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摘 要：为快捷准确地测定烟叶中生物碱的含量，本研究通过优化提取条件，建立了测定烟草中烟碱、新烟草碱、假木贼碱和降烟碱的高效液相色谱检测方法。优化后的检测步骤为：干烟叶和5%甲醇的料液比为100 mg/20 mL，在25 ℃下振荡提取30 min，色谱条件：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸钠），流动相B（90%甲醇+10%水，pH 3.8）。烟碱在0.1～50 μg/mL、其余3种在0.005～2 μg/mL的范围内，4种生物碱均具有较好的线性关系（R2>0.99）;烟碱检出限为0.000 65 μg/mL，平均回收率100.79%，RSD 3.11%;新烟草碱检出限0.088 4 μg/mL，平均回收率98.53%，RSD 3.75%;假木贼碱检出限0.034 8 μg/mL，平均回收率98.70%，RSD 3.63%;降烟碱检出限0.150 9 μg/mL，平均回收率101.33%，RSD 4.61%。對4种不同类型烟叶共11个不同样品进行检测验证，检测结果可靠。该方法前处理简单快捷，灵敏度高，重复性较好，可以满足烟草样品中4种生物碱的检测要求。
关键词：烟草;烟碱;新烟草碱;假木贼碱;降烟碱;液相色谱法
Abstract： In order to quickly and accurately determine the content of alkaloids in tobacco leaves， the extraction conditions were optimized， and a method for the determination of nicotine， anatabine， anabasine and nornicotine contents in tobacco by HPLC was established. The optimized detection steps are as follows： 100 mg/20 mL solid-liquid ratio， 5% methanol was extracted by oscillation at 25 ℃ for 30 min， the chromatographic conditions were C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， mobile phase A （90% water +10% methanol， pH 6.8， 0.15% sodium acetate）， mobile phase B （90% methanol +10% water， pH 3.8）. Nicotine was in the range of 0.1-50 μg/mL and the other three alkaloids were in the range of 0.005-2 μg/mL， with the standard curves of the four alkaloids all havig good linear relationship （R2 > 0.99）. The limits of detection （LOD） of nicotine were 0.000 65 μg/mL， and the average recoveries were 100.79%， RSD 3.11%; the LOD of anatabine were 0.088 4 μg/mL， and the average recoveries were 98.53%， RSD 3.75%; the LOD of anabasine were 0.034 8 μg/mL， and the average recoveries were 98.70%， RSD3.63%; the LOD of nornicotine were 0.150 9 μg/mL， and the average recoveries were 101.33%， RSD 4.61%. A total of 11 different samples of 4 different types of tobacco leaves were tested， and the results were reliable. The method is simple and fast， sensitive and repeatable， and can meet the requirements of detecting four alkaloids in tobacco samples.
