、稳定性以及多功能性;劣势是脂肪的分离纯化以及融入宿主组织等技术完全依靠医生的手法，因此难以得到推广[11]。
20世纪初，注射微整行业取得了首次突破性进展，报道出现在维也纳，采用人工合成材料-液体石蜡作为填充注射剂，优势是来源广泛，原材料易得;劣势是生物相容性差，患者开始出现严重的异物和肉芽肿反应，致使公众对注射整形业的强烈不满[12]。20世纪60年代，面部注射硅油以及合成聚四氟乙烯糊状注射剂又相继出现，在美国、德国以及日本广为流行，但同样因为材料的生物相容性差，造成严重的延迟并发症被FDA否定[13]。
1981年，FDA批准用于化妆品的第一个注射用填充剂—牛胶原蛋白，成为注射微整的新选择，优势是可注射性好，淡化细纹的能力高，劣势是蛋白含量较高，机体易产生抗原反应，出现过敏症状[14]。直到21世纪早期，HA凭借具有独特的理化性质、生理功能以及良好的生物相容性，逐步在整形美容行业得到广泛应用。
2 HA在整形手术行业的应用
交联透明质酸钠凝胶可有效矫正鼻唇沟，填补额头、眼周、口周等部位的皱纹，还可矫正泪沟畸形，丰唇、丰耳垂等[15]。复数黏度和弹性模量较大的HA，植入后向组织内扩散较少，且受面部肌肉运动时的外力影响较小，适用于鼻唇沟褶皱、木偶纹等方面的应用[16];弹性模量较小的HA更柔软，适用于浅表皱纹等美容中应用[17];而复数黏度较小的产品，如：Belotero Balance，则具有良好的分散性，在皮下植入后能够分布均匀，因此，适用于较薄的萎缩皮肤区域[18]。HA也可与肉毒毒素、富血小板血浆及二氧化碳等联合注射治疗改善面部老化[19]。周卫等[20]证明含有三七成分的HA水凝胶能够明显抑制家兔硬膜外瘢痕中环氧化酶-2、转化生长因子β1及其结缔组织生长因子的表达，推测该凝胶能够抑制纤维化瘢痕形成过程中的炎症反应且可以降低瘢痕硬度。近年来，由于部分整形机构资历不足或是操作技术有限，容易出现注射失误后的并发症，前期高压氧治疗已逐渐成为HA注射隆鼻术后并发症的辅助治疗，起到减轻炎症、减小瘀斑面积和促进组织愈合的作用[21]。
3 质量控制方法研究进展
3.1 交联剂残留量的测定：经过近些年的市场整合，交联透明质酸钠凝胶技术已趋于平稳和雷同。交联后的产品能增强其结构强度及抗降解能力，从而延长在体内的维持时间[22]。从交联剂选择层面来讲，主要采用二乙烯基砜（DVS）和1，4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE），后者占据比例较大。用BDDE交联修饰后的HA相对DVS具有毒性较低、反应性佳等优势，逐渐取代DVS作为交联透明质酸的主要交联剂。然而，交联剂化学性质活泼，单体有致突变和致癌的潜在风险，因此在践行转化医学中，为保证临床应用的安全性，有必要对交联透明质酸钠凝胶中的交联剂残留量进行严格监控。现行行业标准YY/T 0962-2014版《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中规定交联剂残留量不得大于2μg/g。
葛翠兰等[23]采用高效液相色谱法对DVS-HA凝胶产品的交联剂残留量进行测定，测定含量低于最低检测限60ng/g，根据方法学验证，实验结果可靠，但前期样品处理较繁琐。张治云等[24]对交联透明质酸钠细胞支架材料中交联剂残留量进行测定，将支架材料剪碎后加适量水使其充分溶胀成凝胶，再加乙醇，使交联透明质酸钠凝胶形成均匀絮状沉淀，可充分提取游离的BDDE，本试验通过色谱条件优化，采用不分流模式，溶液直接进样，定量限为0.104μg/ml，方法的检测线、灵敏度都达到相应要求。冯梅等[25]采用气相色谱法，得到定量限为1.85μg/ml，灵敏度和线性相关性均较差，对比后认为荧光分光光度法简单准确，灵敏度高，更适用于交联透明质酸凝胶的质量控制。魏长征等[26]采用气相色谱法考察BDDE的热稳定性，同时利用荧光分光光度法测定交联透明质酸钠凝胶中BDDE的残留量。通过分析荧光法检测BDDE残留量的影响因素（透明质酸酶及BDDE稳定性）进而改良荧光法，即将透明质酸酶添加到 BDDE 标准溶液中，实测值减去标底值得到交联剂的含量。改良后的荧光法特异性更强，即尼克酰胺特异性地与环氧化合物中的三元环发生反应生成具有荧光吸收的有色物质，且对应颜色的深浅与环氧化合物的含量成线性相关，由此避免了测定过程中高温对交联剂含量的干扰作用，具有更高的准确度、灵敏度，能够更好地控制产品的生物安全性。
