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摘要：首先在GenBank中下载蓖麻蚕核型多角体（PhcyNPV）全基因组序列，通过生物信息学的方法预测表明，PhcyNPV 基因组中有142条miRNA成熟体分子；再用miRanda、RNAhybird 2个软件预测miRNAs对病毒自身的靶基因，提取有共同交集的33条miRNA。用PhcyNPV感染蓖麻蚕，取感病蓖麻蚕的脂肪体组织，提取总RNA；用逆转录PCR（reverse transcription PCR，简称RT-PCR）验证有共同交集的33条miRNA，确定其中6条为miRNA成熟体序列，分别是Phcy-miR-996_5p、Phcy-miR-696-5P、Phcy-miR-664_3p、Phcy-miR-30_5p、Phcy-miR-217_5p、Phcy-miR-1483_3p。这6条可能的miRNA对应的靶基因涉及病毒的融合蛋白、多角体蛋白等结构蛋白，以及一些蛋白激酶包括激活解旋酶表达的极早期基因等，推测其潜在的靶基因参与病毒复制及侵染的重要过程。
关键词：蓖麻蚕；核型多角体病毒；miRNA；生物信息学
中图分类号： S885.25文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）10-0053-09
收稿日期：2015-09-02
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-22）。
作者简介：钱荷英（1971—），女，江苏溧阳人，博士，副研究员，主要从事家蚕遗传育种与分子生物学研究。E-mail：qianheying123@163.com。
通信作者：徐安英，研究员，主要从事家蚕遗传育种与种质资源研究。E-mail：srixay@126.com。
[ZK）]
miRNA是一类大小约22 nt的单链小分子RNA，由具有发夹结构的长约70～90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工得到，能够和互补或部分互补的靶mRNA的3′末端非翻译区（3′-UTR）结合，选择性降解mRNA或抑制基因翻译[1]。自miRNA被发现以来，迅速成为生命科学领域的研究热点，因此开展miRNA的研究将对转录后基因调控领域的发展产生深远影响。
病毒miRNA产生过程与其他生物类似，其成熟miRNA大小和结构也与其他生物的miRNA一致。病毒miRNA不仅可调节自身基因的表达，利于病毒复制及潜伏感染，还能调节宿主基因的表达并因此逃避宿主的免疫作用[2]。目前有关病毒miRNA的研究主要是关于哺乳动物的病毒，在昆虫病毒方面鲜有研究，仅有棉铃虫夜蛾囊泡病毒（HvAV）和家蚕核型多角体病毒（BmNPV）有报道，前者编码的miRNA可以抑制病毒DNA聚合酶的转录从而调控病毒自身的复制[3]，后者的miRNA功能尚未得到确凿的试验验证[4-5]。
蓖麻蚕是我国的三大绢丝昆虫之一，其核型多角体病毒病是生产中最常见的传染病，具有发病快、传染性强的特点，是制约蓖麻蚕产业发展的一大因素。蓖麻蚕核型多角体病毒（PhcyNPV）基因组已被解析[6]，但尚未见关于PhcyNPV的miRNA报道。本研究以期通过生物信息学方法对PhcyNPV编码的miRNA进行预测，并进行试验验证，为探索PhcyNPV的感染机制及建立相关的诊断、治疗方法提供一定的分子生物学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1蓖麻蚕及其核型多角体病毒蓖麻蚕品种B21、蓖麻蚕核型多角体病毒（PhcyNPV）均由中国农业科学院蚕业研究所保存。
1.1.2质粒與菌种T克隆质粒载体pMD18-T、大肠杆菌受体菌株购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.1.3工具酶及相关试剂T4 DNA连接酶、蛋白酶K、高保真Taq酶、DNaseⅠ （RNase free）、DNA marker、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ、质粒提取试剂盒，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；QIAEXⅡGel Extraction Kit，购自 TaKaRa 公司；TRIzol Reagent，购自Promege公司；其他化学试剂均为分析纯，购自生工生物工程（上海）股份有限公司或国药集团化学试剂有限公司。
1.1.4主要分析软件及网站本研究所用分析软件及网站如下：RNAhybird，http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/welcome.html；miRanda，http：//www.microrna.org/；miR Base，http：//www.mirbase.org/；Mfold，http：//mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py？#forms：：mfold；Oligo 6.0、DNAMAN、DNAStar。
