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[摘要] 目的：探讨人视网膜血管内皮细胞的体外分离和选择性培养方法。方法：将人视网膜通过剪碎、匀浆、过筛、胶原酶消化处理后，结合密度梯度离心和物理刮除等分离方法获得较纯的视网膜血管内皮细胞，接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并采用含内皮细胞生长因子和肝素的培养基促进内皮细胞贴壁生长，观察细胞生长状况，并应用免疫组化方法进行鉴定。结果：培养的细胞成典型的铺路石样生长，Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色为阳性，细胞纯度达98%以上。结论：本实验方法简单易行，培养出的人视网膜血管内皮细胞纯度高、生长状态良好，并可稳定传代，为视网膜血管疾病的基础研究提供有效的模型建立方法。
[关键词] 视网膜 微血管 内皮细胞 细胞培养
糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等视网膜疾病均与视网膜血管病理性改变密切相关。随着对视网膜血管性疾病的研究深入，发现视网膜血管内皮细胞是视网膜血管病变过程中的关键细胞。通过体外分离培养视网膜血管内皮细胞获得大量完整、纯度高的内皮细胞，从而对其进行形态、结构、生理功能和病理变化等方面的观察，为视网膜血管性疾病研究提供体外模型。本实验以人视网膜为材料，探索简便、有效的人视网膜微血管内皮细胞的培养与纯化方法。现报告如下：
1 材料与方法
1.1 材料
0.1%Ⅱ型胶原酶（Sigma公司，美国）、胎牛血清(Gibco公司，美国) 、DMEM培养液(Gibco公司，美国)、含0.02%EDTA的0.25%胰酶（Gibco公司，美国）、纤维连接蛋白（Sigma公司，美国）、内皮细胞生长因子ECGF(Sigma公司，美国) 、Percoll分离液（Gibco公司，美国）、肝素（Sigma公司，美国）、PBS（Sigma公司，美国）、培养瓶、培养皿、眼科器械、匀浆器、吸管、离心管、细胞筛、第Ⅷ因子相关抗原抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），完全培养液：DMEM培养液+15%FBS+90μg/mL肝素+0.1μg/L的ECGF，培养瓶：培养前1天用10μg/cm2纤维连接蛋白包被。
1.2 方法
1.2.1人视网膜微血管内皮细胞的分离与原代培养
原代细胞培养使用的眼球为角膜移植后残留的供体眼球。无菌操作，浸入酒精中消毒2遍，转入DMEM培养液中。距角膜缘后3mm穿刺，剪去眼前节，娩出玻璃体，吸取DMEM培养液将视网膜神经层吹起吸出，将视网膜置于DMEM培养液中洗涤2~3次，去除色素组织并夹出较大的血管，再将视网膜转入另一培养皿中剪碎后匀浆，将匀浆液过两层细胞标准筛（先过220μm，后过86μm），将第2层细胞筛翻转后用DMEM培养液充分冲洗，收集洗脱液后离心（1000r/min，10min），弃上清后加入3倍体积的0.1%胶原酶吹打均匀后移入离心管中在37℃200r/min摇床上消化60min，离心（1000r/min，10min），弃上清，用DMEM培养液悬浮细胞，将Percoll分离液加入DMEM培养液中，以20000r/min离心30min制备连续密度梯度，吸取上述细胞悬液2mL小心加入25mL离心管顶层分离介质面上，离心（1000r/min，10min），用注射器针头吸取所需的细胞层(第2层)，以添加ECGF的完全培养液悬浮细胞，接种于包被有10μg/cm2纤维连接蛋白的培养瓶内，将培养瓶置于5%CO2、37℃培养箱内培养细胞。24 h内严禁移动培养瓶。培养2d后首次换液，以后每2d换液1次，2天换液1次，保持ECGF的浓度。换液前相差倒置显微镜下观察视网膜血管内皮细胞，标记杂细胞位置，用细胞刮去除杂细胞。
1.2.2人视网膜微血管内皮细胞的传代培养
当原代细胞融合80％以上后，开始传代培养。吸去培养液，用PBS清洗1～2次；加入0.25%胰蛋白酶与0.02 EDTA混合消化液，室温下消化，在相差显微镜下观察，当铺路石样细胞开始变圆收缩，细胞间隙变大时，倒出消化液；以含15%FBS的完全培养液终止消化，反复吹打瓶壁上细胞，脱壁后形成细胞悬液，按1：2的比例进行传代，接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中。传代后每2～3 d换液1次。
1.2.3人视网膜微血管内皮细胞的鉴定
