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【摘要】 目的 建立康腹止泻片微生物限度检查法。方法 采用培养基稀释法。结果 该法能有效消除康腹止泻片在检验条件下对细菌、真菌及酵母菌的抑制作用；控制菌可用常规法检查。结论 该法简单、快捷，可用于康腹止泻片的微生物限度检查，有效控制其质量。
【关键词】 康腹止泻片；微生物限度检查；培养基稀释法
【中图分类号】R927.1
康腹止泻片是由木馏油、老鹳草粉、黄柏干浸膏等药材经加工而成的中成药片剂。本品味特异，具有化滞止泻功效。用于饮食不节或水土不服导致的食欲不振、恶心呕吐、腹胀腹泻、消化不良等症。处方中的老鹳草、黄柏具有一定的抑菌作用，若用常规法对其进行微生物限度检查，结果将不能真实反映样品的污染情况。为此，根据《中国药典》2010年版的有关规定，对康腹止泻片微生物限度检查方法进行验证，以确定其是否适用于本品的微生物限度检查，从而准确有效地检出样品中污染的微生物。验证表明，采用培养基稀释法对本品进行检查，可使污染的微生物能被顺利检出，常规法则可用于控制菌的检查。该方法简便、快捷、准确、可行，能有效控制康腹止泻片的质量，并可为同类药品的微生物限度检查法提供科学的实验依据。
1 仪器与试药
1.1 菌种
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）10123]，均购自中国药品生物制品检定所；黑曲霉（ATCC16404）购自广东省微生物研究所。
1.2 培养基
营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基。
1.3 供试品
康腹止泻片（批号41EA1），大幸药品株式会社。
2 方法与结果
2.1 菌液的制备
2.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌
取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，培养18～24 h；培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液。用于控制菌验证时制成每1 mL含菌数为<100 cfu的菌悬液。
2.1.2 白色念珠菌 取新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，培养24～48 h；培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～l00 cfu的菌悬液。
2.1.3 黑曲霉 取新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7 d，加入0.9%无菌氯化钠溶液3～5 mL，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出胞子悬液至无菌试管内，用0.05%（体积分数）聚山梨醇的0.9%（体积分数）无菌氯化钠溶液制成每l mL含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。
2.2 供试液的制备
取样品10 g，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，用匀浆仪打碎，摇匀，制成1∶10的供试液。
2.3 验证试验
验证实验所用培养基均按《中国药典》2010年版附录“微生物限度检查法”要求，进行培养基适用性检查，且均符合规定。
2.3.1 细菌、真菌及酵母菌计数（平皿法培养基稀释法） 在确定适合的检查方法后，验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
试验组：各取1∶10供试液1、0.5、0.2 mL和试验菌液1 mL，分别注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
菌液组：取试验菌液1 mL注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。
供试品对照组：各取1∶10供试液1、0.5、0.2 mL，按试验组操作，不加菌液，测定样品本底菌。
计算各试验菌株的回收率。
由结果可见：黑曲霉的回收试验，当供试液为1 mL·皿-1时，3次试验的回收率均即可达到70%以上；白色念珠菌当稀释至0.5 mL·皿-1时，3次试验的回收率达到70%以上；而大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌3个菌株的回收率试验，要稀释至0.2 mL·皿-1，3次验证的回收率才能均达到70%以上。因此本品的细菌计数、真菌及酵母菌计数均可用培养基稀释法检查：细菌计数用0.2 mL·皿-1，真菌及酵母菌计数用0.5 mL·皿-1。
2.3.2 控制菌检查法的验证 本品为含有药材粉末投料的口服制剂，控制菌应检查大肠埃希菌和大肠菌群，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为试验菌。
2.3.2.1 大肠埃希菌检查法的验证 取1∶10供试液10 mL及大肠埃希菌菌液1 mL加入100、200 mL的BL增菌培养基中，按大肠埃希菌的检查法进行检验。
2.3.2.2 大肠菌群检查法的验证 取1∶10供试液1 mL及大肠埃希菌菌液1 mL加入不少于15、30 mL的胆盐乳糖发酵培养基中，按大肠菌群的检查法进行检验。
由结果可知，试验组均检出大肠埃希菌，因此本制剂的大肠埃希菌和大肠菌群均可用常规法检查。
4 讨论
本品含有木馏油、阿仙粉、黄柏粉等成分，有一定的抑菌作用，验证试验结果证明，本品对革兰阳性菌有较强的抑制作用。药典收载的除去供试品抑菌作用的方法有培养基稀释法、薄膜过滤法、离心沉淀法等，或几法联用。由于本品是中成药，推断其抑菌作用不会太强，因此尝试采用培养基稀释法，通过扩大培养基的使用量，使供试品在培养基中稀释，结果各规定菌株的回收率均达到药典要求；控制菌则用常规法即能顺利检出试验菌。培养基稀释法操作简单，不需要特殊儀器设备，只需增加培养基量，即可很好地消除本制剂在试验条件下的抑菌作用问题，因此本方法简便快捷、准确有效，能很好地控制康腹止泻片的质量。
【参考文献】 [1] 许华玉，杜鹃，汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005，6（4）：262，46-47. [2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录79. [3] 林丽英，湛文青，饶春意.野牡丹止痢片微生物限度检查法的建立[J].中药材，2006，29（3）：299-302.
