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[摘要]目的:体外构建研究色素问题的黑素瘤细胞(A375)与角质形成细胞(HACAT)直接接触的共培养模型,利用熊果苷对此共培养体系进行验证。方法:MEM培养基分别培养A375细胞与HACAT细胞,A375细胞与HACAT以1:2的比例共培养,构建黑素瘤细胞与角质形成细胞直接接触的共培养模型;将不同浓度熊果苷作用于此模型,用MTT法、多巴氧化法及NaOH裂解法检测熊果苷对细胞增殖、酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响。结果:A375细胞与HACAT能共同存活,1.0mg/ml、0.5mg/ml和0.2mg/ml熊果苷对共培养细胞的增殖、黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成均有较强的剂量相关的抑制作用,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建了A375细胞与HACAT细胞直接接触的共培养模型;脱色药熊果苷作用于本模型后引起酪氨酸酶及黑素的变化与预期结果一致;本模型为进一步研究色素问题奠定了基础。
[关键词]共培养模型;黑素瘤细胞;角质形成细胞;熊果苷
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)09-1321-03
Effect of Arbutin on the in vitro model of the Melanoma Cells and keratinocyte co-culture system
WANG Xing-yan,WANG Tian-ye,CHEN Qiao-yun,ZHANG Ning,LI Shao-min,CHEN Jing-hua
(Department of Cosmetology of TCM,Jiamusi College,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Jiamusi 154007,Heilongjiang,China)
Abstract:ObjectiveTo Establish the in vitro co-culture model of melanoma cells and keratinocytes,and observe the effect of Arbutin on pigmentation in co-culture model of melanoma cells and keratinocytes.MethodsWe cultivated the melanoma cells and keratinocytes respectively and then constructed the mixed cultivating model of them.After arbutin was added to the model,celludar proliferation,tyrosinase activity and melanin content were measured by MTT assay,L-DOPA oxidation assay and NaOH assay respectively.ResultsThe in vitro co-culture model of melanoma cells and keratinocytes was established successfully The proliferation of co-culture cells,tyrosinase activity and the melanin synthesis were markedly suppressed by arbutin in a dose-dependent manner.The significant suppression was observed with 1.0mg/ml,0.5mg/ml,0.2mg/ml of arbutin than that with control.ConclusionWe have successfully constructed the co-culture model of melanoma cells and keratinocytes, Arbutin known to inhibit melanogenesis were examined using the co-culture model and the results were consistent with expectations. This model provide requirement for further study.
Key words:co-culture model;melanoma cells;keratinocytes;Arbutin
