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摘 要： 通过组织分离纯化和分子生物学鉴定，明确了引起草莓叶部新病的致病菌为拟盘多毛孢。以喷洒清水为空白对照，利用不同质量浓度的臭氧水直接喷洒致病菌和生长期的草莓植株，研究臭氧水对致病菌和草莓植株的浓度效应，结果显示：低浓度臭氧水（0.5～0.8 mg?L-1）对草莓植株的生理生态变化和致病菌的生长影响较小;中浓度臭氧水（2.2～2.5 mg?L-1）可以显著抑制致病菌的生长，并促进草莓植株的生长;高浓度臭氧水（4.0～4.3 mg?L-1）可以很好地抑制致病菌的生长，但对草莓叶片有较严重的腐蚀作用。因此，中浓度（2.2～2.5 mg?L-1）是喷洒草莓的最适臭氧水浓度。
关键词： 草莓（Fragaria ananassa）; 拟盘多毛孢; 分子鉴定; 臭氧水; 浓度效应
中图分类号： S 154.36 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2020）06-0663-08
Abstract： Through the tissue separation，purification and molecular biological identification technologies，it was confirmed that the pathogenic fungus which caused a new disease of strawberry leaves is Pestalotiopsis.Using pure water as a blank control，ozone waters of different concentrations were sprayed to pathogenic fungus directly and to strawberry leaf surface in its growing period.The concentration effects of ozone water on pathogenic fungus and strawberry leaves were studied respectively.The results showed that：lower concentration ozone water（0.5-0.8 mg?L-1） has little effect on the physiological and ecological changes of strawberry plants and on the growth of pathogenic fungus;medium concentration ozone water（2.2-2.5 mg?L-1） can significantly inhibit the growth of pathogenic fungus and promote the growth of strawberry;higher concentration ozone water（4.0-4.3 mg?L-1） can well inhibit the growth of pathogenic fungus.However，it has a serious corrosion effect on strawberry leaves.Therefore，the medium concentration（2.2-2.5 mg?L-1） is the most suitable ozone water concentration for spraying on strawberry，which can be used in practical production to effectively prevent and control strawberry fungal diseases.
Key words： strawberry（Fragaria ananassa）; Pestalotiopsis; molecular identification; ozone water; concentration effect
0 引 言
草莓（Fragaria ananassa）是蔷薇科草莓属的多年生草本植物[1]。作为可食用水果，其味甘酸、性凉、无毒，热量极低，能润肺、健脾、补血;富含纤维素、维生素及果胶物质，能预防冠心病及脑溢血;特别是草莓含有的鞣花酸，能有效避免致癌物将健康的细胞转变为癌细胞，从而预防结肠癌和直肠癌的发生[2]。因此，草莓作为一种经济价值较高的浆果，深受广大消费者的青睐。