(1)形态学：在相差倒置显微镜下观察视网膜血管内皮细胞形态特征、生长特性及与微血管碎片的距离，并运用目镜网格器计数法观察记录培养瓶中混杂的其他细胞，每瓶选择3个视野，实验各重复3次。(2)Ⅷ因子相关抗原免疫组化检查：以0.5×105 /•L 的细胞密度接种2mL细胞悬液接种于预先置有20mm×20mm盖玻片的六孔板中，并置于37℃的培养箱中培养24h至细胞爬满玻片后取出，PBS漂洗细胞2次，以4%多聚甲醛固定20min；PBS冲洗3次，免疫细胞化学染色二步法检测Ⅷ因子相关抗原。阴性对照：一抗用PBS代替。显微镜下观察、采集图像。
2 结果
2.1 视网膜血管内皮细胞形态学特点
经过分离纯化后接种于培养瓶的视网膜血管内皮中混杂有许多杂细胞，如红细胞、胶质细胞、周细胞等。24h后可见有血管内皮细胞贴壁，呈扁平梭形；5~7d细胞分裂、克隆样生长，形成细胞集落，呈类圆形、多边形形状；12d左右细胞融合呈铺路石样，单层生长，铺满瓶底，可见接触抑制现象。
2.2 视网膜血管内皮细胞免疫组织化学鉴定
视网膜血管内皮细胞经第Ⅷ因子相关抗原抗体染色，即胞浆中有棕色着色，98%以上细胞呈阳性染色。阴性对照组无着色。
3 讨论
视网膜血管内皮细胞的分离和培养在认识视网膜血管性疾病的病理生理等过程中发挥了重要作用。视网膜微血管内皮的培养由于取材困难，培养的细胞不易纯化，一直是视网膜细胞培养中的难点。
3.1 视网膜微血管内皮细胞的分离
取材过程中，要采用新鲜的人眼，并保证操作过程绝对无菌，尽量去除视网膜上的视网膜色素上皮细胞，并夹除可见的大血管。视网膜微血管段的分离和内皮细胞的获取、纯化作为视网膜血管内皮细胞培养中的关键步骤，对微血管段的分离程度要求较高，因此我们采用剪碎匀浆分离法获得视网膜微血管段。在匀浆器的选择上，注意玻璃杵与管壁应有一定的间隙，匀浆物与匀浆液的比例控制在1:1左右，研磨次数不宜太多，以免微血管段过度破碎。将组织分离后得到的匀浆液进行过滤和离心。用220μm及86μm的细胞筛可分别筛去未分离的血管段组织和一些较大的细胞以及血细胞等比血管内皮细胞小的细胞及一些碎片，得到较为纯净的微血管段。我们采用0.1g/L胶原酶在37℃200r/min摇床上消化60min，能够将视网膜间质消化获得单细胞悬液并保持较好的细胞活性。
3.2 视网膜微血管内皮细胞的贴壁和纯化
我们使用纤维连接蛋白包被的培养瓶能够有效地促进内皮细胞贴壁，同时抑制其他混杂细胞贴壁生长[1]。在培养液的选择上，我们配制了添加有15%FBS、90μg/ml肝素、0.1μg/L ECGF的内皮细胞培养基，形成只利于内皮细胞生长的选择性培养环境，使内皮细胞进一步得到纯化[2]。周细胞与内皮细胞的分离是纯化技术的难点，我们采用密度梯度离心和物理刮除等方法去除周细胞。Percol1分离液是一种外面被聚乙酰胺吡咯烷酮包被的硅胶颗粒，它无毒、无刺激性，对细胞无吸附作用，产生的渗透压很小，因此在全部密度范围保持等张。Percoll在离心过程中会自然形成密度梯度，内皮细胞和周细胞因其密度不同而在分离液中处于不同的层面。从而将提高内皮细胞纯度[3]。原代培养3~5d后，一些混杂的细胞常常分区成片的生长，可以利用内皮细胞呈独特的铺路石样形态单层生长，而周细胞呈长梭状的可重叠生长，在培养瓶底部标记后用细胞刮匙刮除杂细胞，从而获得较纯的内皮细胞[4]。此外，在传代过程中，采用含0.02%EDTA的0.25%胰酶可使周细胞较内皮细胞更先松动，利用该特点可以除去部分周细胞。
综上所述，我们认为使用纤维连接蛋白包被培养瓶及添加肝素和内皮细胞生长因子的培养基，并结合物理刮除、密度梯度离心法等可以成功获得高纯度的视网膜血管内皮细胞，为体外研究视网膜血管相关疾病奠定了基础。
参考文献：
[1] Schor AM,Schor SL.The isolation and colture of endothelial cells and pericytes from the bovine retinal microvasculature: a comparative study with large vessel vascular cells[J]. Microvase Res,1986,32(1):21-38.
[2] Lin C,Mctough R,Aswad B,et al.Hypoxin induces HIF-1,alpha and VEGF expression in chondrosarcoma cells and chondrocytes[J]. J Orthop Res, 2004, 22(4): 1175-1181.