黑素是决定皮肤颜色的最主要因素,在黑素细胞的特征性细胞器-黑素小体中合成。生理情况下一个黑素细胞与周围约36个角质形成细胞相接触,构成表皮黑素单位[1],黑素代谢是一个发生于黑素细胞(MC)与角质形成细胞(KC)之间并主要由角质形成细胞及其分泌的细胞因子调控的完整的过程。自1982年Eisinger和Marko[2]体外培养皮肤MC成功以来,黑素细胞体外培养技术已被广泛应用于基础及临床研究中,包括退色素药物的筛选、机理、疗效及毒性的研究。然而这种黑素细胞的单独培养未考虑体内其它邻近细胞对黑素细胞的影响。1988年Halaban[3]首次成功地建立了体外模拟“表皮黑素单元”的黑素细胞和角质形成细胞共培养模型,使研究者得以使用更接近皮肤生理学特点的模型来开展一系列研究。研究结果[4-6]表明KC-MC共培养体系下针对影响黑素代谢药物筛选的结果不同于单独培养黑素细胞基础上的筛选结果。本实验构建了KC-MC共养模型,模拟体内“表皮黑素单元”结构,用公认的脱色药熊果苷作用于本模型,观察本模型对熊果苷作用的反应是否与预期一致,验证本模型能否用于脱色素药物的筛选及机理研究。
1材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞:人黑素瘤细胞株(A375)由中国科学院细胞中心提供;人永生化角质形成细胞(HACAT细胞)购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。
1.1.2试剂与仪器:MEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、双抗(Billab公司);二甲基亚砜、甲基噻唑四唑、L-dopa、TritonX-100、熊果苷(购于Sigma公司);磷酸缓冲盐(北京中杉金桥有限公司)。离心机(上海安亭科学仪器厂);酶标仪(上海热电仪器有限公司);Olympus倒置显微镜(日本Olympus株式会社);生物洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);小容量恒温培养振荡器(上海智城分析仪器有公司);超低温冰箱(Thermo Electron Corporation);CO2孵育箱(上海智成分析仪器制造有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养模型的建立:常规培养A375细胞及HACAT细胞。取对数期生长状态良好的A375细胞及HACAT细胞消化、离心、MEM培养液重悬细胞后计数,按A375细胞与HACAT细胞比例为1:2将两种细胞悬液混合。每次实验的细胞取自同一原瓶。
1.2.2分组及给药:实验分给药组、阴性对照组和空白组。给药组熊果苷的浓度分别0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/ml;阴性对照组直接加培养基;空白组不加细胞,只加培养基。以空白孔调零,各组设6个复孔。
1.2.2细胞增殖活性测定:将混合后的细胞用含10%FBS和1%双抗的MEM培养基调整细胞浓度为1.5×104个/ml,按每孔200μl接种至96孔板,5%CO2,37℃培养箱培养8～12h。细胞贴壁后换含不同浓度熊果苷的培养液,继续培养48h。培养结束前4h加5mg/ml的MTT 20μl,继续培养4h后,倒扣法去除培养液,每孔加入150μl DMSO,将培养板置于微孔板震荡器震荡10min,使结晶溶解。酶标仪490nm测定吸光度值。细胞增殖活性用A490值表示。
1.2.3 酪氨酸酶活性测定:将混合后细胞浓度调整为1.5×104个/ml,按每孔200μl接种至96孔板培养24h后弃培养基,换含不同浓度熊果苷的培养液,继续培养48h。用pH7.4的0.01M的PBS洗涤2次,每孔加1%Triton-X溶液100μl,迅速置-80℃冰箱内放置30min后,之后室温下融化,充分裂解细胞。37℃预热,加入0.5%L-DOPA溶液50μl/孔,于37℃下反应3h,以490nm波长测定各孔OD值,每个浓度设6个复孔,每一处理因素重复3次。酪氨酸酶活性用A490值表示。
1.2.4 黑素含量的测定:采用Hunt[7]法测定黑素量。共培养细胞以4.5×104/ml,接种6孔板,每孔2ml(约90 000个细胞),置于培养箱中培养24h后,给药组用含不同浓度熊果苷的新鲜培养液换液1次,对照组只加培养基;继续培养48h后,吸弃培养液,加入0.25%胰酶0.5ml/孔消化后,加入1mlMEM中止消化,制成细胞悬液,将细胞悬液收集到10ml离心管中,1 500r/min离心5min,弃去上清液,然后加入100μl浓度为1mol/L NaOH,37℃水浴lh,充分裂解细胞和溶解黑素颗粒。加入400μl双蒸水释稀,充分混匀后,100μl/孔分别加至96孔板,置酶标仪测OD值,波长为490nm。每一处理因素重复3次。黑素含量用A490值表示。
1.3 统计分析:所测数据采用SPSS16.0统计软件包进行统计,各处理组与对照组多重比较用方差分析。
2结果
2.1 黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养:Hacat细胞与A375细胞可共同存活,A375细胞呈梭形、双极、三极或多分支树突状。Hacat细胞呈近似菱形,簇集成团。如图1。
2.2 熊果苷对共培养细胞增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量的影响:见表1。