Keywords： tobacco; nicotine; anatabine; anabasine; nornicotine; HPLC
生物碱是一类存在于植物体中的特殊的含氮有机物，是植物体随外界环境变化合成的次生代谢产物，一般具有特殊的生理活性，如抗炎、镇痛和成瘾性[1]。烟草中含有超过50种生物碱，含量较高的有烟碱（尼古丁）、新烟草碱、假木贼碱、降烟碱（去甲基烟碱）等[2]。其中烟碱含量最高，一般占总生物碱组分的90%以上，其他各种生物碱所占的比例一般不超过10%[3]。不同类型烟叶的生物碱含量差异主要是烟碱和降烟碱的含量差异，而假木贼碱和新烟草碱在各类型烟叶中的含量均较低，且较少出现转移或降解[4]。
生物碱的组成和含量是影响烟叶质量的重要因素，直接影响着烟草制品的劲头、刺激性、吃味和安全性[5]。烟碱含量对评吸质量影响极大，过低劲头不足，过高会造成刺激性大，影响吃味[6-7];在烟碱去甲基酶的作用下，烟碱脱去甲基后形成降烟碱，降烟碱含量高，则会降解生成麦斯明等物质，影响烟叶香气质和香气量，并导致烟草特有亚硝胺（TSNAs）含量上升[8-9];假木贼碱与劲头得分显著负相关，且对香气浓度有显著影响[10];新烟草碱对香气质、香气量、刺激性以及TSNAs含量等均有影响[9，11]。因此准确快速简便的测定烟叶内各生物碱含量对于烟草研究有着重要作用。 目前关于烟草生物碱的检测方法主要有气相色谱法（GC）[12-15]、气相色谱质谱联用法（GC-MS）[1，6-18]、液相色谱法（LC）[19-21]、液相色谱质谱联用法（LC-MS）[22-24]。与其他方法相比，液相色谱法的样品前处理步骤少、误差小，检测更快速、重现性更好，更利于广泛使用。刘正聪等[25]利用超高效液相色谱法（UPLC）检测了卷烟烟丝中的烟碱、降烟碱、麦斯明、新烟草碱和可替宁等5种生物碱，该方法出峰时间较快，出峰较为密集，目标物不容易区分。本文在前人研究的基础上，采用高效液相色谱法，建立了同时检测烟碱、降烟碱、新烟草碱、假木贼碱等烟草中含量较高的4种生物碱[2]的方法，该方法前处理步骤简便、结果准确，同时检测组分多，且峰形良好。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
4种类型烟叶样品（烤烟4个，云南;白肋烟2个，湖北;雪茄烟海南2个、四川1个;晒红烟2个，吉林），共计11个。烘干粉碎过40目筛备用。
烟碱、降烟碱、新烟草碱、假木贼碱标准品，纯度均大于98%（TRC，加拿大）;醋酸钠、磷酸、三乙胺、盐酸、氢氧化钠均为分析纯（天津大茂）;甲醇为色谱纯（天津科密欧）。
电子天平（上海上平，精度0.000 1 g），超声仪（郑州生元，SYU-10-300 DT），pH计（上海丰控，FK-PH10），LC-20 A液相色谱（日本岛津，LC20）。
1.2 前处理方法
1.2.1 标准溶液配制 分别称取4种生物碱10 mg，用100 mL甲醇溶解，得到100 mg/L的单一标准溶液母液。分别吸取适量母液，配成4种生物碱的标准混合溶液，按照优化后的检测步骤，通过峰面积绘制校准曲线，其中，烟碱的浓度为0.1、0.5、2、10、20、50 mg/g，其余3种生物碱浓度为0.005、0.02、0.1、0.5、1、2 mg/g。
1.2.2 生物碱的紫外扫描及色谱条件 取配制好的单标溶液稀释后进行波长扫描，扫描范围为200～400 nm。
色谱条件：岛津Shim pack GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸钠），流动相 B（90%甲醇+10%水，pH 3.8），柱温：35 ℃;进样量：20 μL。
梯度洗脱程序为：0 min （0% B）-8.0 min （0% B）-15.0 min （4% B）-23.0 min （26% B）-34.0 min （35% B）-38.2 min （36% B）-39.0 min （40% B）-41.5 min （40% B）- 44.6 min （0% B）。
