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摘要[目的] 优化番红花球茎消毒和褐化抑制的方法。[方法] 以番红花球茎的染菌率、褐化率和愈伤组织诱导率为指标，分析了外植体大小、氯化汞浓度和消毒时间对番红花球茎染菌和诱导的影响，同时比较了抗坏血酸和活性炭对番红花球茎褐化的抑制效果。[结果] 当外植体大小5 mm3，氯化汞溶液浓度0.2%、消毒时间10 min时，染菌率和诱导率较为适宜；向培养基中加入0.5 g/L活性炭可以降低球茎的褐化。[结论]该研究建立了番红花球茎消毒和褐化抑制方法，为野外番红花球茎的初代组培提供了理论依据。
关键词番红花；球茎；消毒；褐化
中图分类号S504.3文献标识码A文章编号0517-6611（2016）30-0108-02
番红花（Crocus sativusl L.）为鸢尾科番红花属多年生草本植物，又名藏红花、西红花，原产于西班牙、希腊、南欧以及伊朗等地，经印度传入我国，目前我国江浙和华北地区均有栽培[1]。番红花可作为调味剂、香料和染料，其花柱中富含藏红花酸（crocetin）和藏红花素（crocin）等活性成分，具有活血化瘀、舒经理络、消肿止痛等功效，在我国传统和现代医药中具有广泛的应用[2]。
番红花的种植主要依靠球茎进行无性繁殖，多次分球种植后，球茎中积累了大量的病毒和微生物，极大地影响作物的产量和质量[3]。为了解决此问题，研究者以番红花球茎为外植体进行组织培养，诱导愈伤组织和丛生芽[4-6]。在实际工作中，野外来源球茎外植体的高染菌率和褐化是妨碍球茎组培顺利进行的2个棘手问题。笔者以染菌率、褐化率和愈伤组织诱导率作为评价标准，分析了不同因素对番红花球茎组培中染菌及褐化的影响，以期寻求一种有效地抑制番红花球茎染菌和褐化的方法。
1材料与方法
1.1试剂和材料
2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和6-苄胺基腺嘌呤（6-BA）购自国药集团；其他化学试剂均为化学纯。番红花球茎购自浙江省湖州市种植基地。
1.2方法
1.2.1球茎的预处理。
去除番红花球茎外的皮膜，用自来水冲洗6 h，去除病斑后，无菌水浸泡10 min，滤纸滤干后置入2 %的次氯酸钠溶液中消毒10 min，无菌水洗涤4～6次，滤纸吸干表面水分，备用。
愈伤组织诱导培养基：MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA[7]。每瓶2个外植体，每个处理40瓶。培养温度为（23±2）℃，光照时间为12 h/d。计算外植体的染菌率、褐化率和愈伤组织诱导率，计算公式：
染菌率=（染菌个数/接种个数）×100%
褐化率=（褐化个数/接种个数）×100%
愈伤组织诱导率=（愈伤组织发生个数/接种个数）×100%
1.2.2染菌的抑制方法。
1.2.2.1外植体大小的影响。
将球茎切成2、5和10 mm3的块状体，置入70%乙醇溶液中10 s，分别用质量浓度0.2%的氯化汞溶液消毒10 min，无菌水洗涤5次，每次5 min，滤纸吸干后接入愈伤组织诱导培养基中，统计染菌率和愈伤组织诱导率。
1.2.2.2氯化汞浓度的影响。
将球茎切成5 mm3的块状体，置入70%乙醇溶液中10 s，分别用质量浓度0.1%、0.2%和0.3%的氯化汞溶液消毒10 min，无菌水洗涤5次，每次5 min，滤纸吸干后接入愈伤组织诱导培养基中，统计染菌率和愈伤组织诱导率。
1.2.2.3消毒时间的影响。
将球茎切成5 mm3的块状体，置入70%乙醇溶液中10 s，分别用质量浓度0.2%氯化汞溶液消毒5、10、15和20 min，无菌水洗涤5次，每次5 min，滤纸吸干后接入愈伤组织诱导培养基中，统计染菌率和愈伤组织诱导率。