由表1可见,熊果苷浓度≥0.2mg/ml时,对共培养细胞的增殖有显著抑制作用,与阴性对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);熊果苷浓度≤0.1mg/ml时,对共培养细胞增值无明显影响。熊果苷对共培养模型中酪氨酸酶活性呈剂量依赖性抑制。熊果苷浓度≥0.2mg/ml时,对共培养细胞中酪氨酸酶活性有显著抑制作用,与阴性对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);熊果苷浓度≤0.1mg/ml时,对共培养细胞中酪氨酸酶活性无明显影响。熊果苷对共培养模型中黑素合成呈剂量依赖性抑制。熊果苷浓度≥0.2mg/ml时,对共培养细胞中黑素合成有显著抑制作用,与阴性对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.01);熊果苷浓度≤0.1mg/ml时,对共培养细胞黑素合成无明显影响。
3讨论
脱色药熊果苷对单独培养的人黑素瘤细胞株(A375)黑素合成的抑制作用已得到证明[8],而本实验用A375细胞与人永生化角质形成细胞(HACAT)混合培养模型,将公认的脱色药熊果苷以不同浓度作用于此模型发现:A375与HACAT在混合培养时可共同存活;脱色药熊果苷作用于此模型可剂量依赖性抑制抑制酪氨酸酶活性和黑素合成。本研究结果与解士海[9]利用正常人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养模型研究熊果苷美白机理所得结果相似。李杰等[10]利用该模型研究了中药方“白消一号”治疗白癜风的机理发现白消一号能促进黑素瘤细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成。结合上述两位研究者的结果说明本模型能反映脱色药物对黑素代谢的影响,可用于脱色素药物的筛选及其作用机理的研究。本模型中所用细胞能无限传代细胞,较原代培养的正常人角质形成细胞和黑素细胞容易获得和培养。本实验结果显示熊果苷抑制黑素合成的浓度与其抑制黑素细胞的增殖的浓度基本一致,说明其美白作用主要与其细胞毒性有关,与宋琦如[11]的研究结果相同。但0.5mg/ml及0.2mg/ml熊果苷对共培养细胞增殖的抑制程度低于对黑素合成抑制程度(与相应对照组比分别为P<0.05,P<0.01),0.5mg/ml熊果苷对共培养细胞增殖的抑制程度小于其对酪氨酸酶的抑制程度(与相应对照组比分别为P<0.05,P<0.01),说明脱色药熊果苷的美白机理还与其抑制酪氨酸酶活性和(或)影响黑素合成的其它环节有关。
[参考文献]
[1]Yoon TJ,Hearing VJ.Coculture of mouse epidermal cells for studies of pigmentation[J].Pigment Cell Res,2003(16):159-163.
[2]Eisinger M,Marko O.Selectine poliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin[J].Proc Natl Acad Sci USA,1982,79(8):2018-2022.
[3]Halaban RLangdon R,Brichall N,et al.Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes[J].Cell Biol,1988,107:1611-1619.
[4]Lei TC,Virador VM,Vieira WD,et al.A melanocyte-keratinocyte coculture model to assess regulators of pigmentation in vitro[J]..Analytical Biochemistry,2002,305:260-268.
[5]解士海,陈志强,卜今,等.丹皮酚在体外对人黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素生成的影响[J].中华皮肤科杂志,2006,39(11):641.
[6]Duval C,Regnier M,Schmidt R,et al.Distinct Melanogenic Response of Human Melanocytes in Mono-culturein Co-culture with Keratinocytes and in Reconstrueted Epidermis,to UV Exposure[J].Pigment Cell Res,2001,14:348-355.
[7]Hunt G,Todd C,Cresswell JE.α-Melanocyte stimulating hormone and its analogue NIe4DPhe7α-MSH affect morphology,tyrosinase activity and melanogenesis in cultured human melanocytes[J].J Cell Sci,1994,107:205.
[8]刘邦民,张涓,陶春蓉,等. 验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞黑素合成的影响[J]. 时珍国医国药,2009,20(1):210.