1.1.5引物设计与合成利用引物分析软件Oligo 6.0设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列见表1，此处反转录引物为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC******-3′，后6个碱基用“*”表示，根据成熟体序列设计，下游引物为5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′。
1.2试验方法
1.2.1预测PhcyNPV可能的编码miRNA前体序列下载PhcyNPV全基因组序列（GenBank号：JX404026.1）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/427378890？report=fasta）导入vMir软件，设定窗口大小为500 nt，递进单位10 nt，最小发
夹结构长度50 nt，对PhcyNPV 全基因组中可能形成发夹结构的序列进行初步筛选。随后，设定每条序列最低得分为115分，窗口最低为35，去除G C含量不在30%～70%之间的序列以及那些位于蛋白编码区的序列[7]，得到PhcyNPV 全基因组中可能编码的miRNA前体序列。 1.2.2预测PhcyNPV可能编码的成熟miRNA序列根据预测到的PhcyNPV miRNA前体序列的发夹结构，预测成熟的miRNA序列。成熟miRNA序列的长度平均为22 nt，位于前体发夹结构的3′端或者5′端臂上。还要参照的数据是成熟miRNA中A U含量应在30%～70%以及发夹结构中miRNA与其互补的序列差异不能大于6 bp，推测每条miRNA前体序列上可能有的成熟体miRNA序列。
1.2.3预测成熟miRNA作用的病毒自身靶基因根据成熟体 miRNA序列5′端2～8位上的核苷酸与靶基因的mRNA序列的非编码区（3′-UTR）互补的原理来预测靶基因[8]。为了提高预测的准确度，使用RNAhybird（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/welcome.html）和 miRanda（http：//www.microrna.org/）2个软件分别进行靶基因预测，然后提取2个软件预测的交集作为最终的预测结果，即可能的miRNA靶基因。
1.2.4成熟miRNA序列的逆转录PCR（reverse transcription PCR，简称RT-PCR）验证
1.2.4.1试验组与对照组蓖麻蚕脂肪体总RNA的提取病毒接种及取材：取用正常蓖麻葉饲养的4龄蓖麻蚕（B21）起蚕100头，分为试验组、对照组，每组50头。试验组用移液枪取1.3×108个/mL多角体的PchyNPV病毒液，经口添饲蓖麻蚕，每头喂8 μL，对照组喂8 μL蒸馏水。然后用蓖麻叶正常饲育，至试验组蚕有发病症状（约饲养96 h）。收集对照组、试验组蓖麻蚕的脂肪体组织，立即于-80 ℃保存、备用。
提取蓖麻蚕脂肪体组织总RNA，方法如下：（1）取冷冻的脂肪体组织，加液氮，充分研磨；（2）研钵中加入1 mL TRIzol，继续研磨，至透明后转移至离心管中；（3）室温静置5 min，加入200 μL三氯甲烷，倒置混匀15 s；（4）室温静置5 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min；（5）取上清，加入等体积的异丙醇（500 μL），倒置混匀；（6）室温静置10 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min；（7）弃上清，在沉淀中加入乙醇洗涤；（8）4 ℃、12 000 r/min 离心5 min后，轻轻倒掉乙醇，倒扣于超净工作台中控干乙醇；（9）加入40 μL DEPC水，溶解 10 min，测D260 nm/D280 nm，检验提取质量；（10）将溶解的样品置于 -80 ℃ 保存、待用。
1.2.4.2反转录体系用试剂盒进行逆转录试验，10 μL的逆转录体系：2 μL 5×PrimerScript buffer，0.5 μL PrimerScripTM RT Enyme Mix Ⅱ，0.5 μL OligdT引物，0.5 μL Random 6 mers，RNase free H2O 6 μL，0.5 μL模板；RT程序：56 ℃ 25 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。