3.2 透明质酸钠含量的测定：无论何种来源，HA均由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖按1：1的摩爾比组成，可根据其中葡萄糖醛酸或者氨基葡萄糖的含量来计算HA的含量[27]。张莉等[28]采用高效凝胶色谱法同时测定眼用粘弹剂中透明质酸钠和硫酸软骨素钠的含量，通过凝胶渗透色谱与多角度激光光散射仪联用确定透明质酸钠和硫酸软骨素的分子量，使用亲水性凝胶色谱柱和示差折光检测器，排除其他成分干扰，实现复杂样品中两活性成分的测定，该方法简单易控，准确度高，可用于眼用黏弹剂活性成分的质量控制。微生物来源的透明质酸酶可将HA特异性降解为不饱和双糖（ΔDiHA），陈玉娟等[29]通过测定供试品中的ΔDiHA得到透明质酸钠的含量，酶解法结合高效液相色谱法测定具有干扰因素少且检测结果较为可靠的优势，但劣势是操作步骤较为繁琐。Chen等[30]采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）浊度法对发酵液中透明质酸钠含量进行测定，透明质酸钠与CTAB等阳离子表面活性剂产生络合反应，且在一定浓度范围内遵循朗伯-比尔定律，该方法准确度较高，然而缺点是实时检测难度高。李敏等[31]采用改良咔唑法测定重组人溶菌酶滴眼液中透明质酸钠的含量。对显色条件进行优化，确定硼砂-硫酸加入量为5ml，水解温度为100℃，显色加热时间为20min，咔唑-乙醇溶液用量为0.2ml，显色后用冰水浴迅速冷却代替自然冷却的方法，获得了最佳的测定条件。汤祥忠等[32]采用紫外-可见分光光度法测定高吸水性止血材料中透明质酸钠含量，将样品充分溶解于水中，过滤后取滤液，分别加四硼酸钠硫酸溶液和咔唑乙醇溶液，采用紫外-可见分光光度法，在600nm波长处测定吸光度，以葡萄糖醛酸的浓度对相应的吸光度计算回归方程，通过测定葡萄糖醛酸的含量间接确定透明质酸钠的含量。与对温度要求较高的阿利新蓝染料法、检测条件严苛的高效液相色谱法、价格昂贵且耗时较长的定量试剂盒法相比，改良咔唑法条件限定较少、显色速度快、准确度高。该方法适合含葡萄糖醛酸分子在酸性条件下水解的多糖类化合物，欧洲药典以及国家药品标准中都采用此种方法作为含量检测的法定方法，适合作为整形手术用交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠含量测定的方法。 3.3 溶胀度的测定：凝胶的溶胀度比率是指凝胶吸水膨胀后与吸水前的比重，它是决定HA颗粒降解的主要因素，溶胀比与凝胶的颗粒结构有关。张?等[33]将制备的水凝胶凝固成胶体后，称其质量，将凝胶保持在37℃恒温PBS水浴溶液中，放置过夜，使其自然溶胀，从PBS溶液中取出水凝胶，用滤纸吸去表面液体，并再次称其质量，以凝胶溶胀的重量与凝固成胶体的凝胶质量之比作为溶胀比。Shimojo等[34]采用二乙烯基砜作为交联剂制备的交联透明质酸钠凝胶，溶胀比为HA/DVS微粒的溶胀重量与凝胶干重的比。James等[35]通过测定原样品水凝胶的质量与在F12培养基中浸泡24h（平衡）后样品的干燥水凝胶之比确定溶胀度。在凝胶浓度一定的情况下，溶胀度的大小虽然不能准确得到交联修饰度的数值，但能一定程度反映交联修饰度[36]。
3.4 蛋白质含量的测定：透明质酸钠中常见杂质包括蛋白质、核酸及硫酸软骨素等，少量杂质并不影响其在成品中的作用，但是原料中若含有较多的蛋白质（1%），会引起机体产生抗原反应，易出现致敏症状[37]。因此，需要对其进行研究并严格控制终产品中的蛋白残留量。蛋白质测定方法较多，常见的包括凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、福林酚法以及考马斯亮蓝法等[38-39]。