[9]解士海.表皮黑素细胞-角质形成细胞共培养及11种化合物对黑素沉着的影响研究[D].北京:中国协和医科大学博士毕业论文,2006.
[10] 李杰,顾军,毕新岭,等.白消一号方对黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养模型中黑素合成的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2009,8(3):139-141.
[11]宋琦如,李吴萍,沈光祖,等.熊果苷对皮肤黑素细胞的生物学效应[J].宁夏医学院学报,2004,26(5):313-316.
[收稿日期]2010-06-17[修回日期]2010-08-18
编辑/张惠娟
[关键词]共培养模型;黑素瘤细胞;角质形成细胞;熊果苷
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)09-1321-03
Effect of Arbutin on the in vitro model of the Melanoma Cells and keratinocyte co-culture system
WANG Xing-yan,WANG Tian-ye,CHEN Qiao-yun,ZHANG Ning,LI Shao-min,CHEN Jing-hua
(Department of Cosmetology of TCM,Jiamusi College,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Jiamusi 154007,Heilongjiang,China)
Abstract:ObjectiveTo Establish the in vitro co-culture model of melanoma cells and keratinocytes,and observe the effect of Arbutin on pigmentation in co-culture model of melanoma cells and keratinocytes.MethodsWe cultivated the melanoma cells and keratinocytes respectively and then constructed the mixed cultivating model of them.After arbutin was added to the model,celludar proliferation,tyrosinase activity and melanin content were measured by MTT assay,L-DOPA oxidation assay and NaOH assay respectively.ResultsThe in vitro co-culture model of melanoma cells and keratinocytes was established successfully The proliferation of co-culture cells,tyrosinase activity and the melanin synthesis were markedly suppressed by arbutin in a dose-dependent manner.The significant suppression was observed with 1.0mg/ml,0.5mg/ml,0.2mg/ml of arbutin than that with control.ConclusionWe have successfully constructed the co-culture model of melanoma cells and keratinocytes, Arbutin known to inhibit melanogenesis were examined using the co-culture model and the results were consistent with expectations. This model provide requirement for further study.
Key words:co-culture model;melanoma cells;keratinocytes;Arbutin
黑素是决定皮肤颜色的最主要因素,在黑素细胞的特征性细胞器-黑素小体中合成。生理情况下一个黑素细胞与周围约36个角质形成细胞相接触,构成表皮黑素单位[1],黑素代谢是一个发生于黑素细胞(MC)与角质形成细胞(KC)之间并主要由角质形成细胞及其分泌的细胞因子调控的完整的过程。自1982年Eisinger和Marko[2]体外培养皮肤MC成功以来,黑素细胞体外培养技术已被广泛应用于基础及临床研究中,包括退色素药物的筛选、机理、疗效及毒性的研究。然而这种黑素细胞的单独培养未考虑体内其它邻近细胞对黑素细胞的影响。1988年Halaban[3]首次成功地建立了体外模拟“表皮黑素单元”的黑素细胞和角质形成细胞共培养模型,使研究者得以使用更接近皮肤生理学特点的模型来开展一系列研究。研究结果[4-6]表明KC-MC共培养体系下针对影响黑素代谢药物筛选的结果不同于单独培养黑素细胞基础上的筛选结果。本实验构建了KC-MC共养模型,模拟体内“表皮黑素单元”结构,用公认的脱色药熊果苷作用于本模型,观察本模型对熊果苷作用的反应是否与预期一致,验证本模型能否用于脱色素药物的筛选及机理研究。