近几年，我国草莓种植面积不断扩大，草莓栽培已遍及全国各地，年平均产量高于世界平均水平。我国的草莓种植主要以温室或大棚栽培为主，露地栽培相对较少。采用温室或大棚栽培草莓虽然有很多优点，但其具有的高湿、连作等特点，也为病虫害的发生创造了极有利的环境条件。其中病害问题是影响草莓产量的最主要限制因素，多种病害的发生对草莓生产造成了极大的破坏与影响[3]。目前，国内已经报道的温室或大棚栽培草莓的病害主要有叶斑病、白粉病、灰霉病和根腐病等[4]。
防虫网可以抵御虫害的入侵，却不能有效地防治病害，目前人们主要依靠喷洒化学农药的方法来控制草莓病害。然而农药中存在的有机磷类和氨基甲酸酯类等化学成分，极容易残留在草莓上危害人体健康，并造成环境污染等问题[5]。因此，寻求农药的替代品以降低农药的使用量已经迫在眉睫。
臭氧作为一种强氧化剂，可以有效地杀灭细菌芽孢、病原体、真菌及病毒，可溶于水，易分解为氧气，比较环保，且成本较低，可应用于医学、农业、餐饮业等[6]。1997年，美国食品药品管理局（FDA）认同臭氧完全符合美国FDA评价食品添加剂安全性指标（GRAS）标准，并正式批准臭氧作为一种消毒剂广泛应用于食品加工生产领域中[7]。国内对臭氧的应用相对较少，目前在蔬菜防治方面已有相关研究，但水果方面的研究相对缺乏。 本研究在对大棚草莓病原菌进行分离鉴定的基础上，利用不同质量浓度的臭氧水对草莓致病菌和生长期的草莓植株分别作用，探究臭氧水对致病菌和草莓植株的浓度效应，明确臭氧水喷洒草莓植株的最适浓度范围，以期为臭氧水在草莓病害防治中的实际应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以上海师范大学奉贤校区，植物种质资源开发协同创新中心草莓基地所育成的草莓植株为实验材料。在草莓生长季节，选取有代表性的致病株系用于实验致病菌菌种的提取，致病株系大致病状为：植株叶片长斑且伴有褪绿枯萎等现象。待播种优良种子获得生长期草莓植株，将其移栽至高15 cm、底径12 cm的红色塑料筐中定植。
仪器设备：CF-YG10臭氧发生器（北京山美水美环保高科技有限公司）;DPD臭氧检测试剂盒（杭州陆恒生物科技有限公司）;Y-615便携式臭氧测定仪（杭州齐威仪器有限公司）;分析天平;灭菌锅;超净工作台;恒温培养箱等。
1.2 臭氧水制备
在臭氧发生器出气口处连接曝气石，将曝气石通入100 mL纯水中[8-9]，通过控制制备时间，以获得相对稳定的不同质量浓度的臭氧水。另加入超纯水稀释至相应倍数后，利用臭氧浓度测定仪检测所制备的臭氧水浓度，记录臭氧水浓度与制备时间的数据。实验所用臭氧水应在使用时现场制备，避免臭氧挥发，降低臭氧水的实际浓度。
1.3 致病菌的分离纯化与测序
1.3.1 分离、纯化致病菌
选取采集自上海师范大学植物种质资源中心草莓基地的致病株系，采用组织分离法对病原菌进行分离[10-11]。取草莓植株新鲜病叶，选择单个典型的病斑，沿病斑边缘连同其周围1～2 mm的健康部位切取病组织数块，切取的组织大小一般长、宽各4～5 mm。对病组织块进行表面消毒（75%（体积分数）酒精浸泡3～5 s，0.1%（体积分数）升汞消毒1～2 min），移到无菌水中连续漂洗3次，以除去残留的消毒液。将消毒过的病组织块置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板上，于28 ℃恒温培养箱中培养3 d。待长出菌落后，选择没有或仅含有少量杂菌的菌落挑取少量菌丝于PDA上进行纯化培养;进一步连续移植菌丝，直至菌落形态典型、无杂菌成功获得纯种培养物。
1.3.2 菌种的扩繁、保存
实验研究中通过平板划线扩繁，获得大量纯种致病菌种以备后续长期实验研究。并将其保存于菌种保存管中置于-20 ℃冰箱保存，备用。
1.3.3 病原菌的分子鉴定
在酒精灯火焰旁，取PDA培养基上的病原菌株，收集菌丝体用于DNA的提取。采用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）[12]提取后，进行DNA电泳检测和18 s保守序列PCR扩增。选取18 s引物序列：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系为30 μL，其中含：17.8 μL超纯水，3 μL Buffer，2 μL dNTP，正向引物和反向引物各3 μL，1 μL DNA模板，0.2 μL酶。PCR反应条件如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃终延伸10 min。PCR产物的鉴定纯化和3730测序由北京六合华大基因科技有限公司协助完成。测序结果在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.gov）数据库中进行BLAST比对分析，并提交GenBank，获得病原菌株序列。查阅相关文献进行系统发育分析，明确提取所得致病菌的菌属。