1976年，Bradford利用考马斯亮蓝与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物的原理，确定了定量检测微量蛋白浓度的考马斯亮蓝法[30]。林玉珍[40]对测定透明质酸钠中作为杂质的蛋白含量测定方法进行研究，对比分析了考马斯亮蓝法和福林酚法的检测结果和理论机制，得出福林酚法在检测过程中会受到多肽的干扰，HA样品中存在除蛋白以外的多肽类杂质，检测过程中也会和福林酚发生反应，致使测定结果不可靠;而考马斯亮蓝法灵敏度高、准确度高且操作简便，测定蛋白质的回收率接近100%，且通过本结果还证实HA对考马斯蓝法不存在干扰，更适合作为整形手术用交联透明质酸钠凝胶中蛋白含量测定的方法。研究表明，福林酚法主要适用于蛋白质为主要成分的供试品，而考马斯蓝法则适用于蛋白质为少量成分的供试品[41]。赵卓等[42-43]在实验操作过程中，模拟不同条件的光源，得出考马斯亮蓝分子结构对光照敏感，光照强烈会使显色剂吸收光谱发生改变，造成检测结果出现较大波动，因此，需采用棕色试剂瓶且避光测定。同时，研究证明在1～100mg/ml蛋白质浓度测定范围内，室温20℃、孵育20～30min时测定蛋白含量较为稳定，并且蛋白浓度越高，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度过程中抵御各类外在干扰因素的能力越强。考马斯亮蓝法蛋白质与染料结合后产生的复合物颜色稳定，消光系数高，操作简便且对仪器要求单一[44]。然而该方法操作过程中需要严格注意一些细节，否则直接影响测定结果，例如：考马斯亮蓝G250与石英比色皿（成分：二氧化硅）会产生强烈的结合，因此，本实验需使用玻璃或塑料比色皿[45]。
3.5 重金属的测定：重金属通常是指在一定条件下能与硫代乙酰胺或者硫化钠作用而显色的金属杂质，它也是交联透明质酸钠凝胶中必须严格控制的杂质之一。人体中重金属含量若积累到一定程度，轻则头晕恶心，重则神经系统紊乱，甚至有致癌的可能。铅是重金属中毒性较大的，容易在体内积蓄中毒，且在制剂生产过程中接触机会较多，因此，质量标准中对重金属检测时以铅的含量为代表加以控制。曲建全[46]采用重金属限度检查法，以硫代乙酰胺试液作为显色剂，首先将透明质酸钠供试品灼烧破坏，然后取其炽灼残液，经过一定的处理后在酸性溶液中进行显色。该方法为《中华人民共和国药典》2015年版四部中重金属检查法第二种方法，利用重金属杂质与硫代乙酰胺试液反应生成有色的硫化物，与一定量的标准硝酸铅溶液经同法处理后所显颜色进行比较，为半定量检测方法[47]。测定过程中炽灼残渣加入硝酸处理后，必须将其蒸干，直至氧化氮蒸气除尽为止，否则会使硫代乙酰胺水解生成硫化氢，影响测定结果。
3.6 分子量的测定：分子量是表征HA最基本的特征之一，因HA双糖单位数量不一，造成分子链长短有一定差异，所以其分子量的大小有所不同。不同分子量HA的物化性质也有一定差别，决定了其在化妆品、保健、医疗行业的应用范畴。HA是一种非均一的物质，各种方法测定的分子量值都为平均相对分子量。方法包括特性黏度法、高效凝胶渗透色谱法、光散射法及超速离心法等。特性粘度法可以合理预估非纯品HA的分子量，广泛应用于HA纯品的分子量测定[48-49]。Karlsson等[50]选择梯度洗脱的方式，利用阴离子交换色谱法，测定HA的峰值分子量，且对其分子量分布进行分析，设置UV检测波长为210nm，研究得出，在分子量0.1×106～5×106范圍内，HA峰值分子量精密度良好，分子量分布较为合理。然而该方法易受杂质干扰，对纯度要求高。秦东等[51]选择近红外漫反射光谱法测定HA分子量，采用最小二乘法回归多元校正法对46个HA粉体样品在近红外光谱选定区域进行了分析，相关参数以及卡方检验得到的近红外光谱重复性都在允许误差范围内，认为该方法快速测定HA分子量可行。刘莉莉等[52]采用多角度激光光散射仪与体积排阻色谱法联用（MALLS-GPC）为绝对表征提供了新思路，由于光散射测量不依附于泵速分子构象或聚合物标准，可直接获得绝对分子量及相应数据，适用于整形手术用交联透明质酸钠凝胶产品的表征。
4 展望
早期的面部除皱手术以切除松弛皮肤为主要内容，随着面部解剖层研究的发展，面部除皱从皮肤逐渐深入到SMAS、脂肪组织以及骨膜等部分，人们逐渐了解到面部衰老不仅是皮肤软组织的松弛，也是容量的缺失，需要外源填充剂的注射以延缓衰老造成的皱纹和面部凹陷[53]。常见的面部填充剂包括HA、左旋聚乳酸以及胶原蛋白等。
HA在改性、复合方面的研究层出不穷，为美容整形行业提供各类特征、适合不同临床需求的产品，由此决定了此类HA衍生物在医学领域中应用的广泛性。然而整形手术用交联透明质酸钠凝胶产品的应用仍旧处于一个初步开发阶段，交联产物的性质仍需进一步研究，产品制剂中交联剂的剂量、毒性以及其他成分的添加量也需进行有效的质量控制，从而推动整形行业的不断发展。通过化学修饰/交联得到的凝胶在机械性能和抗降解能力方面都有所提升，对于注射整形持久性和创伤愈合等方面的应用提供了保障，未来技术革新所探究的新的交联方式将以简易性、可控性和智能性逐步取代传统的交联方式，应用范畴也会相继扩大。同时由于中国化妆品行业起步较晚，部分原料仍依靠进口，因此，开发高效、安全无毒、具有新型功能的HA衍生物成为中国化妆品行业发展进程中亟待解决的难题之一。 （致谢：衷心感谢蒙一纯博士在本综述撰写期间给予得细致指导与精心点拨！）