[3] ZhouB,Oka JA,SinghA,et a1.Purificationand subunit characterization of the rat liver endocytic hyaluronan receptor[J]. J Biol Chem,1999,26,274(48):33831-33834．
[4] Bowman PD,Betz AL,Goldstein GW. Primary culture of microvascular endothelial cells from bovine retina:selective growth using fibronectin coated substrate and plasma derived serum[J]. In Vitro,1982,18:626-632.
[关键词] 视网膜 微血管 内皮细胞 细胞培养
糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等视网膜疾病均与视网膜血管病理性改变密切相关。随着对视网膜血管性疾病的研究深入，发现视网膜血管内皮细胞是视网膜血管病变过程中的关键细胞。通过体外分离培养视网膜血管内皮细胞获得大量完整、纯度高的内皮细胞，从而对其进行形态、结构、生理功能和病理变化等方面的观察，为视网膜血管性疾病研究提供体外模型。本实验以人视网膜为材料，探索简便、有效的人视网膜微血管内皮细胞的培养与纯化方法。现报告如下：
1 材料与方法
1.1 材料
0.1%Ⅱ型胶原酶（Sigma公司，美国）、胎牛血清(Gibco公司，美国) 、DMEM培养液(Gibco公司，美国)、含0.02%EDTA的0.25%胰酶（Gibco公司，美国）、纤维连接蛋白（Sigma公司，美国）、内皮细胞生长因子ECGF(Sigma公司，美国) 、Percoll分离液（Gibco公司，美国）、肝素（Sigma公司，美国）、PBS（Sigma公司，美国）、培养瓶、培养皿、眼科器械、匀浆器、吸管、离心管、细胞筛、第Ⅷ因子相关抗原抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），完全培养液：DMEM培养液+15%FBS+90μg/mL肝素+0.1μg/L的ECGF，培养瓶：培养前1天用10μg/cm2纤维连接蛋白包被。
1.2 方法
1.2.1人视网膜微血管内皮细胞的分离与原代培养
原代细胞培养使用的眼球为角膜移植后残留的供体眼球。无菌操作，浸入酒精中消毒2遍，转入DMEM培养液中。距角膜缘后3mm穿刺，剪去眼前节，娩出玻璃体，吸取DMEM培养液将视网膜神经层吹起吸出，将视网膜置于DMEM培养液中洗涤2~3次，去除色素组织并夹出较大的血管，再将视网膜转入另一培养皿中剪碎后匀浆，将匀浆液过两层细胞标准筛（先过220μm，后过86μm），将第2层细胞筛翻转后用DMEM培养液充分冲洗，收集洗脱液后离心（1000r/min，10min），弃上清后加入3倍体积的0.1%胶原酶吹打均匀后移入离心管中在37℃200r/min摇床上消化60min，离心（1000r/min，10min），弃上清，用DMEM培养液悬浮细胞，将Percoll分离液加入DMEM培养液中，以20000r/min离心30min制备连续密度梯度，吸取上述细胞悬液2mL小心加入25mL离心管顶层分离介质面上，离心（1000r/min，10min），用注射器针头吸取所需的细胞层(第2层)，以添加ECGF的完全培养液悬浮细胞，接种于包被有10μg/cm2纤维连接蛋白的培养瓶内，将培养瓶置于5%CO2、37℃培养箱内培养细胞。24 h内严禁移动培养瓶。培养2d后首次换液，以后每2d换液1次，2天换液1次，保持ECGF的浓度。换液前相差倒置显微镜下观察视网膜血管内皮细胞，标记杂细胞位置，用细胞刮去除杂细胞。
1.2.2人视网膜微血管内皮细胞的传代培养
当原代细胞融合80％以上后，开始传代培养。吸去培养液，用PBS清洗1～2次；加入0.25%胰蛋白酶与0.02 EDTA混合消化液，室温下消化，在相差显微镜下观察，当铺路石样细胞开始变圆收缩，细胞间隙变大时，倒出消化液；以含15%FBS的完全培养液终止消化，反复吹打瓶壁上细胞，脱壁后形成细胞悬液，按1：2的比例进行传代，接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中。传代后每2～3 d换液1次。
1.2.3人视网膜微血管内皮细胞的鉴定
(1)形态学：在相差倒置显微镜下观察视网膜血管内皮细胞形态特征、生长特性及与微血管碎片的距离，并运用目镜网格器计数法观察记录培养瓶中混杂的其他细胞，每瓶选择3个视野，实验各重复3次。(2)Ⅷ因子相关抗原免疫组化检查：以0.5×105 /•L 的细胞密度接种2mL细胞悬液接种于预先置有20mm×20mm盖玻片的六孔板中，并置于37℃的培养箱中培养24h至细胞爬满玻片后取出，PBS漂洗细胞2次，以4%多聚甲醛固定20min；PBS冲洗3次，免疫细胞化学染色二步法检测Ⅷ因子相关抗原。阴性对照：一抗用PBS代替。显微镜下观察、采集图像。