1.2.3褐化的抑制方法。
1.2.3.1抗坏血酸的抑制作用。
将球茎切成5 mm3的塊状体，置入70%乙醇溶液中10 s，用质量浓度0.2%氯化汞溶液消毒10 min，无菌水洗涤5次，吸干表面水分，分别用0.5、1.0和2.0 mg/ml的抗坏血酸溶液（无菌水配制）浸泡5、10和15 min，然后接入诱导培养基中。设置空白组，统计外植体的褐化率和愈伤组织诱导率。
1.2.3.2活性炭的抑制作用。
将球茎切成5 mm3的块状体，置入70%乙醇溶液中10 s，用质量浓度0.2%氯化汞溶液消毒10 min，无菌水洗涤5次，吸干表面水分，接入分别加入0、0.5、1.0和2.0 g/L活性炭的诱导培养基中，统计外植体的褐化率和愈伤组织诱导率。
2结果与分析
2.1外植体大小的影响
由图1可知，番红花球茎外植体具有较高的染菌率，且随着外植体体积的增大，球茎外植体染菌率逐渐升高。在第30天时，5 mm3外植体的染菌率为35%，愈伤组织诱导率为40%，优于其他试验组。
2.2氯化汞浓度的影响
由图2可知，氯化汞质量浓度与染菌率呈显著的负相关；当其浓度为0.2%时，球茎的诱导率最高，是较理想的消毒浓度。
2.3消毒时间的影响
由图3可知，利用氯化汞消毒时，消毒时间对染菌率的影响很大。当消毒时间为5 min时，染菌率达60%，进而造成了较低的诱导率。当消毒时间在10 min以上时，染菌率基本保持不变，但诱导率随消毒时间延长呈显著的负相关。因此，采用0.2%的氯化汞溶液对番红花外植体消毒10 min较为合适。
2.4抗坏血酸对褐化的影响
利用抗坏血酸溶液预处理番红花球茎，不同浓度和处理时间下球茎的褐化情况见表1。由表1可知，1.0 mg/mL抗坏血酸溶液浸泡球茎30 min，褐化率和诱导率分别为10.0%和45.0%，显著优于未处理组。 2.5活性炭对褐化的影响
由图4可知，培养基中加入一定量的活性炭可以显著降低褐化的发生，同时促进愈伤组织的发生。
3结论与讨论
球茎是一种节间缩短膨大为球形的肉质地下变态茎，多为植物的无性繁殖器官。由于球茎深植于土壤中，含有大量的病毒和微生物。在利用野外球茎作为外植体进行组培时，有效的消毒方法成为试验成功的关键步骤。外植体消毒多利用一些化学试剂，如氯化汞、次氯酸钠、抗生素和乙醇等。在消除外植体表面微生物时，消毒剂对外植体细胞也具有破坏作用[8]。笔者前期研究发现，乙醇或氯化汞均会破坏原球茎的叶绿体，导致外植体黄化。因此，外植体消毒时要选择合适的消毒剂，同时要控制消毒剂浓度和消毒时间，兼顾染菌率和诱导率。
在植物组培过程中，消毒剂的使用、培养基的组分以及植物自身的特性均会诱导褐化的发生。褐化会降低植物细胞的活力，影响愈伤组织的形成。研究表明，在培養基中添加适量抗坏血酸（0.01～0.20 mg/L）可以降低褐化的发生率[9]。值得注意的是，加入抗坏血酸的培养基进行高压灭菌后，胶凝剂（琼脂）难以凝固。刘真华等[10]研究发现，蝴蝶兰组培过程中，活性炭的添加可以有效控制褐化发生，同时促进外植体的生长，与该研究结果一致。
参考文献
[1] 刘辉辉，毛碧增.藏红花药理作用及组织培养研究进展[J].药物生物技术，2014，21（6）：593-596.
[2] 邓颖，郭志刚，曾兆麟，等.藏红花的药理研究进展[J].中国中药杂志，2002，27（8）：565-568.
[3] 李军，高广春，李白，等.植物组培脱毒技术及其在药用植物藏红花中的应用[J].生物技术通报，2014（7）：44-48.
[4] 陈书安，王晓东，欧阳杰，等.藏红花球茎愈伤组织快速诱导的研究[J].中国药学杂志，2003，38（4）：254-256.
[5] 陈明亮，张丽丽，秦路平，等.藏红花愈伤组织的诱导[J].安徽农业科学，2016，44（3）：123-125.