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[收稿日期]2020-03-02
本文引用格式： 于浩，姜愛莉，李敏，等.《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》标准中质量控制方法的研究进展[J].中国美容医学，2020，29（12）：185-189.
[关键词]透明质酸;交联透明质酸钠凝胶;注射整形;质量控制
[中图分类号]R622 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2020）12-0185-05
Research Progress of Quality Control Methods in the Standard of Cross-linked Sodium Hyaluronate Gel for Plastic Surgery
YU Hao1，2，JIANG Ai-li1，LI Min1，2，FU Bu-fang2，WANG Zhao-xu2
（1.Yantai University， Yantai 264000，Shandong，China;2.National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 102629，China）
Abstract：Hyaluronic acid （HA） is one of the components of human tissues. It is widely present in human skin， cartilage tissues， ligaments， and vitreous eyes.It has good biocompatibility，hydrophilicity， viscoelasticity，and low immunogenicity.The cross-linked sodium hyaluronate gel produced by bioengineering has similar biological characteristics and is currently one of the most commonly used filling materials for injection microsurgery.This article first reviews the development history of the injection plastic surgery industry，and analyzes the application of cross-linked sodium hyaluronate gel in the plastic surgery industry， including facial wrinkle removal， rhinoplasty， scar repair and other parts， focusing on the use of plastic surgery The method of quality control of sodium hyaluronate gel includes the residual amount of crosslinking agent， sodium hyaluronate content， swelling degree， protein content， heavy metal content and molecular weight. Combining the research development of cross-linked sodium hyaluronate gel at home and abroad， the future development prospects are proposed.
