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摘 要：木本植物维管组织发育对木材形成意义重大。本研究利用石蜡切片法和光学显微技术，研究菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus）叶绿素缺失突变体（chlorophyll deficient mutant，CDM）幼苗不同部位的维管组织结构，观察及测量导管分子、筛管分子的孔径和密度等，分析了维管组织和形成层的特点。结果表明，CDM幼苗的根、茎、叶柄和叶主脉维管组织中的木质部和韧皮部的结构均发生改变。与正常苗相比，CDM幼苗中次生木质部导管分子和韧皮部筛管分子的孔径和面积减小，密度增大;根和茎维管组织中形成层厚度减小，层数减少;CDM茎中的维管组织相比于根显示出更强的抑制作用。本研究为进一步探索木本植物维管组织发育提供了新材料。
关键词：菠萝蜜;叶绿素缺失突变体;幼苗;维管组织
中图分类号：S667.8 文献标识码：A
Vascular Tissue Structure Analysis of Chlorophyll Deficient Mutant Seedlings from Artocarpus heterophyllus
DONG Junna1， WANG Zhixin1， YU Xudong1， WU Fanhua2， FU Ying1， LUO Jiajia3， CAI Zeping1*， ZHANG Han1
1. College of Forestry， Hainan University / Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 2. School of Life and Pharmaceutical Sciences， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
Abstract： The development of the vascular tissue in woody plants is of great significance to wood formation. In this paper， the method of paraffin section and optical microscopy were used to study the vascular tissue structure of different parts of chlorophyll deficient mutant （CDM） from Artocarpus heterophyllus. The pore size and density of vessel elements and sieve tube elements were observed and measured， and the characteristics of vascular tissue and cambium were analyzed. The result showed that the structure of the xylem and phloem in the vascular tissue of CDM seedlings’ roots， stems， petioles and leaf main vein were changed. Compared with the normal seedlings， the pore size and area of the secondary xylem vessel elements and phloem sieve vessel elements decreased and the density of those increased in CDM seedlings. The thickness of cambium decreased and the number of layers decreased in the vascular tissue of root and stem in CDM. The vascular tissue in the stems of CDM showed stronger inhibition compared with that in the roots. This study would provide new materials for further exploring vascular tissue development of woody plants.
Keywords： Artocarpus heterophyllus; chlorophyll deficient mutant; seedling; vascular tissue
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.018
葉绿素是植物光合作用的核心色素[1]。叶绿素缺失突变体（chlorophyll deficient mutant，CDM）植株无法正常进行光合作用[2]。CDM对揭示植物叶绿素合成与降解途径以及研究光合作用机制有重要意义。目前CDM的研究主要在草本植物中开展[3-7]，在木本植物中的研究较少，如橡木（Quercus petraea）[8]和茶树（Camellia sinensis）[9]等。 维管组织的出现极大地提高了植物体运输水分、矿质元素以及有机物的效率，同时木本植物维管组织发育对木材形成意义重大，一直是科学家们关注的焦点[10]。其发育经历了原分生组织、初生分生组织、初生维管组织以及次生维管组织四个阶段[11]。木质部和韧皮部是维管组织中的重要组成部分，导管分子和筛管分子在植株营养物质的运输上具有重要的意义。维管形成层的活动是使植物茎增粗的主要原因，而维管射线则具有横向运输水分和营养物质的作用[12-13]。
菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus）为桑科（Moraceae）木菠萝属（Artocarpus）的常绿乔木，是一种重要的热带果树以及优良木材树种，具有较高的经济和科研价值。付影等[14]对菠萝蜜CDM性状的研究结果显示，CDM中叶绿素含量发生变化，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量接近0，远小于正常苗。其株高与正常苗相比较低，且二者具有显著差异。主根的长度和正常苗相当，但侧根的密度小于正常苗，同时CDM的茎较为瘦弱。此外，CDM的含水量、蒸腾速率、脯氨酸含量均高于正常苗。近期的报道表明，菠萝蜜CDM初生生长茎和次生生长茎的转录组都已经完成了测序[15-16]。然而有关菠萝蜜CDM幼苗维管组织结构发生何种变化则尚未见报道。本研究以菠萝蜜CDM和正常幼苗为研究材料，利用石蜡切片法和光学显微技术对二者的维管组织结构进行分析，以期为木本植物维管组织的发育提供研究材料。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料采自海南省儋州市宝岛新村海南大学儋州校区大学生宿舍区（东经1095，北纬195），母株为具有隐性叶绿素缺失遗传病的植株，从母株上摘取成熟的菠萝蜜果实，挑选饱满的种粒，通过栽种分离出全株完全白化的CDM幼苗，选取正常幼苗为对照（CK）。
1.2 方法
1.2.1 种子萌发与幼苗的栽种 从成熟的菠萝蜜果实中剥离出种子，挑选饱满的种子置于含有营养土的花盆中，于当年6月在自然条件下栽种，给予其适宜的光照和充足的水分。分别取出土后25 d的幼苗CDM及CK各1株，将其根、茎和叶制成石蜡切片。
1.2.2 材料的固定与石蜡切片的制作 分别选取主根顶部和上胚轴基部作为根和茎的横切部位，叶柄和叶主脉均取自茎尖往下第3枚叶。参照Jagadish等[17]的方法，将材料浸入固定液 [50%酒精（90 mL），冰醋酸（5 mL），甲醛（5 mL）]中固定24 h。石蜡包埋后，在LEICA RM2245切片机上切片，切片厚度为10 μm。采取番红（2.5 g番红+100 mL 70%酒精）和固绿（1 g固绿+100 mL 95%酒精）对染，封片后使用LEICA DFC295光学显微镜观察和拍照。
1.2.3 指标测量 采用Image J软件对CDM及CK植株根、茎、叶的维管组织各项指标进行测量。其中的厚度定义为横截面直径方向上，以中心点对称的两侧目标部位的长度之和。相对厚度和相对面积分别为目标部位的厚度和面积与横切面总厚度和总面积的比值。厚度与相对厚度均为4组重复，面积和相对面积均为3组重复，其余各項指标均为8组重复。
1.3 数据处理
对所得各组数据均计算均值和标准差，采用F检验法对CDM与CK的各项指标进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 主根维管组织结构分析
CDM主根木质部的厚度和面积分别为1.28 mm和3.24 mm2，是CK（4.25 mm和22.54 mm2）的30.12%和14.37%（图1A、图1E、图1I、图1J）;CDM主根木质部的相对厚度和相对面积分别为0.45和0.50，是CK（0.61和0.58）的73.77%和86.21%（图1A、图1E、图1K、图1L），且二者的相对厚度和相对面积具有极显著差异，可见CDM主根木质部的发育受到抑制。此外，CDM主根的原生木质部导管分子孔径和面积分别为12.24 μm和131.50 μm2，是CK（16.33 μm和204.27 μm2）的74.95%和64.38%（图1B、图1F，表1）;后生木质部导管分子孔径和面积分别为21.61 μm和528.83 μm2，是CK（26.96 μm和605.31 μm2）的80.16%和87.37%（图1B、图1F，表1）;次生木质部导管分子孔径和面积分别为33.92 μm和1300.37 μm2，是CK（42.66 μm和1532.96 μm2）的79.51%和84.83%（图1C、图1G，表1）。CDM和CK上述各项指标除了后生木质部的孔径具有显著性差异外，其余均具有极显著差异。说明在CDM主根中，原生木质部导管分子变化最明显，次生木质部导管分子次之，后生木质部导管分子变化最小。CDM次生木质部导管分子的密度为14.79个/mm2，是CK（11.85个/mm2）的124.81%（图1C、图1G，表1）。因而，CDM次生木质部导管分子的密度增大。CDM主根中次生木质部导管分子的单个面积与密度的乘积为19 212.34 μm2/mm2，是CK（18 129.91 μm2/mm2）的105.97%（表1），二者尚未达显著差异。
CDM主根韧皮部的厚度和面积分别为0.45 mm和0.98 mm2，是CK（0.87 mm和6.40 mm2）的51.72%和15.31%（图A、图1E、图1I、图1J）。可见，CDM主根韧皮部的绝对厚度和面积均受到抑制。CDM主根韧皮部的相对厚度和相对面积分别为0.16和0.15，是CK（0.13和0.16）的123.08%和93.75%（图1A、图1E、图1K、图1L），且二者的相对厚度具有极显著差异，相对面积则没有显著性差异。可见CDM韧皮部的相对厚度得到了增加，而相对面积也没有显示出明显的抑制作用。说明突变体中韧皮部的发育表现出一定程度的促进作用。此外，CDM韧皮部筛管分子的孔径和面积分别为21.06 μm和381.19 μm2，是CK（25.75 μm和682.93 μm2）的81.79%和55.82%（图1D、图1H，表1），其密度为433.12个/mm2，是CK（226.68个/mm2）的191.07%（图1D、图1H，表1）。且二者的密度具有极显著差异。因而，CDM主根韧皮部筛管分子孔径和面积减小，密度增大。CDM主根韧皮部筛管分子的单个面积与密度的乘积为165 042.99 μm2/mm2，是CK（154 369.94 μm2/mm2）的106.91%（表1），二者未达显著差异。 CDM主根形成层的平均细胞层数为3.50层，是CK（6.38层）的54.86%，形成层厚度为52.07 μm，是CK（75.55 μm）的68.92%（图1D、图1H，表2）。可见CDM主根细胞层数减少且形成层较薄。