1.2.3 提取溶剂的筛选 分别配制2%、4%、6%的盐酸溶液、氢氧化钠溶液和氨水溶液以及0%、5%、10%的甲醇水溶液。称取各烟叶样品100 mg，分别放入锥形瓶中，加入溶液20 mL，振荡提取30 min，过滤至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中用對应溶液稀释定容，用磷酸或氢氧化钠溶液调节至pH：5（使用甲醇的处理不需要调节pH值），待检测。
1.2.4 提取时间的影响 称取100 mg烟叶样品，放入锥形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分别提取10、15、20、25、30 min，过滤至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀释定容，待检测。
1.2.5 提取温度的影响 称取100 mg烟叶样品，放入锥形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分别在25、30、35、40、45 ℃的条件下提取30 min，过滤至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀释定容，待检测。
1.2.6 料液比的影响 分别称取50、100、150、200、250 mg烟叶样品，放入锥形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，提取30 min，过滤至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀释定容，待检测。
1.3 方法学验证
1.3.1 检出限和定量限 将最小浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样10 μL，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的浓度以确定检出限（LOD），当信噪比S/N=10时所对应的标准溶液的浓度以确定定量限（LOQ）。
1.3.2 仪器精密度试验 取同一浓度的混标溶液在1.2.2的色谱条件下连续进样5次，每次20 μL，以各对照品的信息，计算各成分的相对标准偏差。
1.3.3 方法重复性试验 精密称取同一份烤烟样品5份，每份100 mg，按优选后的提取方法进行提取，得到样品溶液，在1.2.2的色谱条件下分别进样，计算样品中各成分的含量的相对标准偏差值（RSD）。
1.3.4 稳定性试验 精密称取同一份烤烟样品5份，每份100 mg，按优选后的提取方法进行提取，得到样品溶液，在上述色谱条件下连续3 d检测同一样品溶液，每次进行5个平行试验，计算RSD。
1.3.5 加样回收率试验 以实际样品含量为参考，根据所对应成分含量的0.5、1、2倍进行低、中、高加样回收率试验。
1.3.6 样品检测 每个样品称取100 mg，放入锥形瓶中，按照筛选出的最优前处理条件进行提取，用磷酸或氢氧化钠溶液调节至pH 5（若使用甲醇的处理则不需要调节pH值），过滤至50 mL容量瓶中定容，取10 mL移至100 mL容量瓶中用筛选后溶剂稀释定容，待检测。在1.2.2的色谱条件下分别进样，计算各样品中4种生物碱的含量。
1.4 数据处理
以外标法进行定性和定量测定，以Excel 2016进行数据分析，用GraphPad Prism 8.0作图。 2 结果与讨论
2.1 检测波长的确定
从生物碱紫外扫描图可以看出（图1），4种生物碱均在259 nm处有最大吸收峰，在236 nm处于谷底，超过282 nm后无紫外吸收。甲醇在大于250 nm以后均无紫外吸收干扰，因此选择259 nm作为4种生物碱的检测波长。
2.2 检测条件优化
如图2所示，4种生物碱与杂质峰分离较好，保留时间较为适宜。25 min后4种生物碱出峰完成，后续洗脱时加大流动相B（90%甲醇+10%水，pH 3.8）的比例以冲洗样品中的醇溶性成分，减少对色谱柱的污染。烟草中极性较强的生物碱能被弱极性的C18柱吸附和分离，原因在于流动相A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸钠）处于中性的pH 6.8，抑制了生物碱的离子化，增强其与填料之间的吸附力。烟草中的生物碱为弱碱，在水溶液中以游离态或单质子态等形态存在，在检测时，不同pH的流动相会直接影响到生物碱的存在状态。酸性水溶液pH较小，生物碱离子化导致与色谱柱吸附作用降低，因此保留时间减少，难以与溶剂峰、杂质峰分离，无法准确检测;随着pH的提高，生物碱电离作用减弱，提高了其与填料的吸附力，也就延长了其保留时间。例如，陈燕舞[20]等研究了流动相pH对烟碱保留时间的影响，发现随着pH的增加，烟碱的保留时间出现明显的延长，当流动相pH为3.00时，烟碱保留时间为4.15 min，而当pH为7.00时，保留时间延长至13.37 min。但是流动相pH须小于8.00，否则烟草生物碱不稳定，且会降低柱效和影响色谱柱寿命。