PCR反应体系如下：13.2 μL ddH2O，2.5 μL Buffer，4.0 μL dNTP，1.5 μL引物F，1.5 μL引物R，2.0 μL cDNA溶液，0.3 μL Taq DNA聚合酶，总体积25 μL；PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.4.3回收PCR扩增产物将扩增的单一条带且大小与目的条带相符的PCR产物重新用2%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下切胶，称质量，放入RNA专用的EP管中。加入3倍胶块质量的Buffer B2，50 ℃水浴5～10 min，再加入1/3 Buffer B2体积的异丙醇；将融化的胶溶液移入吸附柱中，8 000 r/min 离心30 s，弃上清；沉淀中加入500 μL洗涤液，9 000 r/min 离心30 s，弃上清，重复洗1次；吸附柱于 9 000 r/min 离心1 min；将吸附柱置于干净的1.5 mL离心管中，在吸附膜中加入30 μL无菌水溶解DNA，9 000 r/min 离心1 min，-20 ℃保存上清液。
1.2.4.4目的片段与PMD 18-T 载体的连接先将割胶回收的DNA重新进行PCR扩增，检验产物，将符合条件的DNA进行转化。10 μL转化体系：1 μL PMD 18-T 载体，4 μL回收的目的片段DNA，5 μL T4连接酶溶液，在连接仪中，于 16 ℃过夜。
1.2.4.5质粒DNA的转化在DNA连接产物的全量混合液中加入100 μL感受态细胞（大肠杆菌E.coli DH10B），混匀至于冰上30 min（其间每隔15 min，手指弹匀1次），42 ℃ 热激60 s，迅速置冰上2 min；再加入890 μL LB培养基（不含Amp），37 ℃振荡1.0～1.5 h，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含Amp的液体培养基，涂布于LB平板培养基上，于37 ℃恒温培养箱中过夜（约10～12 h）。
1.2.4.6重组质粒的鉴定及测序挑取多个白色单菌落转化子于1.5 mL含有Amp的液体培养基中，37 ℃摇床培养过夜（12 h），然后于4 ℃保存。取菌液进行PCR验证，20 μL PCR反应体系：13.2 μL ddH2O，2.0 μL buffer，0.4 μL dNTP，1.0 μL引物F，1.0 μL引物R，2.0 μL菌液，0.4 μL Taq E。PCR反应程序与“1.2.4.2”节的方法一致，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将鉴定正确的菌液倒入EP管中，另加Amp与甘油，制成甘油菌，委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。 1.2.4.7预测的成熟miRNA序列与测序结果比对成熟体的序列一般为22 nt，位于前体序列的5′端或3′端，与其互补序列的差异不能多于6个碱基。将测序结果、成熟体序列与病毒基因组进行一一比对。
2结果与分析
2.1vMir 软件预测PhcyNPV可能编码的miRNA前体序列
将PhcyNPV全基因组序列（JX404026.1 ）导入分析软件vMir，根据文献介绍，预测参数如下：Window size，500 nt；Step size，10 nt；Min HP size，50 nt。
预测得到4 836个可能的小RNA前体序列，包括miRNA前体序列、长度、方向、分值信息，从而得到前体序列。
然后设置相应的参数，利用vMir软件分析PhcyNPV基因组，产生所有PhcyNPV基因组中可能形成的发夹结构（图1）。
[FK（W14][TPQHY1.tif][FK）]
2.2vMir viewer 查看和过滤 miRNA前体序列
通过文献推荐的过滤参数（Score：115；Max HP size，100 nt；Window count，35），对4 836个miRNA前体进行过滤选择，进一步筛选可能编码的miRNA前体序列。将预测到的可能前体序列再与PhcyNPV 基因组中的ORF序列比对，如果这些预测序列位于蛋白编码区，则应去除。由于病毒基因组中90%以上的序列都编码蛋白，且ORF中几乎不含内含子，因此绝大部分的预测序列将被去除。最终得到71个miRNA前体（表2），其分布展示如图2所示。
2.3提取成熟的miRNA序列
成熟的miRNA分别位于前体的3′或者5′臂端，平均长度为22 nt。通过对71个前体miRNA序列进行分析，提取得到142个成熟的miRNA序列，详见表3。
2.4预测结果与miRBase的同源性比对
将71条前体得到的142条成熟序列，与v20.0版本的miRBase（http：//www.mirbase.org/）数据库的前体序列进行比对分析，发现共有134条成熟序列有同源性miRNA序列，其余8条则未见有同源序列，可能是PhcyNPV中特有的。
2.5PchyNPV可能编码的成熟miRNA的靶基因预测