CDM及CK木射线的排列方式均为单列或多列（图1C、图1G，表3）。CDM木射线单列/多列的数目为24/19，是CK（46/26）的71.40%。CDM木射线单列和多列数量均小于CK，CDM的单列数量为24条，是CK（46条）的52.17%，多列数量为19条，是CK（26条）的73.08%（表3）。贯穿于CDM木质部及韧皮部的木射线长度和单列列宽分别为612.34 μm和27.44 μm，是CK（2084.38 μm和26.28 μm）的29.38%和104.41%（表3）。
CDM主根维管组织（包含木质部、形成层、韧皮部）的厚度和面积分别为1.77 mm和4.57 mm2，是CK（5.12 mm和30.76 mm2）的34.57%和14.86%（图1I、图1J）;CDM主根维管组织的相对厚度和相对面积分别为0.62和0.71，是CK（0.74和0.79）的83.78%和89.87%（图1K、图1L）。CDM主根横截面的厚度和面积分别为2.83 mm和6.43 mm2，是CK（6.93 mm和39.08 mm2）的40.84%和16.45%（图1A、图1E、图1I、图1J）。因此，CDM主根更为细弱。
2.2 茎段维管组织结构分析
CDM茎木质部的厚度和面积分别为0.33 mm和0.66 mm2，是CK（2.40 mm和9.44 mm2）的13.75%和6.99%（图2A、图2E、图2I、图2J）;CDM茎木质部的相对厚度和相对面积分别为0.13和0.12，是CK（0.51和0.50）的25.49%和24.00%（图2A、图2E、图2K、图2L）。且二者的相对厚度和相对面积均具有极显著差异，可见CDM幼苗茎木质部的发育受到了严重的抑制。CDM茎的原生木质部导管分子孔径和面积分别为15.97 μm和231.24 μm2，是CK（13.12 μm和146.74 μm2）的121.72%和157.58%（图2B、图2F，表4）;后生木质部导管分子孔径和面积分别为30.28 μm和661.96 μm2，是CK（22.72 μm和356.40 μm2）的133.27%和185.74%（图2B、图2F，表4），可见在CDM茎中，原生和后生木质部导管分子的孔径和面积都增大。次生木质部中导管分子孔径和面积分别为24.08 μm和879.66 μm2，是CK（44.13 μm和1423.17 μm2）的54.57%和61.81%（图2C、图2G，表4），可见，在CDM茎中次生木质部导管分子的孔径和面积均减小。
CDM次生木质部导管分子的密度为64.93个/mm2，是CK（27.89个/mm2）的232.81%（图2C、图2G，表4），可见CDM茎中次生木质部导管分子的密度增大。CDM和CK以上各项指标均具有极显著差异。CDM茎中次生木质部导管分子的单个面积与密度的乘积为57 009.49 μm2/mm2，是CK（39 816.04 μm2/mm2）的143.18%，且二者具有极显著差异（表4），说明CDM茎中次生木质部导管分子在木质部中的占比出现异常。
CDM茎韧皮部的厚度和面积分别为0.18 mm和0.46 mm2，是CK（0.55 mm和3.01 mm2）的32.73%和15.28%（图2A、图2E、图2I、图2J）;CDM茎韧皮部的相对厚度和相对面积分别为0.07和0.08，是CK（0.12和0.16）的58.33%和50.00%（图2A、图2E、图2K、图2L），可见CDM茎韧皮部的发育受到了严重抑制。CDM茎韧皮部筛管分子的孔径和面积分别为14.92 μm和256.15 μm2，是CK（27.82 μm和540.32 μm2）的53.63%和47.41%（图2D、图2H，表4），密度为721.20个/mm2，是CK（454.97个/mm2）的158.52%（图2D、图2H，表4）。可见CDM茎韧皮部筛管分子的孔径和面积均减小，而密度增大。CDM茎中韧皮部筛管分子的单个面积与密度的乘积为184 024.40 μm2/mm2，是CK（246 576.73 μm2/mm2）的74.63%，且二者具有极显著差异（表4），说明CDM茎中韧皮部筛管分子在韧皮部中的占比减小。
CDM茎形成层的平均细胞层数为4.00层，是CK（5.38层）的74.35%，厚度为61.82 μm，是CK（87.41 μm）的70.72%（图2D、图2H，表5）。和根一样，CDM茎形成层的发育也受到抑制。
CDM茎的维管组织厚度和面积分别为0.60 mm和1.62 mm2，是CK（2.95 mm和13.53 mm2）的20.34%和11.97%（图2A、图2E、图2I、图2J）;
其相对厚度和相对面积分别为0.23和0.29，是CK（0.63和0.71）的36.51%和40.85%（图2A、图2E、图2K、图2L）。CDM茎的厚度和面积分别为2.57 mm和5.55 mm2，是CK（4.73 mm和18.95 mm2）的54.33%和29.29%（图2A、图2E、图2I、图2J）。CDM与CK维管组织的各项指标均具有极显著差异，可见CDM茎中维管组织的发育出现明显的变化，茎更加纤细。与根相比（图1K、图1L），茎中維管组织受到的抑制更为严重。
2.3 叶维管组织结构分析