Key words：hyaluronic acid;cross-linked sodium hyaluronate gel; injection shaping; quality control
透明質酸（Hyaluronic acid，HA）是由双糖单位重复排列而成的线性高分子直链多糖聚合物，是细胞外基质的重要成分，其分子量可达107Da[1]。由于其高度粘弹性、保湿性以及生物相容性等优势广泛应用于眼科显微手术、关节炎治疗、药物释放及组织工程等生物材料领域[2]。为赋予HA更强的流变学性能及其抗酶解能力对其进行改性，HA分子中功能羟基、羧基、N-乙酰氨基以及还原末端是可被化学修饰的四个部位。其中，在已报道文献中最常见的是对羟基和羧基的交联[3]，常见的交联方式包括席夫碱反应、硫醇修饰HA以及酶催化交联HA等[4]。如今，注射整形行业快速发展，利用生物材料来修复老化皮肤是皮肤科和整形外科的常用方法，首选材料即是HA的化学交联衍生物。较低浓度的交联透明质酸即可吸水膨胀，在压力的作用下，交联透明质酸钠凝胶流动性以及注射器内推挤力都符合注射填充材料的要求[5]。
自美国食品药品监督管理局（FDA）于2003年12月批准HA用于面部除皱以来，HA已逐步成为最常用的皮肤填充材料[6-7]。美国整形外科学会（American Society of Plastic Surgeons，ASPS）汇总得出，2018年在美国进行软组织填充剂注射美容者高达267万，其中以HA作为软组织填充剂占比79%以上[8]。面部填充剂主要作用在皮肤静态皱纹、面部软组织缺陷及其组织轮廓改善。交联透明质酸由三维网络结构支撑，以提供防止透明质酸酶分解的化学屏蔽或活性氧，因此，比未交联的HA在体内存留时间长，临床效果可维持18个月左右，且不良反应发生率较低[9]。除此之外，在组织工程技术修复不规则组织器官缺损的解决方案中，可注射交联透明质酸凝胶的优势是可配合微创手术、创伤面积小、凝胶可流动性强以及可填满整个缺损部位等[10]。通过交联反应拓宽了HA的应用范围，同时也使得新型交联产品的应用价值大幅度提升。
1 注射整形发展历史
最早的填充注射微整出现在1893年，面部填充材料选择自体脂肪。优势是具有较好的生物相容性、稳定性以及多功能性;劣势是脂肪的分离纯化以及融入宿主组织等技术完全依靠医生的手法，因此难以得到推广[11]。
20世纪初，注射微整行业取得了首次突破性进展，报道出现在维也纳，采用人工合成材料-液体石蜡作为填充注射剂，优势是来源广泛，原材料易得;劣势是生物相容性差，患者开始出现严重的异物和肉芽肿反应，致使公众对注射整形业的强烈不满[12]。20世纪60年代，面部注射硅油以及合成聚四氟乙烯糊状注射剂又相继出现，在美国、德国以及日本广为流行，但同样因为材料的生物相容性差，造成严重的延迟并发症被FDA否定[13]。
1981年，FDA批准用于化妆品的第一个注射用填充剂—牛胶原蛋白，成为注射微整的新选择，优势是可注射性好，淡化细纹的能力高，劣势是蛋白含量较高，机体易产生抗原反应，出现过敏症状[14]。直到21世纪早期，HA凭借具有独特的理化性质、生理功能以及良好的生物相容性，逐步在整形美容行业得到广泛应用。
2 HA在整形手术行业的应用
交联透明质酸钠凝胶可有效矫正鼻唇沟，填补额头、眼周、口周等部位的皱纹，还可矫正泪沟畸形，丰唇、丰耳垂等[15]。复数黏度和弹性模量较大的HA，植入后向组织内扩散较少，且受面部肌肉运动时的外力影响较小，适用于鼻唇沟褶皱、木偶纹等方面的应用[16];弹性模量较小的HA更柔软，适用于浅表皱纹等美容中应用[17];而复数黏度较小的产品，如：Belotero Balance，则具有良好的分散性，在皮下植入后能够分布均匀，因此，适用于较薄的萎缩皮肤区域[18]。HA也可与肉毒毒素、富血小板血浆及二氧化碳等联合注射治疗改善面部老化[19]。周卫等[20]证明含有三七成分的HA水凝胶能够明显抑制家兔硬膜外瘢痕中环氧化酶-2、转化生长因子β1及其结缔组织生长因子的表达，推测该凝胶能够抑制纤维化瘢痕形成过程中的炎症反应且可以降低瘢痕硬度。近年来，由于部分整形机构资历不足或是操作技术有限，容易出现注射失误后的并发症，前期高压氧治疗已逐渐成为HA注射隆鼻术后并发症的辅助治疗，起到减轻炎症、减小瘀斑面积和促进组织愈合的作用[21]。