为了提高预测的准确度，使用2个软件（miRanda、RNAhybird）分别预测miRNA成熟体的靶基因，然后提取这2个软件预测的交集作为最终的预测结果。有33条miRNA成熟体序列预测到61个ORF（即病毒自身的靶基因）上，见表5。可以看出，成熟體miRNA可能调控的靶基因涉及PchyNPV基因组中各类基因，从时间上看有极早期基因（[WTBX][STBX]PE 38、pnk/pnl[WTBZ][STBZ]）、早期基因（[WTBX][STBX]ME53/hr2、P12、HE65）、滞早期基因（p31）、晚期表达基因（lef-3、lef-8、lef-9[WTBZ][STBZ]）；从功能上看，有与病毒复制相关基因、能影响病毒包埋相关基因、与经口感染相关因子、与宿主域相关基因、抑制宿主细胞凋亡基因、编码合成与病毒复制及感染相关的酶与调节蛋白基因等，有的是核心基因，有的则是杆状病毒的非必需基因。由此可见，在PchyNPV基因组中可能编码的成熟体miRNA在蓖麻蚕核型多角体病毒侵染宿主蓖麻蚕的过程中，从侵染的起始到后期各个阶段都可能通过调控病毒自身基因来实现病毒侵染寄主细胞的作用。
2.6预测的miRNA成熟体的RT-PCR验证
根据“2.5”节中用miRanda、RNAhybird2个软件分别预测成熟体miRNA的靶基因，有33条成熟体miRNA在2个软件中都预测到相关的靶基因。选取这33条miRNA为研究对象，用RT-PCR验证这些miRNA成熟体的序列。
根据成熟体序列设计相应的反转录引物以及PCR上游引物，将对照组和试验组的蓖麻蚕脂肪体总RNA反转录成特异性的cDNA后进行PCR扩增，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，有8条序列是单一条带且序列的大小与理论预测值相符，部分电泳结果如图3所示。
分别挑出这8条单一且大小接近64 bp的条带，重新进行PCR验证，依然呈现单一条带，且大小符合理论值。由图4可见，这8条带对应的成熟体miRNA从1～8分别是Phcy-miR-177_3p、Phcy-miR-996_5p、Phcy-miR-696-5P、Phcy-miR-664_3p、Phcy-miR-30_5p、Phcy-miR-217_5p、Phcy-miR-1483_3p、Phcy-miR-177_5p。
将这些PCR产物进行割胶回收、连接转化，菌液PCR后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序产物与PhcyNPV基因组比对，有6条带在基因组内有完全一致的序列，另外2条与基因组序列不一致。6条可能为PhcyNPV编码的miRNA成熟体序列，分别为Phcy-miR-996_5p、Phcy-miR-5P、Phcy-miR-664_3p、Phcy-miR-30_5p、Phcy-miR-217_5p、Phcy-miR-1483_3p。PCR产物的电泳图中显示对照组的脂肪体cDNA也能扩增出大小相似的条带（图5），但是这些条带经测序比对后发现与PchyNPV基因组不完全一致，因此认为不是目的条带。
3结论与讨论
本试验利用计算机预测PhcyNPV中可能编码的miRNA分子，共得到142条miRNAs序列。通过比对miRBase数据库，发现134条有同源序列，其余8条则没有同源序列，可能是PhcyNPV特有的miRNA分子。目前大多数研究都将重点放在miRNAs在宿主与病毒互作中的功能研究上，但越来越多的证据表明，miRNAs通过直接靶向病毒基因或改变自身基因的表达在防御反应中也起到重要作用。此外，由于本研究中预测的PhcyNPV的miRNAs数量较之前已研究的 BmNPV 的miRNA要多， 在试验验证miRNA成熟体序列之前，笔者先用miRanda、RNAhybird 2个软件预测miRNA对病毒自身靶基因，然后选择2个软件均预测到相同靶基因的33条miRNA，再对这33条miRNA做试验验证，相对提高了验证序列的可靠性。 从对BmNPV及其宿主家蚕的miRNA研究[4，9]看，miRNA的表达具有时间和空间的特异性，因此取什么组织作样[CM（25]本和什么时间取样就很重要。以往研究家蚕及
时，一般取病毒感染后的血液（或马氏管）作为研究对象，因为这二者中病毒的复制数较高；考虑到病毒感染家蚕后，病毒和家蚕有个相互抗衡的过程，病毒需要有足够的时间产生miRNA起作用，因此通常选择感染后72 h取样，希望获得更多的miRNA分子序列。但是钱荷英等研究发现，在PhcyNPV感染蓖麻蚕后期的各组织中，脂肪体内的病毒基因拷贝数远远高于其他组织，且直到120 h还保持增殖趋势[10]，这可能也间接提示PhcyNPV、BmNPV在感染各自寄主时有其相对特殊的感染方式。
在用RT-PCR进行PhcyNPV的miRNA成熟体序列验证时，有的PCR产物出现并非专一的非目的条带，可能是扩增了蓖麻蚕基因组产物所致，因为所取试验材料中蓖麻蚕的组织样品含量远高于PhcyNPV，因此这些扩增条带没有割胶回收验证。至于对照组织中也扩增出与目的片段大小相似且表达量相对较高的miRNA分子，可能是由于蓖麻蚕本身也会编码产生相应的miRNA，而且这些miRNA 在病毒感染过程中也起到抑制、调控病毒的复制和侵染作用，因此导致对照组织中有miRNA分子被扩增出。鉴于目前没有相对完整的蓖麻蚕基因组信息，因此对照组中扩增出的成熟miRNA分子无法验证，只好忽略。
