【摘 要】
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目的:为抗Sm抗体的特异性检出,提高中西医对疾病特异诊断,构建SmD1蛋白原核表达载体,并诱导表达.方法:提取Hela细胞总RNA后逆转录为cDNA,将带酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ的人SmD1
【机 构】
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川北医学院医学检验系;川北医学院附属医院风湿免疫科;四川省肿瘤医院·肿瘤研究所检验科,南充637000
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目的:为抗Sm抗体的特异性检出,提高中西医对疾病特异诊断,构建SmD1蛋白原核表达载体,并诱导表达.方法:提取Hela细胞总RNA后逆转录为cDNA,将带酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ的人SmD1蛋白基因序列进行PCR扩增,经酶切后插入pET41a质粒中,构建pET41a-GST-SmD1-6*His重组表达质粒,转化进入感受态大肠埃希菌OverExpress C41(DE3)中,经过异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用C端的His标签(His-tag)进行Ni-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达形式,Western blotting(WB)鉴定重组蛋白的免疫原性,ELISA法鉴定其免疫反应性和特异性,并使用构建好的蛋白进行检测.结果:经PCR扩增得到目的基因,菌落PCR提示重组表达质粒构建成功,经IPTG诱导后pET41a-GST-SmD1-6*His重组蛋白在感受态大肠埃希菌OverExpressC41 (DE3)中高效表达,SDS-PAGE显示GST-SmD1-6*His重组蛋白以包涵体形式表达,WB示重组蛋白有足够的免疫原性,能与人血清中的抗Sm抗体发生特异性反应,与常见的自身抗体无交叉反应.且使用复方黄芪颗粒治疗后抗Sm抗体含量有所降低.结论:成功构建中西医特异临床指标的系统性红斑狼疮的抗Sm抗体蛋白,该蛋白具有免疫原性和免疫反应性.可为后续该指标在中西医结合诊断运用中提供高质量的蛋白.
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