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【摘要】 目的 研究幽门螺杆菌感染阳性的胃癌患者中细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）基因多态性与胃癌的相关性。方法 用ELISA方法检测了115例胃癌与112例慢性胃炎患者（对照组）Hp感染，同时采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测上述人群中细胞周期蛋白 D1基因第870位核苷酸A/G（A870G）多态性。结果 幽门螺杆菌感染阳性患者中，胃癌组细胞周期蛋白D1 基因A等位基因的频率为71.0％。而对照组为45.9%。将A等位基因视为暴露因素，其使个体患胃癌的相对风险度（OR）为2.89，95％可信区间（CI）为1.80～4.62。结论 有Hp感染的胃癌患者中，细胞周期蛋白 D1基因中AA基因型为高危基因。
【关键词】 胃癌； 细胞周期蛋白D1； 基因多态性； 幽门螺杆菌
Analysis of cyclin D1 Gene polymorphism of patients with helicobacter pylori infection and gastric cancer FANG Zhi-jun，LIU Yao-huang.The Fourth Hospital of Huangshi City, Huangshi，435006，China
【Abstract】 Objective To study the associativity between gastric cance and cyclin D1 gene polymorphism in patients with gastric cancer infected by Helicobacter pylori. Methods115 cases of gastric cancer and 112 cases of chronic gastritis (control group) were detected for Helicobacter pylori by ELISA and the cyclin D1 gene 870-nucleotide A/G (A870G) polymorphism by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR- RFLP).ResultsIn the group of gastric cancer with infected by Helicobacter pylori,the A allele frequencies of the cyclin D1 gene was 71.0% ,and in the control group,the A allele frequencies of the cyclin D1 gene was 45.9%. As A allele as a exposure factor, the odds ratio (OR) suffering gastric cancer was 2.28 and the 95% confidence interval（CI） was 1.80-4.62.ConclusionThe AA genetype in cyclin D1gene was the high risk factor for gastric cancer with Helicobacter pylori. Infection.
【Key words】gastric cancer; cyclin D1; gene polymorphism; Helicobacter pylori
肿瘤的发生与个体的遗传因素相关。近来研究表明，细胞周期蛋白D1基因多态性与胃癌的发生发展的关系密切，而幽门螺杆菌（Helicobacter，pylori,Hp）感染则可能是胃癌发生的启动因素和促进因素［1］。本实验在HP感染阳性的胃癌患者中，对其细胞周期蛋白D1基因的多态性进行了研究，以探讨HP感染的胃癌患者中细胞周期蛋白D1基因中的高危基因。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本研究将受试者分为Hp阳性组和Hp阴性组，每组又分胃癌组和对照组。所有受试者均取血测Hp抗体滴度，同时进行胃镜检查，于胃体、胃角及胃窦和病灶处取胃黏膜活检进行病理组织学诊断。其中115例诊断为非贲门胃癌患者，均来自黄石市第四医院和武汉市第三医院住院患者，男72例，女43例，年龄24～78岁，平均（58.3±12.1）岁；对照组112例诊断为慢性非萎缩性胃炎，为同期住院患者，男68例，女44例，年龄22～71岁，平均（57.8±10.5）岁。
1.2 研究方法 采集受试者空腹静脉血5 ml，其中3 ml储于EDTA抗凝的试管中用于提取基因组DNA，2 ml用于分离血清。应用ELISA方法严格按试剂盒操作说明检测血清Hp IgG型抗体，Hp抗体检测试剂盒购自福建三明蓝波生物技术研究所，产品批号为200803019。试验阳性者定义为Hp感染。应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术扩增细胞周期蛋白D1基因片段，以观察其第870位核苷酸A/G（A870G）多态性。PCR引物序列为：上游引物：5′-GTGAAGTTCATTTCCAATCCGC-3′，下游引物：5′-GGGACATCACCCTCACT TA C -3′。引物由上海生工生物有限公司合成及纯化，PCR试剂盒购于华美公司产品，产品批号为20081007。
1.3 统计学分析 应用SPSS统计软件包处理数据，先计算各组基因型频率及等位基因频率，确定其符合Hardy-Weinberg平衡后，通过χ2检验进行组间频率比较，以P<0.05为差异有统计学意义。以比值（OR）及其95%可信区间（CI）表示相对危险度。