1.4 臭氧水抑制草莓致病菌实验
通过牛津杯十字交叉抑菌法[13]，探究不同质量浓度的臭氧水对致病菌的生长抑制情况。具体实验操作如下：用灭菌的打孔器在布满纯种致病菌的PDA培养基上打下3个带有菌丝的圆形菌饼，使用尖头镊子取出。将取出的菌饼倒扣在新的PDA平板中央，封口后，正置于恒温培养箱中28 ℃培养3 d，待其长出规则的圆形菌饼。在距菌饼中心等距离处依次取下12个圆形菌饼（等距离可确保每一个菌饼上的含菌量相近），倒扣在12个新制的PDA平板中央，并以倒扣的菌饼为中心在四周用无菌打孔器等距离（25 mm）十字交叉打孔，插入牛津杯[14]。将12个含有等量菌丝和牛津杯的培养皿等分成4组，将清水和制备的低浓度（0.5～0.8 mg?L-1;臭氧发生器工作2 min）、中浓度（2.2～2.5 mg?L-1;臭氧发生器工作20 min）、高浓度（4.0～4.3 mg?L-1;臭氧发生器工作35 min）臭氧水，分别取200 μL注入4组培养皿的牛津杯中，加盖封口后，正置于28 ℃的恒温培养箱中，培养2 d后统计菌饼直径。
1.5 臭氧水对草莓植株生长的影响
从植物种质资源中心草莓基地选取4组长势相同的健壮草莓植株（每组3盆植株，共12盆），置于实验室内采用刺伤法进行染菌实验（用灭菌的接种针挑取等量致病菌对健康草莓植株叶片进行接种） [15]。待草莓植株自然生长2 d，出现明显病症后，对4组植株分别喷洒清水、低浓度臭氧水（0.5～0.8 mg?L-1）、中浓度臭氧水（2.2～2.5 mg?L-1）和高浓度臭氧水（4.0 ～4.3 mg?L-1），每隔12 h喷洒一次，连续喷洒3 d，观察草莓植株的生理生态变化。
2 结果与分析
2.1 致病菌的分离纯化与形态观察
经分离纯化，从具有典型病症（叶上出现褐色病斑，病斑周围褪绿，叶片渐呈黄褐色枯死）的草莓植株叶片上得到纯种致病菌，观察其形态特征如下：该菌在PDA培养基上28 ℃恒温培养，3 d后获得5～8个纯种菌落，菌落多近圆形，直徑约30 cm，呈白色丝绒状，边缘规则，背面乳白色至淡黄色，如图1（a）所示。培养7 d后，菌落上出现黑色的分生孢子盘，其上产生墨汁滴状黏液，如图1（b）所示。显微镜下观察可见：分生孢子呈棍棒型，直立或弯曲，具隔膜，横隔处颜色较深，平均大小为23.9 μm×6.6 μm，如图1（c）所示。根据以上形态学特征，查阅相关文献资料，可初步鉴定该致病菌为拟盘多毛孢属真菌[16-17]。 2.2 致病菌的分子鑒定分析
分离纯化出的病原菌由华大基因科技有限公司进行测序，根据BLAST结果和系统发育分析，所提取的病原菌样品与拟盘多毛孢（Pestalotiopsis）亲缘关系最近，同源性达100%（图2～4）。
拟盘多毛孢属是黑盘孢科（Amphisphaeriaceae）中的无性形真菌类群[19]。2016年赵景楠等[20]首次发现并报道棒孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）能引起草莓叶部新病，危害草莓叶片，进而影响植株的正常生长。该病发病初期叶上产生褐色斑点，病斑周围褪绿，具有黄色晕圈;发病后期整个叶片呈黄褐色干枯死亡。
2.3 臭氧水对草莓致病菌的生长浓度效应
为了探究臭氧水对拟盘多毛孢的作用效果，本研究采用牛津杯十字交叉抑菌法分别用不同质量浓度的臭氧水与该菌作用。从左到右依次往每个培养皿的牛津杯中注入了200 μL的无菌水，以及低浓度、中浓度和高浓度的臭氧水，每种浓度进行3次生物学重复，正置培养3 d后观察，致病菌生长情况如图5所示。低浓度臭氧水（0.5～0.8 mg?L-1）对致病菌的作用不明显，真菌在培养基上的长势与无菌水对照无明显差异，该浓度的臭氧水不能抑制致病菌生长，可能是病害的影响导致臭氧水没有发挥作用。中浓度臭氧水（2.2～2.5 mg?L-1）和高浓度臭氧水（4.0～4.3 mg?L-1）与致病菌作用后，致病菌的生长明显得到抑制，且臭氧水浓度越高，抑制效果越明显。可能是臭氧水的强氧化性使其可以穿透致病菌细胞壁，破坏致病菌的蛋白质、多糖和氨基酸等物质，从而导致致病菌无法正常生长[21]。
2.4 臭氧水对草莓植株的生长浓度效应