2.3 提取条件
烟草4种生物碱属于分子量较小的极性有机物，易溶于水、甲醇等溶剂，研究者常用不同浓度的酸、碱、乙醇、甲醇等作为提取溶剂。例如，师君丽等[26]和罗琼等[21]使用10%的氢氧化钠浸泡提取了烟碱降烟碱麦斯明等8种生物碱;刘正聪等[25]选择了5%氢氧化钠水溶液和无水乙醇混合液提取了可替宁、降烟碱、麦斯明、新烟草碱和烟碱;廖坤等[27]认为单纯用异丙醇作提取溶剂萃取时间太长，0.5%的乙酸与异丙醇的混合溶剂提取烟碱效果更好;谭芳等[28]认为将甲醇作为提取溶剂来提取烟碱效果最好。表1结果表明，6%的盐酸对烟碱和新烟草碱的提取效果较好，但是对假木贼碱的提取效果很差;各浓度的氢氧化钠溶液对4种生物碱的提取效果均较差;不同浓度氨水对于新烟草碱提取效果较好，但对于其他3种生物碱的提取效果较差;而5%和10%甲醇对4种生物碱的提取效果均较优。由于甲醇为中性溶剂，用甲醇提取的溶液用于HPLC检测前不需要调节pH，因此在处理步骤上更加简便快捷，并且甲醇具有较好的抑菌性，有利于样品溶液的储存，因此综合考虑后采用5%的甲醇作为提取溶剂。
罗琼等[21]选择振荡30 min提取生物碱;廖坤等[27]认为振荡30 min提取烟碱的效果较好。表2示出，5%甲醇的振荡提取25 min和30 min时各生物碱的提取率均高于提取10、15、20 min，提取25 min和30 min无显著差异，为保险起见，本试验选择30 min的振荡提取时间。
罗琼等[21]、刘正聪等[25]、张瑞等[24]、谭芳等[28]均采用了室温（25 ℃）下提取生物碱。从表3的试验结果可以看出，随着温度的升高，4种生物碱的提取率有小幅度增加，假木贼碱和新烟草碱在35 ℃条件下提取率有轻微降低，但各处理间没有显著差异;并且随着温度的升高，提取液明显可见颜色加深，提取液中色素等杂质的含量也随之升高，考虑到杂质对液相色谱柱的影响，本试验选择25 ℃作为提取温度。
储志兵等[19]选择的料液比为1：40;丁丽等[13]选择1：50的料液比;肖遂等[17]进行正交对比试验认为1：40的料液比更好。从表4的试验结果来看，50 mg/20 mL和100 mg/20 mL的料液比条件下提取的生物碱含量差异不显著，数值近似，提取完全，而料液比在150 mg/20 mL以上4种生物碱均有降低。与前人研究相比后，决定采用100 mg/20 mL即1：200的料液比作为本试验样品的前处理条件。
综上，最终选择100 mg/20 mL（1∶200）料液比，5%甲醇在25 ℃室溫下振荡30 min的提取条件。
2.4 方法学验证
2.4.1 标准曲线、检出限及定量限 分别对各浓度的标准溶液进行检测分析，并对各个生物碱的色谱峰面积及其浓度进行回归分析，得到回归方程及相关系数（表5）。由表5看出，新烟草碱、假木贼碱、降烟碱的线性范围为0.005～2 μg/mL;烟碱的线性范围为0.1～50 μg/mL，线性相关系数R2均大于0.996。烟碱的检测限为0.006 5 μg/mL，定量限为0.021 7 μg/mL，新烟草碱的检测限为0.088 4 μg/mL，定量限为0.294 8 μg/mL，假木贼碱的检测限为0.034 8 μg/mL，定量限为0.116 1 μg/mL，降烟碱稍高，检测限为0.150 9 μg/mL，定量限为0.503 1 μg/mL。各生物碱的检出限和定量限均较低，可以满足各种类型烟草的检测要求。
2.4.2 方法的重复性与稳定性 如表6和表7所示，方法精密度RSD为1.24%～2.56%，重复性RSD为1.62%～4.27%，稳定性RSD为1.55%～3.36%，平均加标回收率在98.17%～102.65%之间，RSD在3.64%～4.08%之间。综合来看，该方法重复性较好，仪器精密度较高，方法稳定性较好，加标回收率好，适合用于样品检测。
2.4.3 样品测定 按上述方法对不同类型的烟叶样品进行检测后得表8。选用了烤烟、白肋烟、雪茄烟和晒红烟4种不同类型的烟叶样品。从表8中可以看出，4种不同类型烟草样品各生物碱含量差异与文献[3-4]报道基本一致。 3 結 论