2.3.1 叶柄维管组织结构分析 CDM叶柄木质部的厚度和面积分别为0.19 mm和0.05 mm2，是CK（0.41 mm和0.23 mm2）的46.34%和21.74%（图3A、图3E、图3I、图3J），且二者的厚度和面积均具极显著差异。可见CDM叶柄木质部的发育受到严重抑制。CDM叶柄原生木质部导管分子的孔径和面积分别为6.89 μm和63.96 μm2，是CK（10.75 μm和113.65 μm2）的64.09%和56.28%（图3B、图3F，表6）。后生木质部导管分子的孔径和面积分别为16.13 μm和279.67 μm2，是CK（20.97 μm和480.17 μm2）的76.92%和58.24%（图3B、图3F，表6）。可见，CDM叶柄导管分子的孔径和面积都减小了，且原生木质部导管分子变化较大。 CDM叶柄韧皮部的厚度和面积分别为0.05 mm和0.04 mm2，是CK（0.08 mm和0.07 mm2）的62.50%和57.14%（图3B、图3F、图3I、图3J），可见CDM叶柄韧皮部的发育受到抑制。CDM叶柄初生韧皮部筛管分子的孔径和面积分别为6.44 μm和41.76 μm2，是CK（7.96 μm和60.43 μm2）的80.90%和69.10%（图3B、图3F，表6）。可见，CDM叶柄韧皮部筛管分子的孔径和面积均减小。
CDM叶柄维管组织厚度和面积分别为0.28 mm和0.14 mm2，是CK（0.48 mm和0.35 mm2）的58.33%和40.00%。其叶柄厚度和面积分别为1.27 mm和1.27 mm2，是CK（1.90 mm和2.96 mm2）的66.84%和42.91%。可见CDM叶柄维管组织的发育受到抑制，叶柄变得更为细弱（图3A、图3E、图3I、图3J）。
2.3.2 叶主脉维管组织结构分析 CDM叶主脉木质部的厚度和面积分别为0.02 mm和0.03 mm2，是CK（0.04 mm和0.24 mm2）的50.00%和12.50%。
可见CDM叶主脉的木质部发生改变（图3C、图3G、图3K、图3L）。同时CDM叶主脉木质部导管分子的发育也发生了变化。首先，原生木质部导管分子的孔径和面积分别为9.74 μm和116.92 μm2，是CK（16.62 μm和312.37 μm2）的58.60%和37.43%（图3D、图3H，表6）。其次，后生木质部导管分子的孔径和面积分别为20.28 μm和279.78 μm2，是CK（32.13 μm和777.34 μm2）的63.12%和35.99%（图3D、图3H，表6）。可见CDM叶主脉导管分子的孔径和面积减小。
CDM叶主脉韧皮部的厚度和面积分别为0.01 mm和0.02 mm2，是CK（0.02 mm和0.14 mm2）的50.00%和14.29%（图3D、图3H、图3K、图3L）。其初生韧皮部筛管分子的孔径和面积分别为5.72 μm和33.78 μm2，是CK（7.11 μm和47.83 μm2）的80.45%和70.63%（图3D、图3H，表6），可见CDM叶主脉韧皮部筛管分子的发育受到了抑制。
CDM叶主脉的维管组织厚度和面积分别为0.04 mm和0.09 mm2，是CK（0.05 mm和0.38 mm2）的80.00%和23.68%。其叶主脉厚度和面积分别为0.29 mm和0.73 mm2，是CK（0.46 mm和1.67 mm2）的63.04%和43.71%。可见CDM叶主脉的维管组织出现了较大变化，叶主脉变得更为细弱（图3C、图3G、图3K、图3L）。
3 讨论
本研究结果显示，CDM茎中维管组织受到的抑制作用远大于根。使用14CO2 标记法检测柑橘（Citrus reticulata Blanco）中光合产物的卸载情况，结果显示幼苗期的植株光合产物优先向根部运输[18]。马尾松（Pinus massoniana Lamb）幼苗光合产物的运输与分配情况也表明：新合成的光合产物在各器官中的积累量表现为根多于茎[19]。大量的研究表明：光合产物的这一分配规律有利于植物幼苗阶段的生长[20-22]。同一植物的不同器官之间对同一胁迫的反应有很大差异[23]。CDM由于叶绿素缺乏，光合作用效率下降，无法同时满足根和茎对能量的需求，因此只能先保证根部营养的供应。这可能是导致茎中维管组织受到的抑制较为严重的原因之一。
CDM茎中原生木质部、后生木质部导管分子的孔径和面积均受到一定程度的抑制，可见，CDM茎的初生生长发生了改变。郑李婷等[15]对菠萝蜜初生生长茎中转录组的数据进行KEGG功能注释及GO富集分析后，发现CDM初生生长茎中糖代谢基因大部分下调;同时上调基因显著富集在翻译途径。糖是植物生长发育的能量来源和物质基础，同时作为一种信号分子调控植物的生长、发育、成熟和衰老等许多过程[24]。CDM叶绿素缺乏，光合作用受到阻碍，因此光合产物中的有机物合成减少，糖代谢减慢能量供应不足[25]，这可能是引起茎初生生长发育迟缓的一个原因。CDM初生生长发育滞后，能量调运不足，加之与糖相关的调控作用可能出现异常，无法完成正常的翻译转录等生命活动。这与草本植物小麦（Triticum aestivum）[26]和水稻（Oryza sativa）[27]CDM相关分子机制的研究结果相似。
本研究中，萌发25 d的菠萝蜜幼苗，其根和茎已开始进行次生生长。CDM茎次生木质部的厚度与面积均受到抑制，且抑制作用远大于根。次生木质部中的导管分子出现孔径和面积减小、密度增大的异常现象。茎中导管分子发育异常很可能是付影等[14]报道的菠萝蜜CDM幼苗茎中含水率异常的一个原因。近期的报道表明，CDM次生生长茎中上调表达的基因在KEGG通路中分别于碳水化合物、蛋白质和氨基酸代谢以及脂质代谢等相关途径显著富集[16]。這暗示了CDM茎次生生长中基础代谢出现异常，这可能是其次生木质部受到抑制的原因之一。
韧皮部是植株内运输营养物质的重要部位。分别比较CDM根与茎中韧皮部结构的变化，对于根中的韧皮部，CDM的相对厚度显著增加，相对面积变化不显著;而对于茎中的韧皮部，CDM的相对厚度和相对面积均显示出明显的抑制作用。根和茎中韧皮部不同的变化表明菠萝蜜幼苗时期维管组织的发育除了与木质部有很大的关系外，与韧皮部的发育情况也有一定的关系。韧皮部具有卸载运输叶片光合产物的作用[28]，CDM的光合作用受阻，对韧皮部运输的需求也相应地受到影响，韧皮部发育缓慢和滞后可能是CDM对其光合作用异常的一种响应。