1材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞:人黑素瘤细胞株(A375)由中国科学院细胞中心提供;人永生化角质形成细胞(HACAT细胞)购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。
1.1.2试剂与仪器:MEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、双抗(Billab公司);二甲基亚砜、甲基噻唑四唑、L-dopa、TritonX-100、熊果苷(购于Sigma公司);磷酸缓冲盐(北京中杉金桥有限公司)。离心机(上海安亭科学仪器厂);酶标仪(上海热电仪器有限公司);Olympus倒置显微镜(日本Olympus株式会社);生物洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);小容量恒温培养振荡器(上海智城分析仪器有公司);超低温冰箱(Thermo Electron Corporation);CO2孵育箱(上海智成分析仪器制造有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养模型的建立:常规培养A375细胞及HACAT细胞。取对数期生长状态良好的A375细胞及HACAT细胞消化、离心、MEM培养液重悬细胞后计数,按A375细胞与HACAT细胞比例为1:2将两种细胞悬液混合。每次实验的细胞取自同一原瓶。
1.2.2分组及给药:实验分给药组、阴性对照组和空白组。给药组熊果苷的浓度分别0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/ml;阴性对照组直接加培养基;空白组不加细胞,只加培养基。以空白孔调零,各组设6个复孔。
1.2.2细胞增殖活性测定:将混合后的细胞用含10%FBS和1%双抗的MEM培养基调整细胞浓度为1.5×104个/ml,按每孔200μl接种至96孔板,5%CO2,37℃培养箱培养8～12h。细胞贴壁后换含不同浓度熊果苷的培养液,继续培养48h。培养结束前4h加5mg/ml的MTT 20μl,继续培养4h后,倒扣法去除培养液,每孔加入150μl DMSO,将培养板置于微孔板震荡器震荡10min,使结晶溶解。酶标仪490nm测定吸光度值。细胞增殖活性用A490值表示。
1.2.3 酪氨酸酶活性测定:将混合后细胞浓度调整为1.5×104个/ml,按每孔200μl接种至96孔板培养24h后弃培养基,换含不同浓度熊果苷的培养液,继续培养48h。用pH7.4的0.01M的PBS洗涤2次,每孔加1%Triton-X溶液100μl,迅速置-80℃冰箱内放置30min后,之后室温下融化,充分裂解细胞。37℃预热,加入0.5%L-DOPA溶液50μl/孔,于37℃下反应3h,以490nm波长测定各孔OD值,每个浓度设6个复孔,每一处理因素重复3次。酪氨酸酶活性用A490值表示。
1.2.4 黑素含量的测定:采用Hunt[7]法测定黑素量。共培养细胞以4.5×104/ml,接种6孔板,每孔2ml(约90 000个细胞),置于培养箱中培养24h后,给药组用含不同浓度熊果苷的新鲜培养液换液1次,对照组只加培养基;继续培养48h后,吸弃培养液,加入0.25%胰酶0.5ml/孔消化后,加入1mlMEM中止消化,制成细胞悬液,将细胞悬液收集到10ml离心管中,1 500r/min离心5min,弃去上清液,然后加入100μl浓度为1mol/L NaOH,37℃水浴lh,充分裂解细胞和溶解黑素颗粒。加入400μl双蒸水释稀,充分混匀后,100μl/孔分别加至96孔板,置酶标仪测OD值,波长为490nm。每一处理因素重复3次。黑素含量用A490值表示。
1.3 统计分析:所测数据采用SPSS16.0统计软件包进行统计,各处理组与对照组多重比较用方差分析。
2结果
2.1 黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养:Hacat细胞与A375细胞可共同存活,A375细胞呈梭形、双极、三极或多分支树突状。Hacat细胞呈近似菱形,簇集成团。如图1。
2.2 熊果苷对共培养细胞增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量的影响:见表1。
由表1可见,熊果苷浓度≥0.2mg/ml时,对共培养细胞的增殖有显著抑制作用,与阴性对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);熊果苷浓度≤0.1mg/ml时,对共培养细胞增值无明显影响。熊果苷对共培养模型中酪氨酸酶活性呈剂量依赖性抑制。熊果苷浓度≥0.2mg/ml时,对共培养细胞中酪氨酸酶活性有显著抑制作用,与阴性对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);熊果苷浓度≤0.1mg/ml时,对共培养细胞中酪氨酸酶活性无明显影响。熊果苷对共培养模型中黑素合成呈剂量依赖性抑制。熊果苷浓度≥0.2mg/ml时,对共培养细胞中黑素合成有显著抑制作用,与阴性对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.01);熊果苷浓度≤0.1mg/ml时,对共培养细胞黑素合成无明显影响。