本文建立了HPLC法测定烟叶中烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱等4种生物碱的方法。通过单一因素筛选，以100 mg/20 mL（1∶200）料液比，5%甲醇在25 ℃室温下振荡30 min效果最好;HPLC检测结果的线性相关系数高，检出限和定量限低，灵敏度高，重复性、稳定性及加标回收率均较好。本方法前处理步骤简单，检测结果可靠，适合批量检测不同类型烟叶样品中的生物碱含量。
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关键词：烟草;烟碱;新烟草碱;假木贼碱;降烟碱;液相色谱法
Abstract： In order to quickly and accurately determine the content of alkaloids in tobacco leaves， the extraction conditions were optimized， and a method for the determination of nicotine， anatabine， anabasine and nornicotine contents in tobacco by HPLC was established. The optimized detection steps are as follows： 100 mg/20 mL solid-liquid ratio， 5% methanol was extracted by oscillation at 25 ℃ for 30 min， the chromatographic conditions were C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， mobile phase A （90% water +10% methanol， pH 6.8， 0.15% sodium acetate）， mobile phase B （90% methanol +10% water， pH 3.8）. Nicotine was in the range of 0.1-50 μg/mL and the other three alkaloids were in the range of 0.005-2 μg/mL， with the standard curves of the four alkaloids all havig good linear relationship （R2 > 0.99）. The limits of detection （LOD） of nicotine were 0.000 65 μg/mL， and the average recoveries were 100.79%， RSD 3.11%; the LOD of anatabine were 0.088 4 μg/mL， and the average recoveries were 98.53%， RSD 3.75%; the LOD of anabasine were 0.034 8 μg/mL， and the average recoveries were 98.70%， RSD3.63%; the LOD of nornicotine were 0.150 9 μg/mL， and the average recoveries were 101.33%， RSD 4.61%. A total of 11 different samples of 4 different types of tobacco leaves were tested， and the results were reliable. The method is simple and fast， sensitive and repeatable， and can meet the requirements of detecting four alkaloids in tobacco samples.
Keywords： tobacco; nicotine; anatabine; anabasine; nornicotine; HPLC