从靶基因预测结果看，1个miRNA可能作用于多个靶基因，而1个基因又可能受多条miRNA的调控，可见miRNA对病毒自身的调控是个复杂的网络系统，涉及多种基因及病毒侵染的各个阶段。由于完善的蓖麻蚕细胞系尚没有建立，而PhcyNPV对已经成熟的几个细胞系如Bm、sf等的感染性不理想，miRNA的生物学功能验证试验很难开展，这也是本研究的一大缺憾。
参考文献：[HJ1.75mm]
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[10]钱荷英，徐安英，张月华，等. 蓖麻蚕核型多角体病毒基因[WTBX][STBX]gp64[WTBZ][STBZ]的克隆及熒光定量表达分析[J]. 河北农业大学学报，2013，36（6）：76-82.
关键词：蓖麻蚕；核型多角体病毒；miRNA；生物信息学
中图分类号： S885.25文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）10-0053-09
收稿日期：2015-09-02
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-22）。
作者简介：钱荷英（1971—），女，江苏溧阳人，博士，副研究员，主要从事家蚕遗传育种与分子生物学研究。E-mail：qianheying123@163.com。
通信作者：徐安英，研究员，主要从事家蚕遗传育种与种质资源研究。E-mail：srixay@126.com。
[ZK）]
miRNA是一类大小约22 nt的单链小分子RNA，由具有发夹结构的长约70～90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工得到，能够和互补或部分互补的靶mRNA的3′末端非翻译区（3′-UTR）结合，选择性降解mRNA或抑制基因翻译[1]。自miRNA被发现以来，迅速成为生命科学领域的研究热点，因此开展miRNA的研究将对转录后基因调控领域的发展产生深远影响。
病毒miRNA产生过程与其他生物类似，其成熟miRNA大小和结构也与其他生物的miRNA一致。病毒miRNA不仅可调节自身基因的表达，利于病毒复制及潜伏感染，还能调节宿主基因的表达并因此逃避宿主的免疫作用[2]。目前有关病毒miRNA的研究主要是关于哺乳动物的病毒，在昆虫病毒方面鲜有研究，仅有棉铃虫夜蛾囊泡病毒（HvAV）和家蚕核型多角体病毒（BmNPV）有报道，前者编码的miRNA可以抑制病毒DNA聚合酶的转录从而调控病毒自身的复制[3]，后者的miRNA功能尚未得到确凿的试验验证[4-5]。
蓖麻蚕是我国的三大绢丝昆虫之一，其核型多角体病毒病是生产中最常见的传染病，具有发病快、传染性强的特点，是制约蓖麻蚕产业发展的一大因素。蓖麻蚕核型多角体病毒（PhcyNPV）基因组已被解析[6]，但尚未见关于PhcyNPV的miRNA报道。本研究以期通过生物信息学方法对PhcyNPV编码的miRNA进行预测，并进行试验验证，为探索PhcyNPV的感染机制及建立相关的诊断、治疗方法提供一定的分子生物学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1蓖麻蚕及其核型多角体病毒蓖麻蚕品种B21、蓖麻蚕核型多角体病毒（PhcyNPV）均由中国农业科学院蚕业研究所保存。
1.1.2质粒與菌种T克隆质粒载体pMD18-T、大肠杆菌受体菌株购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.1.3工具酶及相关试剂T4 DNA连接酶、蛋白酶K、高保真Taq酶、DNaseⅠ （RNase free）、DNA marker、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ、质粒提取试剂盒，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；QIAEXⅡGel Extraction Kit，购自 TaKaRa 公司；TRIzol Reagent，购自Promege公司；其他化学试剂均为分析纯，购自生工生物工程（上海）股份有限公司或国药集团化学试剂有限公司。
1.1.4主要分析软件及网站本研究所用分析软件及网站如下：RNAhybird，http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/welcome.html；miRanda，http：//www.microrna.org/；miR Base，http：//www.mirbase.org/；Mfold，http：//mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py？#forms：：mfold；Oligo 6.0、DNAMAN、DNAStar。