在染菌草莓植株叶片表面喷洒不同质量浓度的臭氧水，连续喷洒3 d后检测其生长情况，如图6所示。喷洒无菌水后的对照组草莓植株呈现青枯状，从下部叶开始，逐渐向上凋萎、枯死，为典型的拟盘多毛孢叶斑病症状[22]，如图6（a），6（e）所示。与对照组相比，低浓度臭氧水作用后，草莓植株上的病菌扩散范围较大，对致病菌感染的抑制效果不显著，如图6（b），6（f）所示。中浓度臭氧水作用后，草莓植株基本未出现致病菌毒害现象，植株生长状态良好，含水量、鲜重、株高等各项指标都呈上升趋势，如图6（c），6（g）所示。高浓度臭氧水作用后，草莓植株受到腐蚀，地上叶部分变黄或萎蔫，如图6（d），6（h）所示，表明臭氧水浓度过高会影响草莓植株的正常生长。因此，中浓度（2.2～2.5 mg?L-1）的臭氧水既能抑制致病菌，又能促进草莓生长，最适合用于喷洒草莓植株。
3 结 论
经过分离纯化和分子鉴定分析，得到引起大棚草莓叶部新病的致病菌为拟盘多毛孢（Pestalotiopsis neglecta）。以喷洒无菌水为空白对照，将低浓度（0.5～0.8 mg?L-1）、中浓度（2.2～2.5 mg?L-1）和高浓度（4.0～4.3 mg?L-1）3个质量浓度的臭氧水分别作用于草莓致病菌——拟盘多毛孢和生长期的草莓植株上，研究结果表明：低浓度的臭氧水对致病菌的生长基本无抑制作用，中浓度的臭氧水对致病菌的生长有显著的抑制作用。但臭氧水质量浓度超过4.0 mg?L-1时，对草莓植株有较严重的腐蚀作用，而质量浓度为2.2～2.5 mg?L-1的臭氧水既能有效杀灭致病菌又不影响草莓的正常生长，且在一定程度上提高了草莓植株的各项生理指标。
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（責任编辑：顾浩然，郁慧）
关键词： 草莓（Fragaria ananassa）; 拟盘多毛孢; 分子鉴定; 臭氧水; 浓度效应
中图分类号： S 154.36 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2020）06-0663-08
Abstract： Through the tissue separation，purification and molecular biological identification technologies，it was confirmed that the pathogenic fungus which caused a new disease of strawberry leaves is Pestalotiopsis.Using pure water as a blank control，ozone waters of different concentrations were sprayed to pathogenic fungus directly and to strawberry leaf surface in its growing period.The concentration effects of ozone water on pathogenic fungus and strawberry leaves were studied respectively.The results showed that：lower concentration ozone water（0.5-0.8 mg?L-1） has little effect on the physiological and ecological changes of strawberry plants and on the growth of pathogenic fungus;medium concentration ozone water（2.2-2.5 mg?L-1） can significantly inhibit the growth of pathogenic fungus and promote the growth of strawberry;higher concentration ozone water（4.0-4.3 mg?L-1） can well inhibit the growth of pathogenic fungus.However，it has a serious corrosion effect on strawberry leaves.Therefore，the medium concentration（2.2-2.5 mg?L-1） is the most suitable ozone water concentration for spraying on strawberry，which can be used in practical production to effectively prevent and control strawberry fungal diseases.