3 质量控制方法研究进展
3.1 交联剂残留量的测定：经过近些年的市场整合，交联透明质酸钠凝胶技术已趋于平稳和雷同。交联后的产品能增强其结构强度及抗降解能力，从而延长在体内的维持时间[22]。从交联剂选择层面来讲，主要采用二乙烯基砜（DVS）和1，4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE），后者占据比例较大。用BDDE交联修饰后的HA相对DVS具有毒性较低、反应性佳等优势，逐渐取代DVS作为交联透明质酸的主要交联剂。然而，交联剂化学性质活泼，单体有致突变和致癌的潜在风险，因此在践行转化医学中，为保证临床应用的安全性，有必要对交联透明质酸钠凝胶中的交联剂残留量进行严格监控。现行行业标准YY/T 0962-2014版《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中规定交联剂残留量不得大于2μg/g。
葛翠兰等[23]采用高效液相色谱法对DVS-HA凝胶产品的交联剂残留量进行测定，测定含量低于最低检测限60ng/g，根据方法学验证，实验结果可靠，但前期样品处理较繁琐。张治云等[24]对交联透明质酸钠细胞支架材料中交联剂残留量进行测定，将支架材料剪碎后加适量水使其充分溶胀成凝胶，再加乙醇，使交联透明质酸钠凝胶形成均匀絮状沉淀，可充分提取游离的BDDE，本试验通过色谱条件优化，采用不分流模式，溶液直接进样，定量限为0.104μg/ml，方法的检测线、灵敏度都达到相应要求。冯梅等[25]采用气相色谱法，得到定量限为1.85μg/ml，灵敏度和线性相关性均较差，对比后认为荧光分光光度法简单准确，灵敏度高，更适用于交联透明质酸凝胶的质量控制。魏长征等[26]采用气相色谱法考察BDDE的热稳定性，同时利用荧光分光光度法测定交联透明质酸钠凝胶中BDDE的残留量。通过分析荧光法检测BDDE残留量的影响因素（透明质酸酶及BDDE稳定性）进而改良荧光法，即将透明质酸酶添加到 BDDE 标准溶液中，实测值减去标底值得到交联剂的含量。改良后的荧光法特异性更强，即尼克酰胺特异性地与环氧化合物中的三元环发生反应生成具有荧光吸收的有色物质，且对应颜色的深浅与环氧化合物的含量成线性相关，由此避免了测定过程中高温对交联剂含量的干扰作用，具有更高的准确度、灵敏度，能够更好地控制产品的生物安全性。
3.2 透明质酸钠含量的测定：无论何种来源，HA均由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖按1：1的摩爾比组成，可根据其中葡萄糖醛酸或者氨基葡萄糖的含量来计算HA的含量[27]。张莉等[28]采用高效凝胶色谱法同时测定眼用粘弹剂中透明质酸钠和硫酸软骨素钠的含量，通过凝胶渗透色谱与多角度激光光散射仪联用确定透明质酸钠和硫酸软骨素的分子量，使用亲水性凝胶色谱柱和示差折光检测器，排除其他成分干扰，实现复杂样品中两活性成分的测定，该方法简单易控，准确度高，可用于眼用黏弹剂活性成分的质量控制。微生物来源的透明质酸酶可将HA特异性降解为不饱和双糖（ΔDiHA），陈玉娟等[29]通过测定供试品中的ΔDiHA得到透明质酸钠的含量，酶解法结合高效液相色谱法测定具有干扰因素少且检测结果较为可靠的优势，但劣势是操作步骤较为繁琐。Chen等[30]采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）浊度法对发酵液中透明质酸钠含量进行测定，透明质酸钠与CTAB等阳离子表面活性剂产生络合反应，且在一定浓度范围内遵循朗伯-比尔定律，该方法准确度较高，然而缺点是实时检测难度高。李敏等[31]采用改良咔唑法测定重组人溶菌酶滴眼液中透明质酸钠的含量。