3讨论
脱色药熊果苷对单独培养的人黑素瘤细胞株(A375)黑素合成的抑制作用已得到证明[8],而本实验用A375细胞与人永生化角质形成细胞(HACAT)混合培养模型,将公认的脱色药熊果苷以不同浓度作用于此模型发现:A375与HACAT在混合培养时可共同存活;脱色药熊果苷作用于此模型可剂量依赖性抑制抑制酪氨酸酶活性和黑素合成。本研究结果与解士海[9]利用正常人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养模型研究熊果苷美白机理所得结果相似。李杰等[10]利用该模型研究了中药方“白消一号”治疗白癜风的机理发现白消一号能促进黑素瘤细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成。结合上述两位研究者的结果说明本模型能反映脱色药物对黑素代谢的影响,可用于脱色素药物的筛选及其作用机理的研究。本模型中所用细胞能无限传代细胞,较原代培养的正常人角质形成细胞和黑素细胞容易获得和培养。本实验结果显示熊果苷抑制黑素合成的浓度与其抑制黑素细胞的增殖的浓度基本一致,说明其美白作用主要与其细胞毒性有关,与宋琦如[11]的研究结果相同。但0.5mg/ml及0.2mg/ml熊果苷对共培养细胞增殖的抑制程度低于对黑素合成抑制程度(与相应对照组比分别为P<0.05,P<0.01),0.5mg/ml熊果苷对共培养细胞增殖的抑制程度小于其对酪氨酸酶的抑制程度(与相应对照组比分别为P<0.05,P<0.01),说明脱色药熊果苷的美白机理还与其抑制酪氨酸酶活性和(或)影响黑素合成的其它环节有关。
[参考文献]
[1]Yoon TJ,Hearing VJ.Coculture of mouse epidermal cells for studies of pigmentation[J].Pigment Cell Res,2003(16):159-163.
[2]Eisinger M,Marko O.Selectine poliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin[J].Proc Natl Acad Sci USA,1982,79(8):2018-2022.
[3]Halaban RLangdon R,Brichall N,et al.Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes[J].Cell Biol,1988,107:1611-1619.
[4]Lei TC,Virador VM,Vieira WD,et al.A melanocyte-keratinocyte coculture model to assess regulators of pigmentation in vitro[J]..Analytical Biochemistry,2002,305:260-268.
[5]解士海,陈志强,卜今,等.丹皮酚在体外对人黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素生成的影响[J].中华皮肤科杂志,2006,39(11):641.
[6]Duval C,Regnier M,Schmidt R,et al.Distinct Melanogenic Response of Human Melanocytes in Mono-culturein Co-culture with Keratinocytes and in Reconstrueted Epidermis,to UV Exposure[J].Pigment Cell Res,2001,14:348-355.
[7]Hunt G,Todd C,Cresswell JE.α-Melanocyte stimulating hormone and its analogue NIe4DPhe7α-MSH affect morphology,tyrosinase activity and melanogenesis in cultured human melanocytes[J].J Cell Sci,1994,107:205.
[8]刘邦民,张涓,陶春蓉,等. 验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞黑素合成的影响[J]. 时珍国医国药,2009,20(1):210.
[9]解士海.表皮黑素细胞-角质形成细胞共培养及11种化合物对黑素沉着的影响研究[D].北京:中国协和医科大学博士毕业论文,2006.
[10] 李杰,顾军,毕新岭,等.白消一号方对黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养模型中黑素合成的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2009,8(3):139-141.
[11]宋琦如,李吴萍,沈光祖,等.熊果苷对皮肤黑素细胞的生物学效应[J].宁夏医学院学报,2004,26(5):313-316.
[收稿日期]2010-06-17[修回日期]2010-08-18
编辑/张惠娟