Key words： strawberry（Fragaria ananassa）; Pestalotiopsis; molecular identification; ozone water; concentration effect
0 引 言
草莓（Fragaria ananassa）是蔷薇科草莓属的多年生草本植物[1]。作为可食用水果，其味甘酸、性凉、无毒，热量极低，能润肺、健脾、补血;富含纤维素、维生素及果胶物质，能预防冠心病及脑溢血;特别是草莓含有的鞣花酸，能有效避免致癌物将健康的细胞转变为癌细胞，从而预防结肠癌和直肠癌的发生[2]。因此，草莓作为一种经济价值较高的浆果，深受广大消费者的青睐。
近几年，我国草莓种植面积不断扩大，草莓栽培已遍及全国各地，年平均产量高于世界平均水平。我国的草莓种植主要以温室或大棚栽培为主，露地栽培相对较少。采用温室或大棚栽培草莓虽然有很多优点，但其具有的高湿、连作等特点，也为病虫害的发生创造了极有利的环境条件。其中病害问题是影响草莓产量的最主要限制因素，多种病害的发生对草莓生产造成了极大的破坏与影响[3]。目前，国内已经报道的温室或大棚栽培草莓的病害主要有叶斑病、白粉病、灰霉病和根腐病等[4]。
防虫网可以抵御虫害的入侵，却不能有效地防治病害，目前人们主要依靠喷洒化学农药的方法来控制草莓病害。然而农药中存在的有机磷类和氨基甲酸酯类等化学成分，极容易残留在草莓上危害人体健康，并造成环境污染等问题[5]。因此，寻求农药的替代品以降低农药的使用量已经迫在眉睫。
臭氧作为一种强氧化剂，可以有效地杀灭细菌芽孢、病原体、真菌及病毒，可溶于水，易分解为氧气，比较环保，且成本较低，可应用于医学、农业、餐饮业等[6]。1997年，美国食品药品管理局（FDA）认同臭氧完全符合美国FDA评价食品添加剂安全性指标（GRAS）标准，并正式批准臭氧作为一种消毒剂广泛应用于食品加工生产领域中[7]。国内对臭氧的应用相对较少，目前在蔬菜防治方面已有相关研究，但水果方面的研究相对缺乏。 本研究在对大棚草莓病原菌进行分离鉴定的基础上，利用不同质量浓度的臭氧水对草莓致病菌和生长期的草莓植株分别作用，探究臭氧水对致病菌和草莓植株的浓度效应，明确臭氧水喷洒草莓植株的最适浓度范围，以期为臭氧水在草莓病害防治中的实际应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以上海师范大学奉贤校区，植物种质资源开发协同创新中心草莓基地所育成的草莓植株为实验材料。在草莓生长季节，选取有代表性的致病株系用于实验致病菌菌种的提取，致病株系大致病状为：植株叶片长斑且伴有褪绿枯萎等现象。待播种优良种子获得生长期草莓植株，将其移栽至高15 cm、底径12 cm的红色塑料筐中定植。
仪器设备：CF-YG10臭氧发生器（北京山美水美环保高科技有限公司）;DPD臭氧检测试剂盒（杭州陆恒生物科技有限公司）;Y-615便携式臭氧测定仪（杭州齐威仪器有限公司）;分析天平;灭菌锅;超净工作台;恒温培养箱等。
1.2 臭氧水制备
在臭氧发生器出气口处连接曝气石，将曝气石通入100 mL纯水中[8-9]，通过控制制备时间，以获得相对稳定的不同质量浓度的臭氧水。另加入超纯水稀释至相应倍数后，利用臭氧浓度测定仪检测所制备的臭氧水浓度，记录臭氧水浓度与制备时间的数据。实验所用臭氧水应在使用时现场制备，避免臭氧挥发，降低臭氧水的实际浓度。
1.3 致病菌的分离纯化与测序
1.3.1 分离、纯化致病菌