2 结果
2.1 Hp感染状态与细胞周期蛋白D1基因型多态性分析 在共227名受试者中，Hp感染及细胞周期蛋白D1基因PCR-RFLP检测结果见表1。结果显示，Hp感染阳性和阴性的两组受试者细胞周期蛋白 D1基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）；在Hp感染阳性患者中，其基因型分布频率在胃癌组与对照组相比较差异有统计学意义（P<0.01），其中携带AA基因型者患胃癌的相对风险度（OR）为3.82，95％可信区间（CI）为1.92～7.61；在Hp感染阴性患者中，其基因型分布频率在胃癌组与对照组比较差异无显著性（P>0.05），其中携带AA基因型者患胃癌的相对风险度为0.86（95％CI为0.28～2.64）。
2.2 Hp感染状态与胃癌细胞周期蛋白 D1等位基因频率的关系 表2显示，在Hp感染阳性个体中，胃癌组细胞周期蛋白 D1 基因AA等位基因的频率为71.0％，而对照组为45.9％，较对照组显著增高（P<0.01）。将A等位基因视为暴露因素，其使个体患胃癌的相对风险度（OR）为2.89（95％CI为1.80～4.62）。而在Hp阴性个体中，胃癌组细胞周期蛋白D1基因A等位基因的频率为51.5％，而对照组为46.2％，两组差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
大量研究表明，HP与胃癌的发生有着密切的关系［1~3］，目前认为肿瘤是一类细胞周期性疾病，细胞生长周期的失调在包括胃癌在内的肿瘤的发生发展中起关键作用［4］。研究表明，细胞周期蛋白D1在细胞周期的正常调控中扮演重要角色［5］。细胞周期蛋白D1是一种重要的细胞周期调节蛋白，它可与细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4）在G1期结合形成复合物，再通过N末端的LECXE基序与视网膜母细胞瘤（Rb）编码蛋白pRb结合，使pRb的Ser和Tyr残基磷酸化，释放出转录因子E2F，驱动细胞由G1期进入S期，促进细胞增殖，而当细胞周期蛋白D1表达失控时，则将引起细胞增殖失调，进而导致肿瘤形成［6-9］。
本研究中，Hp感染的胃癌患者中细胞周期蛋白 D1基因的AA基因的频率为55.5%，而在HP阴性的胃癌患者中细胞周期蛋白 D1基因的AA基因的频率为20.6%,有显著差异 (P<0.01)，结果显示Hp阳性携带细胞周期蛋白 D1 AA基因型的个体患胃癌的OR为3.82。这说明在HP感染的患者中细胞周期蛋白 D1基因的AA基因型是胃癌发生的高危基因，这对于细胞周期蛋白 D1基因的AA基因型的人群早期预防胃癌的发生具有重要的警示意义。
参考文献
［1］ Trajkov D, Stardelova K,Dimitrova M, et al.Helicobacter pylori and gastric carcinoma.Prilozi, 2007,28(2):39-46.
［2］ Bronte-Tinkew DM, Terebiznik M,Franco A, et al.Helicobacter pylori cytotoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo. Cancer Res, 2009, 69(2):632-639.
［3］ Kakinoki R, Kushima R, Matsubara A, et al. Re-evaluation of histogenesis of gastric carcinomas:a comparative histopathological study between Helicobacter pylori-negative and Hpylori-positive cases.Dig Dis Sci,2009,54(3):614-620.
［4］ D AS, E T, H O,et al. Expression of retinoblastoma and cyclin D1 in gastric carcinoma.Neoplasma. 2009,56(1):63-67.
［5］ Shuai X, Han G, Wang G.Effects of cyclin D1 antisense oligodeoxyneucleotides on the growth and expression of G1 phase regulators in gastric carcinoma cells. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2003,23(4):396-398,406.
［6］ Guzinska-Ustymowicz K, Gryko M, Czyzewska J,et al.Evaluation of protein products of cell cycle regulating genes in gastric cancer.Rocz Akad Med Bialymst,2004,49 (Suppl 1):67-69.
［7］ Liu GY,Luo Q,Xiong B,et al.Tissue array for Tp53,C-myc,CCND1 gene over-expression in different tumors.World J Gastroenterol, 2008,14(47):7199-7207.
［8］ Nosho K, Kawasaki T, Chan AT, et al. Cyclin D1 is frequently overexpressed in microsatellite unstable colorectal cancer, independent of CpG island methylator phenotype.Histopathology,2008, 53(5): 588-598.