目前关于木本植物CDM的研究较少，本研究利用考察中发现的CDM进行研究，从解剖结构报道了CDM幼苗维管组织的变化，为其分子调控机制的探究提供形态学依据。 参考文献
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责任编辑：沈德发
关键词：菠萝蜜;叶绿素缺失突变体;幼苗;维管组织
中图分类号：S667.8 文献标识码：A
Vascular Tissue Structure Analysis of Chlorophyll Deficient Mutant Seedlings from Artocarpus heterophyllus
DONG Junna1， WANG Zhixin1， YU Xudong1， WU Fanhua2， FU Ying1， LUO Jiajia3， CAI Zeping1*， ZHANG Han1
1. College of Forestry， Hainan University / Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 2. School of Life and Pharmaceutical Sciences， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
Abstract： The development of the vascular tissue in woody plants is of great significance to wood formation. In this paper， the method of paraffin section and optical microscopy were used to study the vascular tissue structure of different parts of chlorophyll deficient mutant （CDM） from Artocarpus heterophyllus. The pore size and density of vessel elements and sieve tube elements were observed and measured， and the characteristics of vascular tissue and cambium were analyzed. The result showed that the structure of the xylem and phloem in the vascular tissue of CDM seedlings’ roots， stems， petioles and leaf main vein were changed. Compared with the normal seedlings， the pore size and area of the secondary xylem vessel elements and phloem sieve vessel elements decreased and the density of those increased in CDM seedlings. The thickness of cambium decreased and the number of layers decreased in the vascular tissue of root and stem in CDM. The vascular tissue in the stems of CDM showed stronger inhibition compared with that in the roots. This study would provide new materials for further exploring vascular tissue development of woody plants.
Keywords： Artocarpus heterophyllus; chlorophyll deficient mutant; seedling; vascular tissue
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.018
葉绿素是植物光合作用的核心色素[1]。叶绿素缺失突变体（chlorophyll deficient mutant，CDM）植株无法正常进行光合作用[2]。CDM对揭示植物叶绿素合成与降解途径以及研究光合作用机制有重要意义。目前CDM的研究主要在草本植物中开展[3-7]，在木本植物中的研究较少，如橡木（Quercus petraea）[8]和茶树（Camellia sinensis）[9]等。 维管组织的出现极大地提高了植物体运输水分、矿质元素以及有机物的效率，同时木本植物维管组织发育对木材形成意义重大，一直是科学家们关注的焦点[10]。其发育经历了原分生组织、初生分生组织、初生维管组织以及次生维管组织四个阶段[11]。木质部和韧皮部是维管组织中的重要组成部分，导管分子和筛管分子在植株营养物质的运输上具有重要的意义。维管形成层的活动是使植物茎增粗的主要原因，而维管射线则具有横向运输水分和营养物质的作用[12-13]。
菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus）为桑科（Moraceae）木菠萝属（Artocarpus）的常绿乔木，是一种重要的热带果树以及优良木材树种，具有较高的经济和科研价值。付影等[14]对菠萝蜜CDM性状的研究结果显示，CDM中叶绿素含量发生变化，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量接近0，远小于正常苗。其株高与正常苗相比较低，且二者具有显著差异。主根的长度和正常苗相当，但侧根的密度小于正常苗，同时CDM的茎较为瘦弱。此外，CDM的含水量、蒸腾速率、脯氨酸含量均高于正常苗。近期的报道表明，菠萝蜜CDM初生生长茎和次生生长茎的转录组都已经完成了测序[15-16]。然而有关菠萝蜜CDM幼苗维管组织结构发生何种变化则尚未见报道。本研究以菠萝蜜CDM和正常幼苗为研究材料，利用石蜡切片法和光学显微技术对二者的维管组织结构进行分析，以期为木本植物维管组织的发育提供研究材料。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料采自海南省儋州市宝岛新村海南大学儋州校区大学生宿舍区（东经1095，北纬195），母株为具有隐性叶绿素缺失遗传病的植株，从母株上摘取成熟的菠萝蜜果实，挑选饱满的种粒，通过栽种分离出全株完全白化的CDM幼苗，选取正常幼苗为对照（CK）。
1.2 方法
1.2.1 种子萌发与幼苗的栽种 从成熟的菠萝蜜果实中剥离出种子，挑选饱满的种子置于含有营养土的花盆中，于当年6月在自然条件下栽种，给予其适宜的光照和充足的水分。分别取出土后25 d的幼苗CDM及CK各1株，将其根、茎和叶制成石蜡切片。
1.2.2 材料的固定与石蜡切片的制作 分别选取主根顶部和上胚轴基部作为根和茎的横切部位，叶柄和叶主脉均取自茎尖往下第3枚叶。参照Jagadish等[17]的方法，将材料浸入固定液 [50%酒精（90 mL），冰醋酸（5 mL），甲醛（5 mL）]中固定24 h。石蜡包埋后，在LEICA RM2245切片机上切片，切片厚度为10 μm。采取番红（2.5 g番红+100 mL 70%酒精）和固绿（1 g固绿+100 mL 95%酒精）对染，封片后使用LEICA DFC295光学显微镜观察和拍照。
1.2.3 指标测量 采用Image J软件对CDM及CK植株根、茎、叶的维管组织各项指标进行测量。其中的厚度定义为横截面直径方向上，以中心点对称的两侧目标部位的长度之和。相对厚度和相对面积分别为目标部位的厚度和面积与横切面总厚度和总面积的比值。厚度与相对厚度均为4组重复，面积和相对面积均为3组重复，其余各項指标均为8组重复。
1.3 数据处理
对所得各组数据均计算均值和标准差，采用F检验法对CDM与CK的各项指标进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 主根维管组织结构分析
CDM主根木质部的厚度和面积分别为1.28 mm和3.24 mm2，是CK（4.25 mm和22.54 mm2）的30.12%和14.37%（图1A、图1E、图1I、图1J）;CDM主根木质部的相对厚度和相对面积分别为0.45和0.50，是CK（0.61和0.58）的73.77%和86.21%（图1A、图1E、图1K、图1L），且二者的相对厚度和相对面积具有极显著差异，可见CDM主根木质部的发育受到抑制。此外，CDM主根的原生木质部导管分子孔径和面积分别为12.24 μm和131.50 μm2，是CK（16.33 μm和204.27 μm2）的74.95%和64.38%（图1B、图1F，表1）;后生木质部导管分子孔径和面积分别为21.61 μm和528.83 μm2，是CK（26.96 μm和605.31 μm2）的80.16%和87.37%（图1B、图1F，表1）;次生木质部导管分子孔径和面积分别为33.92 μm和1300.37 μm2，是CK（42.66 μm和1532.96 μm2）的79.51%和84.83%（图1C、图1G，表1）。CDM和CK上述各项指标除了后生木质部的孔径具有显著性差异外，其余均具有极显著差异。说明在CDM主根中，原生木质部导管分子变化最明显，次生木质部导管分子次之，后生木质部导管分子变化最小。CDM次生木质部导管分子的密度为14.79个/mm2，是CK（11.85个/mm2）的124.81%（图1C、图1G，表1）。因而，CDM次生木质部导管分子的密度增大。CDM主根中次生木质部导管分子的单个面积与密度的乘积为19 212.34 μm2/mm2，是CK（18 129.91 μm2/mm2）的105.97%（表1），二者尚未达显著差异。
CDM主根韧皮部的厚度和面积分别为0.45 mm和0.98 mm2，是CK（0.87 mm和6.40 mm2）的51.72%和15.31%（图A、图1E、图1I、图1J）。可见，CDM主根韧皮部的绝对厚度和面积均受到抑制。CDM主根韧皮部的相对厚度和相对面积分别为0.16和0.15，是CK（0.13和0.16）的123.08%和93.75%（图1A、图1E、图1K、图1L），且二者的相对厚度具有极显著差异，相对面积则没有显著性差异。可见CDM韧皮部的相对厚度得到了增加，而相对面积也没有显示出明显的抑制作用。说明突变体中韧皮部的发育表现出一定程度的促进作用。此外，CDM韧皮部筛管分子的孔径和面积分别为21.06 μm和381.19 μm2，是CK（25.75 μm和682.93 μm2）的81.79%和55.82%（图1D、图1H，表1），其密度为433.12个/mm2，是CK（226.68个/mm2）的191.07%（图1D、图1H，表1）。且二者的密度具有极显著差异。因而，CDM主根韧皮部筛管分子孔径和面积减小，密度增大。CDM主根韧皮部筛管分子的单个面积与密度的乘积为165 042.99 μm2/mm2，是CK（154 369.94 μm2/mm2）的106.91%（表1），二者未达显著差异。 CDM主根形成层的平均细胞层数为3.50层，是CK（6.38层）的54.86%，形成层厚度为52.07 μm，是CK（75.55 μm）的68.92%（图1D、图1H，表2）。可见CDM主根细胞层数减少且形成层较薄。