对显色条件进行优化，确定硼砂-硫酸加入量为5ml，水解温度为100℃，显色加热时间为20min，咔唑-乙醇溶液用量为0.2ml，显色后用冰水浴迅速冷却代替自然冷却的方法，获得了最佳的测定条件。汤祥忠等[32]采用紫外-可见分光光度法测定高吸水性止血材料中透明质酸钠含量，将样品充分溶解于水中，过滤后取滤液，分别加四硼酸钠硫酸溶液和咔唑乙醇溶液，采用紫外-可见分光光度法，在600nm波长处测定吸光度，以葡萄糖醛酸的浓度对相应的吸光度计算回归方程，通过测定葡萄糖醛酸的含量间接确定透明质酸钠的含量。与对温度要求较高的阿利新蓝染料法、检测条件严苛的高效液相色谱法、价格昂贵且耗时较长的定量试剂盒法相比，改良咔唑法条件限定较少、显色速度快、准确度高。该方法适合含葡萄糖醛酸分子在酸性条件下水解的多糖类化合物，欧洲药典以及国家药品标准中都采用此种方法作为含量检测的法定方法，适合作为整形手术用交联透明质酸钠凝胶中透明质酸钠含量测定的方法。 3.3 溶胀度的测定：凝胶的溶胀度比率是指凝胶吸水膨胀后与吸水前的比重，它是决定HA颗粒降解的主要因素，溶胀比与凝胶的颗粒结构有关。张?等[33]将制备的水凝胶凝固成胶体后，称其质量，将凝胶保持在37℃恒温PBS水浴溶液中，放置过夜，使其自然溶胀，从PBS溶液中取出水凝胶，用滤纸吸去表面液体，并再次称其质量，以凝胶溶胀的重量与凝固成胶体的凝胶质量之比作为溶胀比。Shimojo等[34]采用二乙烯基砜作为交联剂制备的交联透明质酸钠凝胶，溶胀比为HA/DVS微粒的溶胀重量与凝胶干重的比。James等[35]通过测定原样品水凝胶的质量与在F12培养基中浸泡24h（平衡）后样品的干燥水凝胶之比确定溶胀度。在凝胶浓度一定的情况下，溶胀度的大小虽然不能准确得到交联修饰度的数值，但能一定程度反映交联修饰度[36]。
3.4 蛋白质含量的测定：透明质酸钠中常见杂质包括蛋白质、核酸及硫酸软骨素等，少量杂质并不影响其在成品中的作用，但是原料中若含有较多的蛋白质（1%），会引起机体产生抗原反应，易出现致敏症状[37]。因此，需要对其进行研究并严格控制终产品中的蛋白残留量。蛋白质测定方法较多，常见的包括凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、福林酚法以及考马斯亮蓝法等[38-39]。
1976年，Bradford利用考马斯亮蓝与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物的原理，确定了定量检测微量蛋白浓度的考马斯亮蓝法[30]。林玉珍[40]对测定透明质酸钠中作为杂质的蛋白含量测定方法进行研究，对比分析了考马斯亮蓝法和福林酚法的检测结果和理论机制，得出福林酚法在检测过程中会受到多肽的干扰，HA样品中存在除蛋白以外的多肽类杂质，检测过程中也会和福林酚发生反应，致使测定结果不可靠;而考马斯亮蓝法灵敏度高、准确度高且操作简便，测定蛋白质的回收率接近100%，且通过本结果还证实HA对考马斯蓝法不存在干扰，更适合作为整形手术用交联透明质酸钠凝胶中蛋白含量测定的方法。研究表明，福林酚法主要适用于蛋白质为主要成分的供试品，而考马斯蓝法则适用于蛋白质为少量成分的供试品[41]。赵卓等[42-43]在实验操作过程中，模拟不同条件的光源，得出考马斯亮蓝分子结构对光照敏感，光照强烈会使显色剂吸收光谱发生改变，造成检测结果出现较大波动，因此，需采用棕色试剂瓶且避光测定。同时，研究证明在1～100mg/ml蛋白质浓度测定范围内，室温20℃、孵育20～30min时测定蛋白含量较为稳定，并且蛋白浓度越高，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度过程中抵御各类外在干扰因素的能力越强。考马斯亮蓝法蛋白质与染料结合后产生的复合物颜色稳定，消光系数高，操作简便且对仪器要求单一[44]。然而该方法操作过程中需要严格注意一些细节，否则直接影响测定结果，例如：考马斯亮蓝G250与石英比色皿（成分：二氧化硅）会产生强烈的结合，因此，本实验需使用玻璃或塑料比色皿[45]。