【关键词】 康腹止泻片；微生物限度检查；培养基稀释法
【中图分类号】R927.1
康腹止泻片是由木馏油、老鹳草粉、黄柏干浸膏等药材经加工而成的中成药片剂。本品味特异，具有化滞止泻功效。用于饮食不节或水土不服导致的食欲不振、恶心呕吐、腹胀腹泻、消化不良等症。处方中的老鹳草、黄柏具有一定的抑菌作用，若用常规法对其进行微生物限度检查，结果将不能真实反映样品的污染情况。为此，根据《中国药典》2010年版的有关规定，对康腹止泻片微生物限度检查方法进行验证，以确定其是否适用于本品的微生物限度检查，从而准确有效地检出样品中污染的微生物。验证表明，采用培养基稀释法对本品进行检查，可使污染的微生物能被顺利检出，常规法则可用于控制菌的检查。该方法简便、快捷、准确、可行，能有效控制康腹止泻片的质量，并可为同类药品的微生物限度检查法提供科学的实验依据。
1 仪器与试药
1.1 菌种
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）10123]，均购自中国药品生物制品检定所；黑曲霉（ATCC16404）购自广东省微生物研究所。
1.2 培养基
营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基。
1.3 供试品
康腹止泻片（批号41EA1），大幸药品株式会社。
2 方法与结果
2.1 菌液的制备
2.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌
取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，培养18～24 h；培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液。用于控制菌验证时制成每1 mL含菌数为<100 cfu的菌悬液。
2.1.2 白色念珠菌 取新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，培养24～48 h；培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～l00 cfu的菌悬液。
2.1.3 黑曲霉 取新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7 d，加入0.9%无菌氯化钠溶液3～5 mL，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出胞子悬液至无菌试管内，用0.05%（体积分数）聚山梨醇的0.9%（体积分数）无菌氯化钠溶液制成每l mL含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。
2.2 供试液的制备
取样品10 g，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，用匀浆仪打碎，摇匀，制成1∶10的供试液。
2.3 验证试验
验证实验所用培养基均按《中国药典》2010年版附录“微生物限度检查法”要求，进行培养基适用性检查，且均符合规定。
2.3.1 细菌、真菌及酵母菌计数（平皿法培养基稀释法） 在确定适合的检查方法后，验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
试验组：各取1∶10供试液1、0.5、0.2 mL和试验菌液1 mL，分别注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
菌液组：取试验菌液1 mL注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。
供试品对照组：各取1∶10供试液1、0.5、0.2 mL，按试验组操作，不加菌液，测定样品本底菌。
计算各试验菌株的回收率。
由结果可见：黑曲霉的回收试验，当供试液为1 mL·皿-1时，3次试验的回收率均即可达到70%以上；白色念珠菌当稀释至0.5 mL·皿-1时，3次试验的回收率达到70%以上；而大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌3个菌株的回收率试验，要稀释至0.2 mL·皿-1，3次验证的回收率才能均达到70%以上。因此本品的细菌计数、真菌及酵母菌计数均可用培养基稀释法检查：细菌计数用0.2 mL·皿-1，真菌及酵母菌计数用0.5 mL·皿-1。
2.3.2 控制菌检查法的验证 本品为含有药材粉末投料的口服制剂，控制菌应检查大肠埃希菌和大肠菌群，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为试验菌。
2.3.2.1 大肠埃希菌检查法的验证 取1∶10供试液10 mL及大肠埃希菌菌液1 mL加入100、200 mL的BL增菌培养基中，按大肠埃希菌的检查法进行检验。
2.3.2.2 大肠菌群检查法的验证 取1∶10供试液1 mL及大肠埃希菌菌液1 mL加入不少于15、30 mL的胆盐乳糖发酵培养基中，按大肠菌群的检查法进行检验。
由结果可知，试验组均检出大肠埃希菌，因此本制剂的大肠埃希菌和大肠菌群均可用常规法检查。
4 讨论
本品含有木馏油、阿仙粉、黄柏粉等成分，有一定的抑菌作用，验证试验结果证明，本品对革兰阳性菌有较强的抑制作用。药典收载的除去供试品抑菌作用的方法有培养基稀释法、薄膜过滤法、离心沉淀法等，或几法联用。由于本品是中成药，推断其抑菌作用不会太强，因此尝试采用培养基稀释法，通过扩大培养基的使用量，使供试品在培养基中稀释，结果各规定菌株的回收率均达到药典要求；控制菌则用常规法即能顺利检出试验菌。培养基稀释法操作简单，不需要特殊儀器设备，只需增加培养基量，即可很好地消除本制剂在试验条件下的抑菌作用问题，因此本方法简便快捷、准确有效，能很好地控制康腹止泻片的质量。
【参考文献】 [1] 许华玉，杜鹃，汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005，6（4）：262，46-47. [2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录79. [3] 林丽英，湛文青，饶春意.野牡丹止痢片微生物限度检查法的建立[J].中药材，2006，29（3）：299-302.