CDM及CK木射线的排列方式均为单列或多列（图1C、图1G，表3）。CDM木射线单列/多列的数目为24/19，是CK（46/26）的71.40%。CDM木射线单列和多列数量均小于CK，CDM的单列数量为24条，是CK（46条）的52.17%，多列数量为19条，是CK（26条）的73.08%（表3）。贯穿于CDM木质部及韧皮部的木射线长度和单列列宽分别为612.34 μm和27.44 μm，是CK（2084.38 μm和26.28 μm）的29.38%和104.41%（表3）。
CDM主根维管组织（包含木质部、形成层、韧皮部）的厚度和面积分别为1.77 mm和4.57 mm2，是CK（5.12 mm和30.76 mm2）的34.57%和14.86%（图1I、图1J）;CDM主根维管组织的相对厚度和相对面积分别为0.62和0.71，是CK（0.74和0.79）的83.78%和89.87%（图1K、图1L）。CDM主根横截面的厚度和面积分别为2.83 mm和6.43 mm2，是CK（6.93 mm和39.08 mm2）的40.84%和16.45%（图1A、图1E、图1I、图1J）。因此，CDM主根更为细弱。
2.2 茎段维管组织结构分析
CDM茎木质部的厚度和面积分别为0.33 mm和0.66 mm2，是CK（2.40 mm和9.44 mm2）的13.75%和6.99%（图2A、图2E、图2I、图2J）;CDM茎木质部的相对厚度和相对面积分别为0.13和0.12，是CK（0.51和0.50）的25.49%和24.00%（图2A、图2E、图2K、图2L）。且二者的相对厚度和相对面积均具有极显著差异，可见CDM幼苗茎木质部的发育受到了严重的抑制。CDM茎的原生木质部导管分子孔径和面积分别为15.97 μm和231.24 μm2，是CK（13.12 μm和146.74 μm2）的121.72%和157.58%（图2B、图2F，表4）;后生木质部导管分子孔径和面积分别为30.28 μm和661.96 μm2，是CK（22.72 μm和356.40 μm2）的133.27%和185.74%（图2B、图2F，表4），可见在CDM茎中，原生和后生木质部导管分子的孔径和面积都增大。次生木质部中导管分子孔径和面积分别为24.08 μm和879.66 μm2，是CK（44.13 μm和1423.17 μm2）的54.57%和61.81%（图2C、图2G，表4），可见，在CDM茎中次生木质部导管分子的孔径和面积均减小。
CDM次生木质部导管分子的密度为64.93个/mm2，是CK（27.89个/mm2）的232.81%（图2C、图2G，表4），可见CDM茎中次生木质部导管分子的密度增大。CDM和CK以上各项指标均具有极显著差异。CDM茎中次生木质部导管分子的单个面积与密度的乘积为57 009.49 μm2/mm2，是CK（39 816.04 μm2/mm2）的143.18%，且二者具有极显著差异（表4），说明CDM茎中次生木质部导管分子在木质部中的占比出现异常。
CDM茎韧皮部的厚度和面积分别为0.18 mm和0.46 mm2，是CK（0.55 mm和3.01 mm2）的32.73%和15.28%（图2A、图2E、图2I、图2J）;CDM茎韧皮部的相对厚度和相对面积分别为0.07和0.08，是CK（0.12和0.16）的58.33%和50.00%（图2A、图2E、图2K、图2L），可见CDM茎韧皮部的发育受到了严重抑制。CDM茎韧皮部筛管分子的孔径和面积分别为14.92 μm和256.15 μm2，是CK（27.82 μm和540.32 μm2）的53.63%和47.41%（图2D、图2H，表4），密度为721.20个/mm2，是CK（454.97个/mm2）的158.52%（图2D、图2H，表4）。可见CDM茎韧皮部筛管分子的孔径和面积均减小，而密度增大。CDM茎中韧皮部筛管分子的单个面积与密度的乘积为184 024.40 μm2/mm2，是CK（246 576.73 μm2/mm2）的74.63%，且二者具有极显著差异（表4），说明CDM茎中韧皮部筛管分子在韧皮部中的占比减小。
CDM茎形成层的平均细胞层数为4.00层，是CK（5.38层）的74.35%，厚度为61.82 μm，是CK（87.41 μm）的70.72%（图2D、图2H，表5）。和根一样，CDM茎形成层的发育也受到抑制。
CDM茎的维管组织厚度和面积分别为0.60 mm和1.62 mm2，是CK（2.95 mm和13.53 mm2）的20.34%和11.97%（图2A、图2E、图2I、图2J）;
其相对厚度和相对面积分别为0.23和0.29，是CK（0.63和0.71）的36.51%和40.85%（图2A、图2E、图2K、图2L）。CDM茎的厚度和面积分别为2.57 mm和5.55 mm2，是CK（4.73 mm和18.95 mm2）的54.33%和29.29%（图2A、图2E、图2I、图2J）。CDM与CK维管组织的各项指标均具有极显著差异，可见CDM茎中维管组织的发育出现明显的变化，茎更加纤细。与根相比（图1K、图1L），茎中維管组织受到的抑制更为严重。
2.3 叶维管组织结构分析
2.3.1 叶柄维管组织结构分析 CDM叶柄木质部的厚度和面积分别为0.19 mm和0.05 mm2，是CK（0.41 mm和0.23 mm2）的46.34%和21.74%（图3A、图3E、图3I、图3J），且二者的厚度和面积均具极显著差异。可见CDM叶柄木质部的发育受到严重抑制。CDM叶柄原生木质部导管分子的孔径和面积分别为6.89 μm和63.96 μm2，是CK（10.75 μm和113.65 μm2）的64.09%和56.28%（图3B、图3F，表6）。后生木质部导管分子的孔径和面积分别为16.13 μm和279.67 μm2，是CK（20.97 μm和480.17 μm2）的76.92%和58.24%（图3B、图3F，表6）。可见，CDM叶柄导管分子的孔径和面积都减小了，且原生木质部导管分子变化较大。 CDM叶柄韧皮部的厚度和面积分别为0.05 mm和0.04 mm2，是CK（0.08 mm和0.07 mm2）的62.50%和57.14%（图3B、图3F、图3I、图3J），可见CDM叶柄韧皮部的发育受到抑制。CDM叶柄初生韧皮部筛管分子的孔径和面积分别为6.44 μm和41.76 μm2，是CK（7.96 μm和60.43 μm2）的80.90%和69.10%（图3B、图3F，表6）。可见，CDM叶柄韧皮部筛管分子的孔径和面积均减小。