选取采集自上海师范大学植物种质资源中心草莓基地的致病株系，采用组织分离法对病原菌进行分离[10-11]。取草莓植株新鲜病叶，选择单个典型的病斑，沿病斑边缘连同其周围1～2 mm的健康部位切取病组织数块，切取的组织大小一般长、宽各4～5 mm。对病组织块进行表面消毒（75%（体积分数）酒精浸泡3～5 s，0.1%（体积分数）升汞消毒1～2 min），移到无菌水中连续漂洗3次，以除去残留的消毒液。将消毒过的病组织块置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板上，于28 ℃恒温培养箱中培养3 d。待长出菌落后，选择没有或仅含有少量杂菌的菌落挑取少量菌丝于PDA上进行纯化培养;进一步连续移植菌丝，直至菌落形态典型、无杂菌成功获得纯种培养物。
1.3.2 菌种的扩繁、保存
实验研究中通过平板划线扩繁，获得大量纯种致病菌种以备后续长期实验研究。并将其保存于菌种保存管中置于-20 ℃冰箱保存，备用。
1.3.3 病原菌的分子鉴定
在酒精灯火焰旁，取PDA培养基上的病原菌株，收集菌丝体用于DNA的提取。采用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）[12]提取后，进行DNA电泳检测和18 s保守序列PCR扩增。选取18 s引物序列：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系为30 μL，其中含：17.8 μL超纯水，3 μL Buffer，2 μL dNTP，正向引物和反向引物各3 μL，1 μL DNA模板，0.2 μL酶。PCR反应条件如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃终延伸10 min。PCR产物的鉴定纯化和3730测序由北京六合华大基因科技有限公司协助完成。测序结果在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.gov）数据库中进行BLAST比对分析，并提交GenBank，获得病原菌株序列。查阅相关文献进行系统发育分析，明确提取所得致病菌的菌属。
1.4 臭氧水抑制草莓致病菌实验
通过牛津杯十字交叉抑菌法[13]，探究不同质量浓度的臭氧水对致病菌的生长抑制情况。具体实验操作如下：用灭菌的打孔器在布满纯种致病菌的PDA培养基上打下3个带有菌丝的圆形菌饼，使用尖头镊子取出。将取出的菌饼倒扣在新的PDA平板中央，封口后，正置于恒温培养箱中28 ℃培养3 d，待其长出规则的圆形菌饼。在距菌饼中心等距离处依次取下12个圆形菌饼（等距离可确保每一个菌饼上的含菌量相近），倒扣在12个新制的PDA平板中央，并以倒扣的菌饼为中心在四周用无菌打孔器等距离（25 mm）十字交叉打孔，插入牛津杯[14]。将12个含有等量菌丝和牛津杯的培养皿等分成4组，将清水和制备的低浓度（0.5～0.8 mg?L-1;臭氧发生器工作2 min）、中浓度（2.2～2.5 mg?L-1;臭氧发生器工作20 min）、高浓度（4.0～4.3 mg?L-1;臭氧发生器工作35 min）臭氧水，分别取200 μL注入4组培养皿的牛津杯中，加盖封口后，正置于28 ℃的恒温培养箱中，培养2 d后统计菌饼直径。
1.5 臭氧水对草莓植株生长的影响
从植物种质资源中心草莓基地选取4组长势相同的健壮草莓植株（每组3盆植株，共12盆），置于实验室内采用刺伤法进行染菌实验（用灭菌的接种针挑取等量致病菌对健康草莓植株叶片进行接种） [15]。待草莓植株自然生长2 d，出现明显病症后，对4组植株分别喷洒清水、低浓度臭氧水（0.5～0.8 mg?L-1）、中浓度臭氧水（2.2～2.5 mg?L-1）和高浓度臭氧水（4.0 ～4.3 mg?L-1），每隔12 h喷洒一次，连续喷洒3 d，观察草莓植株的生理生态变化。
2 结果与分析
2.1 致病菌的分离纯化与形态观察