［9］ Wang J, Wang X, Gong W, et al. Increased expression of beta-catenin, phosphorylated glycogen synthase kinase 3beta, cyclin D1, and c-myc in laterally spreading colorectal tumors.J Histochem Cytochem, 2009,57(4):363-371.
(收稿日期:2010-12-23)
(本文编辑:王春芸)
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
【关键词】 胃癌； 细胞周期蛋白D1； 基因多态性； 幽门螺杆菌
Analysis of cyclin D1 Gene polymorphism of patients with helicobacter pylori infection and gastric cancer FANG Zhi-jun，LIU Yao-huang.The Fourth Hospital of Huangshi City, Huangshi，435006，China
【Abstract】 Objective To study the associativity between gastric cance and cyclin D1 gene polymorphism in patients with gastric cancer infected by Helicobacter pylori. Methods115 cases of gastric cancer and 112 cases of chronic gastritis (control group) were detected for Helicobacter pylori by ELISA and the cyclin D1 gene 870-nucleotide A/G (A870G) polymorphism by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR- RFLP).ResultsIn the group of gastric cancer with infected by Helicobacter pylori,the A allele frequencies of the cyclin D1 gene was 71.0% ,and in the control group,the A allele frequencies of the cyclin D1 gene was 45.9%. As A allele as a exposure factor, the odds ratio (OR) suffering gastric cancer was 2.28 and the 95% confidence interval（CI） was 1.80-4.62.ConclusionThe AA genetype in cyclin D1gene was the high risk factor for gastric cancer with Helicobacter pylori. Infection.
【Key words】gastric cancer; cyclin D1; gene polymorphism; Helicobacter pylori
肿瘤的发生与个体的遗传因素相关。近来研究表明，细胞周期蛋白D1基因多态性与胃癌的发生发展的关系密切，而幽门螺杆菌（Helicobacter，pylori,Hp）感染则可能是胃癌发生的启动因素和促进因素［1］。本实验在HP感染阳性的胃癌患者中，对其细胞周期蛋白D1基因的多态性进行了研究，以探讨HP感染的胃癌患者中细胞周期蛋白D1基因中的高危基因。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本研究将受试者分为Hp阳性组和Hp阴性组，每组又分胃癌组和对照组。所有受试者均取血测Hp抗体滴度，同时进行胃镜检查，于胃体、胃角及胃窦和病灶处取胃黏膜活检进行病理组织学诊断。其中115例诊断为非贲门胃癌患者，均来自黄石市第四医院和武汉市第三医院住院患者，男72例，女43例，年龄24～78岁，平均（58.3±12.1）岁；对照组112例诊断为慢性非萎缩性胃炎，为同期住院患者，男68例，女44例，年龄22～71岁，平均（57.8±10.5）岁。
1.2 研究方法 采集受试者空腹静脉血5 ml，其中3 ml储于EDTA抗凝的试管中用于提取基因组DNA，2 ml用于分离血清。应用ELISA方法严格按试剂盒操作说明检测血清Hp IgG型抗体，Hp抗体检测试剂盒购自福建三明蓝波生物技术研究所，产品批号为200803019。试验阳性者定义为Hp感染。应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术扩增细胞周期蛋白D1基因片段，以观察其第870位核苷酸A/G（A870G）多态性。PCR引物序列为：上游引物：5′-GTGAAGTTCATTTCCAATCCGC-3′，下游引物：5′-GGGACATCACCCTCACT TA C -3′。引物由上海生工生物有限公司合成及纯化，PCR试剂盒购于华美公司产品，产品批号为20081007。
1.3 统计学分析 应用SPSS统计软件包处理数据，先计算各组基因型频率及等位基因频率，确定其符合Hardy-Weinberg平衡后，通过χ2检验进行组间频率比较，以P<0.05为差异有统计学意义。以比值（OR）及其95%可信区间（CI）表示相对危险度。
2 结果
2.1 Hp感染状态与细胞周期蛋白D1基因型多态性分析 在共227名受试者中，Hp感染及细胞周期蛋白D1基因PCR-RFLP检测结果见表1。结果显示，Hp感染阳性和阴性的两组受试者细胞周期蛋白 D1基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）；在Hp感染阳性患者中，其基因型分布频率在胃癌组与对照组相比较差异有统计学意义（P<0.01），其中携带AA基因型者患胃癌的相对风险度（OR）为3.82，95％可信区间（CI）为1.92～7.61；在Hp感染阴性患者中，其基因型分布频率在胃癌组与对照组比较差异无显著性（P>0.05），其中携带AA基因型者患胃癌的相对风险度为0.86（95％CI为0.28～2.64）。