CDM叶柄维管组织厚度和面积分别为0.28 mm和0.14 mm2，是CK（0.48 mm和0.35 mm2）的58.33%和40.00%。其叶柄厚度和面积分别为1.27 mm和1.27 mm2，是CK（1.90 mm和2.96 mm2）的66.84%和42.91%。可见CDM叶柄维管组织的发育受到抑制，叶柄变得更为细弱（图3A、图3E、图3I、图3J）。
2.3.2 叶主脉维管组织结构分析 CDM叶主脉木质部的厚度和面积分别为0.02 mm和0.03 mm2，是CK（0.04 mm和0.24 mm2）的50.00%和12.50%。
可见CDM叶主脉的木质部发生改变（图3C、图3G、图3K、图3L）。同时CDM叶主脉木质部导管分子的发育也发生了变化。首先，原生木质部导管分子的孔径和面积分别为9.74 μm和116.92 μm2，是CK（16.62 μm和312.37 μm2）的58.60%和37.43%（图3D、图3H，表6）。其次，后生木质部导管分子的孔径和面积分别为20.28 μm和279.78 μm2，是CK（32.13 μm和777.34 μm2）的63.12%和35.99%（图3D、图3H，表6）。可见CDM叶主脉导管分子的孔径和面积减小。
CDM叶主脉韧皮部的厚度和面积分别为0.01 mm和0.02 mm2，是CK（0.02 mm和0.14 mm2）的50.00%和14.29%（图3D、图3H、图3K、图3L）。其初生韧皮部筛管分子的孔径和面积分别为5.72 μm和33.78 μm2，是CK（7.11 μm和47.83 μm2）的80.45%和70.63%（图3D、图3H，表6），可见CDM叶主脉韧皮部筛管分子的发育受到了抑制。
CDM叶主脉的维管组织厚度和面积分别为0.04 mm和0.09 mm2，是CK（0.05 mm和0.38 mm2）的80.00%和23.68%。其叶主脉厚度和面积分别为0.29 mm和0.73 mm2，是CK（0.46 mm和1.67 mm2）的63.04%和43.71%。可见CDM叶主脉的维管组织出现了较大变化，叶主脉变得更为细弱（图3C、图3G、图3K、图3L）。
3 讨论
本研究结果显示，CDM茎中维管组织受到的抑制作用远大于根。使用14CO2 标记法检测柑橘（Citrus reticulata Blanco）中光合产物的卸载情况，结果显示幼苗期的植株光合产物优先向根部运输[18]。马尾松（Pinus massoniana Lamb）幼苗光合产物的运输与分配情况也表明：新合成的光合产物在各器官中的积累量表现为根多于茎[19]。大量的研究表明：光合产物的这一分配规律有利于植物幼苗阶段的生长[20-22]。同一植物的不同器官之间对同一胁迫的反应有很大差异[23]。CDM由于叶绿素缺乏，光合作用效率下降，无法同时满足根和茎对能量的需求，因此只能先保证根部营养的供应。这可能是导致茎中维管组织受到的抑制较为严重的原因之一。
CDM茎中原生木质部、后生木质部导管分子的孔径和面积均受到一定程度的抑制，可见，CDM茎的初生生长发生了改变。郑李婷等[15]对菠萝蜜初生生长茎中转录组的数据进行KEGG功能注释及GO富集分析后，发现CDM初生生长茎中糖代谢基因大部分下调;同时上调基因显著富集在翻译途径。糖是植物生长发育的能量来源和物质基础，同时作为一种信号分子调控植物的生长、发育、成熟和衰老等许多过程[24]。CDM叶绿素缺乏，光合作用受到阻碍，因此光合产物中的有机物合成减少，糖代谢减慢能量供应不足[25]，这可能是引起茎初生生长发育迟缓的一个原因。CDM初生生长发育滞后，能量调运不足，加之与糖相关的调控作用可能出现异常，无法完成正常的翻译转录等生命活动。这与草本植物小麦（Triticum aestivum）[26]和水稻（Oryza sativa）[27]CDM相关分子机制的研究结果相似。
本研究中，萌发25 d的菠萝蜜幼苗，其根和茎已开始进行次生生长。CDM茎次生木质部的厚度与面积均受到抑制，且抑制作用远大于根。次生木质部中的导管分子出现孔径和面积减小、密度增大的异常现象。茎中导管分子发育异常很可能是付影等[14]报道的菠萝蜜CDM幼苗茎中含水率异常的一个原因。近期的报道表明，CDM次生生长茎中上调表达的基因在KEGG通路中分别于碳水化合物、蛋白质和氨基酸代谢以及脂质代谢等相关途径显著富集[16]。這暗示了CDM茎次生生长中基础代谢出现异常，这可能是其次生木质部受到抑制的原因之一。
韧皮部是植株内运输营养物质的重要部位。分别比较CDM根与茎中韧皮部结构的变化，对于根中的韧皮部，CDM的相对厚度显著增加，相对面积变化不显著;而对于茎中的韧皮部，CDM的相对厚度和相对面积均显示出明显的抑制作用。根和茎中韧皮部不同的变化表明菠萝蜜幼苗时期维管组织的发育除了与木质部有很大的关系外，与韧皮部的发育情况也有一定的关系。韧皮部具有卸载运输叶片光合产物的作用[28]，CDM的光合作用受阻，对韧皮部运输的需求也相应地受到影响，韧皮部发育缓慢和滞后可能是CDM对其光合作用异常的一种响应。
目前关于木本植物CDM的研究较少，本研究利用考察中发现的CDM进行研究，从解剖结构报道了CDM幼苗维管组织的变化，为其分子调控机制的探究提供形态学依据。 参考文献
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