经分离纯化，从具有典型病症（叶上出现褐色病斑，病斑周围褪绿，叶片渐呈黄褐色枯死）的草莓植株叶片上得到纯种致病菌，观察其形态特征如下：该菌在PDA培养基上28 ℃恒温培养，3 d后获得5～8个纯种菌落，菌落多近圆形，直徑约30 cm，呈白色丝绒状，边缘规则，背面乳白色至淡黄色，如图1（a）所示。培养7 d后，菌落上出现黑色的分生孢子盘，其上产生墨汁滴状黏液，如图1（b）所示。显微镜下观察可见：分生孢子呈棍棒型，直立或弯曲，具隔膜，横隔处颜色较深，平均大小为23.9 μm×6.6 μm，如图1（c）所示。根据以上形态学特征，查阅相关文献资料，可初步鉴定该致病菌为拟盘多毛孢属真菌[16-17]。 2.2 致病菌的分子鑒定分析
分离纯化出的病原菌由华大基因科技有限公司进行测序，根据BLAST结果和系统发育分析，所提取的病原菌样品与拟盘多毛孢（Pestalotiopsis）亲缘关系最近，同源性达100%（图2～4）。
拟盘多毛孢属是黑盘孢科（Amphisphaeriaceae）中的无性形真菌类群[19]。2016年赵景楠等[20]首次发现并报道棒孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）能引起草莓叶部新病，危害草莓叶片，进而影响植株的正常生长。该病发病初期叶上产生褐色斑点，病斑周围褪绿，具有黄色晕圈;发病后期整个叶片呈黄褐色干枯死亡。
2.3 臭氧水对草莓致病菌的生长浓度效应
为了探究臭氧水对拟盘多毛孢的作用效果，本研究采用牛津杯十字交叉抑菌法分别用不同质量浓度的臭氧水与该菌作用。从左到右依次往每个培养皿的牛津杯中注入了200 μL的无菌水，以及低浓度、中浓度和高浓度的臭氧水，每种浓度进行3次生物学重复，正置培养3 d后观察，致病菌生长情况如图5所示。低浓度臭氧水（0.5～0.8 mg?L-1）对致病菌的作用不明显，真菌在培养基上的长势与无菌水对照无明显差异，该浓度的臭氧水不能抑制致病菌生长，可能是病害的影响导致臭氧水没有发挥作用。中浓度臭氧水（2.2～2.5 mg?L-1）和高浓度臭氧水（4.0～4.3 mg?L-1）与致病菌作用后，致病菌的生长明显得到抑制，且臭氧水浓度越高，抑制效果越明显。可能是臭氧水的强氧化性使其可以穿透致病菌细胞壁，破坏致病菌的蛋白质、多糖和氨基酸等物质，从而导致致病菌无法正常生长[21]。
2.4 臭氧水对草莓植株的生长浓度效应
在染菌草莓植株叶片表面喷洒不同质量浓度的臭氧水，连续喷洒3 d后检测其生长情况，如图6所示。喷洒无菌水后的对照组草莓植株呈现青枯状，从下部叶开始，逐渐向上凋萎、枯死，为典型的拟盘多毛孢叶斑病症状[22]，如图6（a），6（e）所示。与对照组相比，低浓度臭氧水作用后，草莓植株上的病菌扩散范围较大，对致病菌感染的抑制效果不显著，如图6（b），6（f）所示。中浓度臭氧水作用后，草莓植株基本未出现致病菌毒害现象，植株生长状态良好，含水量、鲜重、株高等各项指标都呈上升趋势，如图6（c），6（g）所示。高浓度臭氧水作用后，草莓植株受到腐蚀，地上叶部分变黄或萎蔫，如图6（d），6（h）所示，表明臭氧水浓度过高会影响草莓植株的正常生长。因此，中浓度（2.2～2.5 mg?L-1）的臭氧水既能抑制致病菌，又能促进草莓生长，最适合用于喷洒草莓植株。
3 结 论
经过分离纯化和分子鉴定分析，得到引起大棚草莓叶部新病的致病菌为拟盘多毛孢（Pestalotiopsis neglecta）。以喷洒无菌水为空白对照，将低浓度（0.5～0.8 mg?L-1）、中浓度（2.2～2.5 mg?L-1）和高浓度（4.0～4.3 mg?L-1）3个质量浓度的臭氧水分别作用于草莓致病菌——拟盘多毛孢和生长期的草莓植株上，研究结果表明：低浓度的臭氧水对致病菌的生长基本无抑制作用，中浓度的臭氧水对致病菌的生长有显著的抑制作用。但臭氧水质量浓度超过4.0 mg?L-1时，对草莓植株有较严重的腐蚀作用，而质量浓度为2.2～2.5 mg?L-1的臭氧水既能有效杀灭致病菌又不影响草莓的正常生长，且在一定程度上提高了草莓植株的各项生理指标。
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（責任编辑：顾浩然，郁慧）