2.2 Hp感染状态与胃癌细胞周期蛋白 D1等位基因频率的关系 表2显示，在Hp感染阳性个体中，胃癌组细胞周期蛋白 D1 基因AA等位基因的频率为71.0％，而对照组为45.9％，较对照组显著增高（P<0.01）。将A等位基因视为暴露因素，其使个体患胃癌的相对风险度（OR）为2.89（95％CI为1.80～4.62）。而在Hp阴性个体中，胃癌组细胞周期蛋白D1基因A等位基因的频率为51.5％，而对照组为46.2％，两组差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
大量研究表明，HP与胃癌的发生有着密切的关系［1~3］，目前认为肿瘤是一类细胞周期性疾病，细胞生长周期的失调在包括胃癌在内的肿瘤的发生发展中起关键作用［4］。研究表明，细胞周期蛋白D1在细胞周期的正常调控中扮演重要角色［5］。细胞周期蛋白D1是一种重要的细胞周期调节蛋白，它可与细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4）在G1期结合形成复合物，再通过N末端的LECXE基序与视网膜母细胞瘤（Rb）编码蛋白pRb结合，使pRb的Ser和Tyr残基磷酸化，释放出转录因子E2F，驱动细胞由G1期进入S期，促进细胞增殖，而当细胞周期蛋白D1表达失控时，则将引起细胞增殖失调，进而导致肿瘤形成［6-9］。
本研究中，Hp感染的胃癌患者中细胞周期蛋白 D1基因的AA基因的频率为55.5%，而在HP阴性的胃癌患者中细胞周期蛋白 D1基因的AA基因的频率为20.6%,有显著差异 (P<0.01)，结果显示Hp阳性携带细胞周期蛋白 D1 AA基因型的个体患胃癌的OR为3.82。这说明在HP感染的患者中细胞周期蛋白 D1基因的AA基因型是胃癌发生的高危基因，这对于细胞周期蛋白 D1基因的AA基因型的人群早期预防胃癌的发生具有重要的警示意义。
参考文献
［1］ Trajkov D, Stardelova K,Dimitrova M, et al.Helicobacter pylori and gastric carcinoma.Prilozi, 2007,28(2):39-46.
［2］ Bronte-Tinkew DM, Terebiznik M,Franco A, et al.Helicobacter pylori cytotoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo. Cancer Res, 2009, 69(2):632-639.
［3］ Kakinoki R, Kushima R, Matsubara A, et al. Re-evaluation of histogenesis of gastric carcinomas:a comparative histopathological study between Helicobacter pylori-negative and Hpylori-positive cases.Dig Dis Sci,2009,54(3):614-620.
［4］ D AS, E T, H O,et al. Expression of retinoblastoma and cyclin D1 in gastric carcinoma.Neoplasma. 2009,56(1):63-67.
［5］ Shuai X, Han G, Wang G.Effects of cyclin D1 antisense oligodeoxyneucleotides on the growth and expression of G1 phase regulators in gastric carcinoma cells. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2003,23(4):396-398,406.
［6］ Guzinska-Ustymowicz K, Gryko M, Czyzewska J,et al.Evaluation of protein products of cell cycle regulating genes in gastric cancer.Rocz Akad Med Bialymst,2004,49 (Suppl 1):67-69.
［7］ Liu GY,Luo Q,Xiong B,et al.Tissue array for Tp53,C-myc,CCND1 gene over-expression in different tumors.World J Gastroenterol, 2008,14(47):7199-7207.
［8］ Nosho K, Kawasaki T, Chan AT, et al. Cyclin D1 is frequently overexpressed in microsatellite unstable colorectal cancer, independent of CpG island methylator phenotype.Histopathology,2008, 53(5): 588-598.
［9］ Wang J, Wang X, Gong W, et al. Increased expression of beta-catenin, phosphorylated glycogen synthase kinase 3beta, cyclin D1, and c-myc in laterally spreading colorectal tumors.J Histochem Cytochem, 2009,57(4):363-371.
(收稿日期:2010-12-23)
(本文编辑:王春芸)
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文