生物碱是一类存在于植物体中的特殊的含氮有机物，是植物体随外界环境变化合成的次生代谢产物，一般具有特殊的生理活性，如抗炎、镇痛和成瘾性[1]。烟草中含有超过50种生物碱，含量较高的有烟碱（尼古丁）、新烟草碱、假木贼碱、降烟碱（去甲基烟碱）等[2]。其中烟碱含量最高，一般占总生物碱组分的90%以上，其他各种生物碱所占的比例一般不超过10%[3]。不同类型烟叶的生物碱含量差异主要是烟碱和降烟碱的含量差异，而假木贼碱和新烟草碱在各类型烟叶中的含量均较低，且较少出现转移或降解[4]。
生物碱的组成和含量是影响烟叶质量的重要因素，直接影响着烟草制品的劲头、刺激性、吃味和安全性[5]。烟碱含量对评吸质量影响极大，过低劲头不足，过高会造成刺激性大，影响吃味[6-7];在烟碱去甲基酶的作用下，烟碱脱去甲基后形成降烟碱，降烟碱含量高，则会降解生成麦斯明等物质，影响烟叶香气质和香气量，并导致烟草特有亚硝胺（TSNAs）含量上升[8-9];假木贼碱与劲头得分显著负相关，且对香气浓度有显著影响[10];新烟草碱对香气质、香气量、刺激性以及TSNAs含量等均有影响[9，11]。因此准确快速简便的测定烟叶内各生物碱含量对于烟草研究有着重要作用。 目前关于烟草生物碱的检测方法主要有气相色谱法（GC）[12-15]、气相色谱质谱联用法（GC-MS）[1，6-18]、液相色谱法（LC）[19-21]、液相色谱质谱联用法（LC-MS）[22-24]。与其他方法相比，液相色谱法的样品前处理步骤少、误差小，检测更快速、重现性更好，更利于广泛使用。刘正聪等[25]利用超高效液相色谱法（UPLC）检测了卷烟烟丝中的烟碱、降烟碱、麦斯明、新烟草碱和可替宁等5种生物碱，该方法出峰时间较快，出峰较为密集，目标物不容易区分。本文在前人研究的基础上，采用高效液相色谱法，建立了同时检测烟碱、降烟碱、新烟草碱、假木贼碱等烟草中含量较高的4种生物碱[2]的方法，该方法前处理步骤简便、结果准确，同时检测组分多，且峰形良好。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
4种类型烟叶样品（烤烟4个，云南;白肋烟2个，湖北;雪茄烟海南2个、四川1个;晒红烟2个，吉林），共计11个。烘干粉碎过40目筛备用。
烟碱、降烟碱、新烟草碱、假木贼碱标准品，纯度均大于98%（TRC，加拿大）;醋酸钠、磷酸、三乙胺、盐酸、氢氧化钠均为分析纯（天津大茂）;甲醇为色谱纯（天津科密欧）。
电子天平（上海上平，精度0.000 1 g），超声仪（郑州生元，SYU-10-300 DT），pH计（上海丰控，FK-PH10），LC-20 A液相色谱（日本岛津，LC20）。
1.2 前处理方法
1.2.1 标准溶液配制 分别称取4种生物碱10 mg，用100 mL甲醇溶解，得到100 mg/L的单一标准溶液母液。分别吸取适量母液，配成4种生物碱的标准混合溶液，按照优化后的检测步骤，通过峰面积绘制校准曲线，其中，烟碱的浓度为0.1、0.5、2、10、20、50 mg/g，其余3种生物碱浓度为0.005、0.02、0.1、0.5、1、2 mg/g。
1.2.2 生物碱的紫外扫描及色谱条件 取配制好的单标溶液稀释后进行波长扫描，扫描范围为200～400 nm。
色谱条件：岛津Shim pack GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸钠），流动相 B（90%甲醇+10%水，pH 3.8），柱温：35 ℃;进样量：20 μL。
梯度洗脱程序为：0 min （0% B）-8.0 min （0% B）-15.0 min （4% B）-23.0 min （26% B）-34.0 min （35% B）-38.2 min （36% B）-39.0 min （40% B）-41.5 min （40% B）- 44.6 min （0% B）。
1.2.3 提取溶剂的筛选 分别配制2%、4%、6%的盐酸溶液、氢氧化钠溶液和氨水溶液以及0%、5%、10%的甲醇水溶液。称取各烟叶样品100 mg，分别放入锥形瓶中，加入溶液20 mL，振荡提取30 min，过滤至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中用對应溶液稀释定容，用磷酸或氢氧化钠溶液调节至pH：5（使用甲醇的处理不需要调节pH值），待检测。
1.2.4 提取时间的影响 称取100 mg烟叶样品，放入锥形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分别提取10、15、20、25、30 min，过滤至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀释定容，待检测。