3.5 重金属的测定：重金属通常是指在一定条件下能与硫代乙酰胺或者硫化钠作用而显色的金属杂质，它也是交联透明质酸钠凝胶中必须严格控制的杂质之一。人体中重金属含量若积累到一定程度，轻则头晕恶心，重则神经系统紊乱，甚至有致癌的可能。铅是重金属中毒性较大的，容易在体内积蓄中毒，且在制剂生产过程中接触机会较多，因此，质量标准中对重金属检测时以铅的含量为代表加以控制。曲建全[46]采用重金属限度检查法，以硫代乙酰胺试液作为显色剂，首先将透明质酸钠供试品灼烧破坏，然后取其炽灼残液，经过一定的处理后在酸性溶液中进行显色。该方法为《中华人民共和国药典》2015年版四部中重金属检查法第二种方法，利用重金属杂质与硫代乙酰胺试液反应生成有色的硫化物，与一定量的标准硝酸铅溶液经同法处理后所显颜色进行比较，为半定量检测方法[47]。测定过程中炽灼残渣加入硝酸处理后，必须将其蒸干，直至氧化氮蒸气除尽为止，否则会使硫代乙酰胺水解生成硫化氢，影响测定结果。
3.6 分子量的测定：分子量是表征HA最基本的特征之一，因HA双糖单位数量不一，造成分子链长短有一定差异，所以其分子量的大小有所不同。不同分子量HA的物化性质也有一定差别，决定了其在化妆品、保健、医疗行业的应用范畴。HA是一种非均一的物质，各种方法测定的分子量值都为平均相对分子量。方法包括特性黏度法、高效凝胶渗透色谱法、光散射法及超速离心法等。特性粘度法可以合理预估非纯品HA的分子量，广泛应用于HA纯品的分子量测定[48-49]。Karlsson等[50]选择梯度洗脱的方式，利用阴离子交换色谱法，测定HA的峰值分子量，且对其分子量分布进行分析，设置UV检测波长为210nm，研究得出，在分子量0.1×106～5×106范圍内，HA峰值分子量精密度良好，分子量分布较为合理。然而该方法易受杂质干扰，对纯度要求高。秦东等[51]选择近红外漫反射光谱法测定HA分子量，采用最小二乘法回归多元校正法对46个HA粉体样品在近红外光谱选定区域进行了分析，相关参数以及卡方检验得到的近红外光谱重复性都在允许误差范围内，认为该方法快速测定HA分子量可行。刘莉莉等[52]采用多角度激光光散射仪与体积排阻色谱法联用（MALLS-GPC）为绝对表征提供了新思路，由于光散射测量不依附于泵速分子构象或聚合物标准，可直接获得绝对分子量及相应数据，适用于整形手术用交联透明质酸钠凝胶产品的表征。
4 展望
早期的面部除皱手术以切除松弛皮肤为主要内容，随着面部解剖层研究的发展，面部除皱从皮肤逐渐深入到SMAS、脂肪组织以及骨膜等部分，人们逐渐了解到面部衰老不仅是皮肤软组织的松弛，也是容量的缺失，需要外源填充剂的注射以延缓衰老造成的皱纹和面部凹陷[53]。常见的面部填充剂包括HA、左旋聚乳酸以及胶原蛋白等。
HA在改性、复合方面的研究层出不穷，为美容整形行业提供各类特征、适合不同临床需求的产品，由此决定了此类HA衍生物在医学领域中应用的广泛性。然而整形手术用交联透明质酸钠凝胶产品的应用仍旧处于一个初步开发阶段，交联产物的性质仍需进一步研究，产品制剂中交联剂的剂量、毒性以及其他成分的添加量也需进行有效的质量控制，从而推动整形行业的不断发展。通过化学修饰/交联得到的凝胶在机械性能和抗降解能力方面都有所提升，对于注射整形持久性和创伤愈合等方面的应用提供了保障，未来技术革新所探究的新的交联方式将以简易性、可控性和智能性逐步取代传统的交联方式，应用范畴也会相继扩大。同时由于中国化妆品行业起步较晚，部分原料仍依靠进口，因此，开发高效、安全无毒、具有新型功能的HA衍生物成为中国化妆品行业发展进程中亟待解决的难题之一。 （致谢：衷心感谢蒙一纯博士在本综述撰写期间给予得细致指导与精心点拨！）
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[收稿日期]2020-03-02
本文引用格式： 于浩，姜愛莉，李敏，等.《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》标准中质量控制方法的研究进展[J].中国美容医学，2020，29（12）：185-189.