[6] 汪洋，韩婷，朱昱，等.番红花组织培养及快速繁殖研究[J].中草药，2009，40（5）：807-809.
[7] 袁丽红，陆玉婷，黄晶.藏红花愈伤组织诱导和褐化抑制[J].南京工业大学学报（自然科学版）， 2009，31（6）：22-26.
[8] 刘丽娟，李红梅，刘雪莲.不同处理方法对外植体消毒效果比较研究[J].北方园艺，2009（10）：86-87.
[9] 李丽，张湮帆，何康，等.两种红豆杉植物的愈伤组织培养及褐化抑制[J].复旦学报（自然科学版），2006，45（6）：702-707.
[10] 刘真华，葛红，郭绍霞，等.蝴蝶兰组织培养中的褐化控制研究[J].园艺学报，2005，32（4）：732-734.
关键词番红花；球茎；消毒；褐化
中图分类号S504.3文献标识码A文章编号0517-6611（2016）30-0108-02
番红花（Crocus sativusl L.）为鸢尾科番红花属多年生草本植物，又名藏红花、西红花，原产于西班牙、希腊、南欧以及伊朗等地，经印度传入我国，目前我国江浙和华北地区均有栽培[1]。番红花可作为调味剂、香料和染料，其花柱中富含藏红花酸（crocetin）和藏红花素（crocin）等活性成分，具有活血化瘀、舒经理络、消肿止痛等功效，在我国传统和现代医药中具有广泛的应用[2]。
番红花的种植主要依靠球茎进行无性繁殖，多次分球种植后，球茎中积累了大量的病毒和微生物，极大地影响作物的产量和质量[3]。为了解决此问题，研究者以番红花球茎为外植体进行组织培养，诱导愈伤组织和丛生芽[4-6]。在实际工作中，野外来源球茎外植体的高染菌率和褐化是妨碍球茎组培顺利进行的2个棘手问题。笔者以染菌率、褐化率和愈伤组织诱导率作为评价标准，分析了不同因素对番红花球茎组培中染菌及褐化的影响，以期寻求一种有效地抑制番红花球茎染菌和褐化的方法。
1材料与方法
1.1试剂和材料
2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和6-苄胺基腺嘌呤（6-BA）购自国药集团；其他化学试剂均为化学纯。番红花球茎购自浙江省湖州市种植基地。
1.2方法
1.2.1球茎的预处理。
去除番红花球茎外的皮膜，用自来水冲洗6 h，去除病斑后，无菌水浸泡10 min，滤纸滤干后置入2 %的次氯酸钠溶液中消毒10 min，无菌水洗涤4～6次，滤纸吸干表面水分，备用。
愈伤组织诱导培养基：MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA[7]。每瓶2个外植体，每个处理40瓶。培养温度为（23±2）℃，光照时间为12 h/d。计算外植体的染菌率、褐化率和愈伤组织诱导率，计算公式：
染菌率=（染菌个数/接种个数）×100%
褐化率=（褐化个数/接种个数）×100%
愈伤组织诱导率=（愈伤组织发生个数/接种个数）×100%
1.2.2染菌的抑制方法。
1.2.2.1外植体大小的影响。
将球茎切成2、5和10 mm3的块状体，置入70%乙醇溶液中10 s，分别用质量浓度0.2%的氯化汞溶液消毒10 min，无菌水洗涤5次，每次5 min，滤纸吸干后接入愈伤组织诱导培养基中，统计染菌率和愈伤组织诱导率。
1.2.2.2氯化汞浓度的影响。
将球茎切成5 mm3的块状体，置入70%乙醇溶液中10 s，分别用质量浓度0.1%、0.2%和0.3%的氯化汞溶液消毒10 min，无菌水洗涤5次，每次5 min，滤纸吸干后接入愈伤组织诱导培养基中，统计染菌率和愈伤组织诱导率。
1.2.2.3消毒时间的影响。
将球茎切成5 mm3的块状体，置入70%乙醇溶液中10 s，分别用质量浓度0.2%氯化汞溶液消毒5、10、15和20 min，无菌水洗涤5次，每次5 min，滤纸吸干后接入愈伤组织诱导培养基中，统计染菌率和愈伤组织诱导率。