1.2.5 提取温度的影响 称取100 mg烟叶样品，放入锥形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分别在25、30、35、40、45 ℃的条件下提取30 min，过滤至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀释定容，待检测。
1.2.6 料液比的影响 分别称取50、100、150、200、250 mg烟叶样品，放入锥形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，提取30 min，过滤至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀释定容，待检测。
1.3 方法学验证
1.3.1 检出限和定量限 将最小浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样10 μL，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的浓度以确定检出限（LOD），当信噪比S/N=10时所对应的标准溶液的浓度以确定定量限（LOQ）。
1.3.2 仪器精密度试验 取同一浓度的混标溶液在1.2.2的色谱条件下连续进样5次，每次20 μL，以各对照品的信息，计算各成分的相对标准偏差。
1.3.3 方法重复性试验 精密称取同一份烤烟样品5份，每份100 mg，按优选后的提取方法进行提取，得到样品溶液，在1.2.2的色谱条件下分别进样，计算样品中各成分的含量的相对标准偏差值（RSD）。
1.3.4 稳定性试验 精密称取同一份烤烟样品5份，每份100 mg，按优选后的提取方法进行提取，得到样品溶液，在上述色谱条件下连续3 d检测同一样品溶液，每次进行5个平行试验，计算RSD。
1.3.5 加样回收率试验 以实际样品含量为参考，根据所对应成分含量的0.5、1、2倍进行低、中、高加样回收率试验。
1.3.6 样品检测 每个样品称取100 mg，放入锥形瓶中，按照筛选出的最优前处理条件进行提取，用磷酸或氢氧化钠溶液调节至pH 5（若使用甲醇的处理则不需要调节pH值），过滤至50 mL容量瓶中定容，取10 mL移至100 mL容量瓶中用筛选后溶剂稀释定容，待检测。在1.2.2的色谱条件下分别进样，计算各样品中4种生物碱的含量。
1.4 数据处理
以外标法进行定性和定量测定，以Excel 2016进行数据分析，用GraphPad Prism 8.0作图。 2 结果与讨论
2.1 检测波长的确定
从生物碱紫外扫描图可以看出（图1），4种生物碱均在259 nm处有最大吸收峰，在236 nm处于谷底，超过282 nm后无紫外吸收。甲醇在大于250 nm以后均无紫外吸收干扰，因此选择259 nm作为4种生物碱的检测波长。
2.2 检测条件优化
如图2所示，4种生物碱与杂质峰分离较好，保留时间较为适宜。25 min后4种生物碱出峰完成，后续洗脱时加大流动相B（90%甲醇+10%水，pH 3.8）的比例以冲洗样品中的醇溶性成分，减少对色谱柱的污染。烟草中极性较强的生物碱能被弱极性的C18柱吸附和分离，原因在于流动相A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸钠）处于中性的pH 6.8，抑制了生物碱的离子化，增强其与填料之间的吸附力。烟草中的生物碱为弱碱，在水溶液中以游离态或单质子态等形态存在，在检测时，不同pH的流动相会直接影响到生物碱的存在状态。酸性水溶液pH较小，生物碱离子化导致与色谱柱吸附作用降低，因此保留时间减少，难以与溶剂峰、杂质峰分离，无法准确检测;随着pH的提高，生物碱电离作用减弱，提高了其与填料的吸附力，也就延长了其保留时间。例如，陈燕舞[20]等研究了流动相pH对烟碱保留时间的影响，发现随着pH的增加，烟碱的保留时间出现明显的延长，当流动相pH为3.00时，烟碱保留时间为4.15 min，而当pH为7.00时，保留时间延长至13.37 min。但是流动相pH须小于8.00，否则烟草生物碱不稳定，且会降低柱效和影响色谱柱寿命。
2.3 提取条件