2 结果
2.1 视网膜血管内皮细胞形态学特点
经过分离纯化后接种于培养瓶的视网膜血管内皮中混杂有许多杂细胞，如红细胞、胶质细胞、周细胞等。24h后可见有血管内皮细胞贴壁，呈扁平梭形；5~7d细胞分裂、克隆样生长，形成细胞集落，呈类圆形、多边形形状；12d左右细胞融合呈铺路石样，单层生长，铺满瓶底，可见接触抑制现象。
2.2 视网膜血管内皮细胞免疫组织化学鉴定
视网膜血管内皮细胞经第Ⅷ因子相关抗原抗体染色，即胞浆中有棕色着色，98%以上细胞呈阳性染色。阴性对照组无着色。
3 讨论
视网膜血管内皮细胞的分离和培养在认识视网膜血管性疾病的病理生理等过程中发挥了重要作用。视网膜微血管内皮的培养由于取材困难，培养的细胞不易纯化，一直是视网膜细胞培养中的难点。
3.1 视网膜微血管内皮细胞的分离
取材过程中，要采用新鲜的人眼，并保证操作过程绝对无菌，尽量去除视网膜上的视网膜色素上皮细胞，并夹除可见的大血管。视网膜微血管段的分离和内皮细胞的获取、纯化作为视网膜血管内皮细胞培养中的关键步骤，对微血管段的分离程度要求较高，因此我们采用剪碎匀浆分离法获得视网膜微血管段。在匀浆器的选择上，注意玻璃杵与管壁应有一定的间隙，匀浆物与匀浆液的比例控制在1:1左右，研磨次数不宜太多，以免微血管段过度破碎。将组织分离后得到的匀浆液进行过滤和离心。用220μm及86μm的细胞筛可分别筛去未分离的血管段组织和一些较大的细胞以及血细胞等比血管内皮细胞小的细胞及一些碎片，得到较为纯净的微血管段。我们采用0.1g/L胶原酶在37℃200r/min摇床上消化60min，能够将视网膜间质消化获得单细胞悬液并保持较好的细胞活性。
3.2 视网膜微血管内皮细胞的贴壁和纯化
我们使用纤维连接蛋白包被的培养瓶能够有效地促进内皮细胞贴壁，同时抑制其他混杂细胞贴壁生长[1]。在培养液的选择上，我们配制了添加有15%FBS、90μg/ml肝素、0.1μg/L ECGF的内皮细胞培养基，形成只利于内皮细胞生长的选择性培养环境，使内皮细胞进一步得到纯化[2]。周细胞与内皮细胞的分离是纯化技术的难点，我们采用密度梯度离心和物理刮除等方法去除周细胞。Percol1分离液是一种外面被聚乙酰胺吡咯烷酮包被的硅胶颗粒，它无毒、无刺激性，对细胞无吸附作用，产生的渗透压很小，因此在全部密度范围保持等张。Percoll在离心过程中会自然形成密度梯度，内皮细胞和周细胞因其密度不同而在分离液中处于不同的层面。从而将提高内皮细胞纯度[3]。原代培养3~5d后，一些混杂的细胞常常分区成片的生长，可以利用内皮细胞呈独特的铺路石样形态单层生长，而周细胞呈长梭状的可重叠生长，在培养瓶底部标记后用细胞刮匙刮除杂细胞，从而获得较纯的内皮细胞[4]。此外，在传代过程中，采用含0.02%EDTA的0.25%胰酶可使周细胞较内皮细胞更先松动，利用该特点可以除去部分周细胞。
综上所述，我们认为使用纤维连接蛋白包被培养瓶及添加肝素和内皮细胞生长因子的培养基，并结合物理刮除、密度梯度离心法等可以成功获得高纯度的视网膜血管内皮细胞，为体外研究视网膜血管相关疾病奠定了基础。
参考文献：
[1] Schor AM,Schor SL.The isolation and colture of endothelial cells and pericytes from the bovine retinal microvasculature: a comparative study with large vessel vascular cells[J]. Microvase Res,1986,32(1):21-38.
[2] Lin C,Mctough R,Aswad B,et al.Hypoxin induces HIF-1,alpha and VEGF expression in chondrosarcoma cells and chondrocytes[J]. J Orthop Res, 2004, 22(4): 1175-1181.
[3] ZhouB,Oka JA,SinghA,et a1.Purificationand subunit characterization of the rat liver endocytic hyaluronan receptor[J]. J Biol Chem,1999,26,274(48):33831-33834．
[4] Bowman PD,Betz AL,Goldstein GW. Primary culture of microvascular endothelial cells from bovine retina:selective growth using fibronectin coated substrate and plasma derived serum[J]. In Vitro,1982,18:626-632.