1.2.3褐化的抑制方法。
1.2.3.1抗坏血酸的抑制作用。
将球茎切成5 mm3的塊状体，置入70%乙醇溶液中10 s，用质量浓度0.2%氯化汞溶液消毒10 min，无菌水洗涤5次，吸干表面水分，分别用0.5、1.0和2.0 mg/ml的抗坏血酸溶液（无菌水配制）浸泡5、10和15 min，然后接入诱导培养基中。设置空白组，统计外植体的褐化率和愈伤组织诱导率。
1.2.3.2活性炭的抑制作用。
将球茎切成5 mm3的块状体，置入70%乙醇溶液中10 s，用质量浓度0.2%氯化汞溶液消毒10 min，无菌水洗涤5次，吸干表面水分，接入分别加入0、0.5、1.0和2.0 g/L活性炭的诱导培养基中，统计外植体的褐化率和愈伤组织诱导率。
2结果与分析
2.1外植体大小的影响
由图1可知，番红花球茎外植体具有较高的染菌率，且随着外植体体积的增大，球茎外植体染菌率逐渐升高。在第30天时，5 mm3外植体的染菌率为35%，愈伤组织诱导率为40%，优于其他试验组。
2.2氯化汞浓度的影响
由图2可知，氯化汞质量浓度与染菌率呈显著的负相关；当其浓度为0.2%时，球茎的诱导率最高，是较理想的消毒浓度。
2.3消毒时间的影响
由图3可知，利用氯化汞消毒时，消毒时间对染菌率的影响很大。当消毒时间为5 min时，染菌率达60%，进而造成了较低的诱导率。当消毒时间在10 min以上时，染菌率基本保持不变，但诱导率随消毒时间延长呈显著的负相关。因此，采用0.2%的氯化汞溶液对番红花外植体消毒10 min较为合适。
2.4抗坏血酸对褐化的影响
利用抗坏血酸溶液预处理番红花球茎，不同浓度和处理时间下球茎的褐化情况见表1。由表1可知，1.0 mg/mL抗坏血酸溶液浸泡球茎30 min，褐化率和诱导率分别为10.0%和45.0%，显著优于未处理组。 2.5活性炭对褐化的影响
由图4可知，培养基中加入一定量的活性炭可以显著降低褐化的发生，同时促进愈伤组织的发生。
3结论与讨论
球茎是一种节间缩短膨大为球形的肉质地下变态茎，多为植物的无性繁殖器官。由于球茎深植于土壤中，含有大量的病毒和微生物。在利用野外球茎作为外植体进行组培时，有效的消毒方法成为试验成功的关键步骤。外植体消毒多利用一些化学试剂，如氯化汞、次氯酸钠、抗生素和乙醇等。在消除外植体表面微生物时，消毒剂对外植体细胞也具有破坏作用[8]。笔者前期研究发现，乙醇或氯化汞均会破坏原球茎的叶绿体，导致外植体黄化。因此，外植体消毒时要选择合适的消毒剂，同时要控制消毒剂浓度和消毒时间，兼顾染菌率和诱导率。
在植物组培过程中，消毒剂的使用、培养基的组分以及植物自身的特性均会诱导褐化的发生。褐化会降低植物细胞的活力，影响愈伤组织的形成。研究表明，在培養基中添加适量抗坏血酸（0.01～0.20 mg/L）可以降低褐化的发生率[9]。值得注意的是，加入抗坏血酸的培养基进行高压灭菌后，胶凝剂（琼脂）难以凝固。刘真华等[10]研究发现，蝴蝶兰组培过程中，活性炭的添加可以有效控制褐化发生，同时促进外植体的生长，与该研究结果一致。
参考文献
[1] 刘辉辉，毛碧增.藏红花药理作用及组织培养研究进展[J].药物生物技术，2014，21（6）：593-596.
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[8] 刘丽娟，李红梅，刘雪莲.不同处理方法对外植体消毒效果比较研究[J].北方园艺，2009（10）：86-87.
[9] 李丽，张湮帆，何康，等.两种红豆杉植物的愈伤组织培养及褐化抑制[J].复旦学报（自然科学版），2006，45（6）：702-707.
[10] 刘真华，葛红，郭绍霞，等.蝴蝶兰组织培养中的褐化控制研究[J].园艺学报，2005，32（4）：732-734.