烟草4种生物碱属于分子量较小的极性有机物，易溶于水、甲醇等溶剂，研究者常用不同浓度的酸、碱、乙醇、甲醇等作为提取溶剂。例如，师君丽等[26]和罗琼等[21]使用10%的氢氧化钠浸泡提取了烟碱降烟碱麦斯明等8种生物碱;刘正聪等[25]选择了5%氢氧化钠水溶液和无水乙醇混合液提取了可替宁、降烟碱、麦斯明、新烟草碱和烟碱;廖坤等[27]认为单纯用异丙醇作提取溶剂萃取时间太长，0.5%的乙酸与异丙醇的混合溶剂提取烟碱效果更好;谭芳等[28]认为将甲醇作为提取溶剂来提取烟碱效果最好。表1结果表明，6%的盐酸对烟碱和新烟草碱的提取效果较好，但是对假木贼碱的提取效果很差;各浓度的氢氧化钠溶液对4种生物碱的提取效果均较差;不同浓度氨水对于新烟草碱提取效果较好，但对于其他3种生物碱的提取效果较差;而5%和10%甲醇对4种生物碱的提取效果均较优。由于甲醇为中性溶剂，用甲醇提取的溶液用于HPLC检测前不需要调节pH，因此在处理步骤上更加简便快捷，并且甲醇具有较好的抑菌性，有利于样品溶液的储存，因此综合考虑后采用5%的甲醇作为提取溶剂。
罗琼等[21]选择振荡30 min提取生物碱;廖坤等[27]认为振荡30 min提取烟碱的效果较好。表2示出，5%甲醇的振荡提取25 min和30 min时各生物碱的提取率均高于提取10、15、20 min，提取25 min和30 min无显著差异，为保险起见，本试验选择30 min的振荡提取时间。
罗琼等[21]、刘正聪等[25]、张瑞等[24]、谭芳等[28]均采用了室温（25 ℃）下提取生物碱。从表3的试验结果可以看出，随着温度的升高，4种生物碱的提取率有小幅度增加，假木贼碱和新烟草碱在35 ℃条件下提取率有轻微降低，但各处理间没有显著差异;并且随着温度的升高，提取液明显可见颜色加深，提取液中色素等杂质的含量也随之升高，考虑到杂质对液相色谱柱的影响，本试验选择25 ℃作为提取温度。
储志兵等[19]选择的料液比为1：40;丁丽等[13]选择1：50的料液比;肖遂等[17]进行正交对比试验认为1：40的料液比更好。从表4的试验结果来看，50 mg/20 mL和100 mg/20 mL的料液比条件下提取的生物碱含量差异不显著，数值近似，提取完全，而料液比在150 mg/20 mL以上4种生物碱均有降低。与前人研究相比后，决定采用100 mg/20 mL即1：200的料液比作为本试验样品的前处理条件。
综上，最终选择100 mg/20 mL（1∶200）料液比，5%甲醇在25 ℃室溫下振荡30 min的提取条件。
2.4 方法学验证
2.4.1 标准曲线、检出限及定量限 分别对各浓度的标准溶液进行检测分析，并对各个生物碱的色谱峰面积及其浓度进行回归分析，得到回归方程及相关系数（表5）。由表5看出，新烟草碱、假木贼碱、降烟碱的线性范围为0.005～2 μg/mL;烟碱的线性范围为0.1～50 μg/mL，线性相关系数R2均大于0.996。烟碱的检测限为0.006 5 μg/mL，定量限为0.021 7 μg/mL，新烟草碱的检测限为0.088 4 μg/mL，定量限为0.294 8 μg/mL，假木贼碱的检测限为0.034 8 μg/mL，定量限为0.116 1 μg/mL，降烟碱稍高，检测限为0.150 9 μg/mL，定量限为0.503 1 μg/mL。各生物碱的检出限和定量限均较低，可以满足各种类型烟草的检测要求。
2.4.2 方法的重复性与稳定性 如表6和表7所示，方法精密度RSD为1.24%～2.56%，重复性RSD为1.62%～4.27%，稳定性RSD为1.55%～3.36%，平均加标回收率在98.17%～102.65%之间，RSD在3.64%～4.08%之间。综合来看，该方法重复性较好，仪器精密度较高，方法稳定性较好，加标回收率好，适合用于样品检测。
2.4.3 样品测定 按上述方法对不同类型的烟叶样品进行检测后得表8。选用了烤烟、白肋烟、雪茄烟和晒红烟4种不同类型的烟叶样品。从表8中可以看出，4种不同类型烟草样品各生物碱含量差异与文献[3-4]报道基本一致。 3 結 论
本文建立了HPLC法测定烟叶中烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱等4种生物碱的方法。通过单一因素筛选，以100 mg/20 mL（1∶200）料液比，5%甲醇在25 ℃室温下振荡30 min效果最好;HPLC检测结果的线性相关系数高，检出限和定量限低，灵敏度高，重复性、稳定性及加标回收率均较好。本方法前处理步骤简单，检测结果可靠，适合批量检测不同类型烟叶样品中的生物碱含量。
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