1.1.5引物设计与合成利用引物分析软件Oligo 6.0设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列见表1，此处反转录引物为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC******-3′，后6个碱基用“*”表示，根据成熟体序列设计，下游引物为5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′。
1.2试验方法
1.2.1预测PhcyNPV可能的编码miRNA前体序列下载PhcyNPV全基因组序列（GenBank号：JX404026.1）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/427378890？report=fasta）导入vMir软件，设定窗口大小为500 nt，递进单位10 nt，最小发
夹结构长度50 nt，对PhcyNPV 全基因组中可能形成发夹结构的序列进行初步筛选。随后，设定每条序列最低得分为115分，窗口最低为35，去除G C含量不在30%～70%之间的序列以及那些位于蛋白编码区的序列[7]，得到PhcyNPV 全基因组中可能编码的miRNA前体序列。 1.2.2预测PhcyNPV可能编码的成熟miRNA序列根据预测到的PhcyNPV miRNA前体序列的发夹结构，预测成熟的miRNA序列。成熟miRNA序列的长度平均为22 nt，位于前体发夹结构的3′端或者5′端臂上。还要参照的数据是成熟miRNA中A U含量应在30%～70%以及发夹结构中miRNA与其互补的序列差异不能大于6 bp，推测每条miRNA前体序列上可能有的成熟体miRNA序列。
1.2.3预测成熟miRNA作用的病毒自身靶基因根据成熟体 miRNA序列5′端2～8位上的核苷酸与靶基因的mRNA序列的非编码区（3′-UTR）互补的原理来预测靶基因[8]。为了提高预测的准确度，使用RNAhybird（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/welcome.html）和 miRanda（http：//www.microrna.org/）2个软件分别进行靶基因预测，然后提取2个软件预测的交集作为最终的预测结果，即可能的miRNA靶基因。
1.2.4成熟miRNA序列的逆转录PCR（reverse transcription PCR，简称RT-PCR）验证
1.2.4.1试验组与对照组蓖麻蚕脂肪体总RNA的提取病毒接种及取材：取用正常蓖麻葉饲养的4龄蓖麻蚕（B21）起蚕100头，分为试验组、对照组，每组50头。试验组用移液枪取1.3×108个/mL多角体的PchyNPV病毒液，经口添饲蓖麻蚕，每头喂8 μL，对照组喂8 μL蒸馏水。然后用蓖麻叶正常饲育，至试验组蚕有发病症状（约饲养96 h）。收集对照组、试验组蓖麻蚕的脂肪体组织，立即于-80 ℃保存、备用。
提取蓖麻蚕脂肪体组织总RNA，方法如下：（1）取冷冻的脂肪体组织，加液氮，充分研磨；（2）研钵中加入1 mL TRIzol，继续研磨，至透明后转移至离心管中；（3）室温静置5 min，加入200 μL三氯甲烷，倒置混匀15 s；（4）室温静置5 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min；（5）取上清，加入等体积的异丙醇（500 μL），倒置混匀；（6）室温静置10 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min；（7）弃上清，在沉淀中加入乙醇洗涤；（8）4 ℃、12 000 r/min 离心5 min后，轻轻倒掉乙醇，倒扣于超净工作台中控干乙醇；（9）加入40 μL DEPC水，溶解 10 min，测D260 nm/D280 nm，检验提取质量；（10）将溶解的样品置于 -80 ℃ 保存、待用。
1.2.4.2反转录体系用试剂盒进行逆转录试验，10 μL的逆转录体系：2 μL 5×PrimerScript buffer，0.5 μL PrimerScripTM RT Enyme Mix Ⅱ，0.5 μL OligdT引物，0.5 μL Random 6 mers，RNase free H2O 6 μL，0.5 μL模板；RT程序：56 ℃ 25 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。
PCR反应体系如下：13.2 μL ddH2O，2.5 μL Buffer，4.0 μL dNTP，1.5 μL引物F，1.5 μL引物R，2.0 μL cDNA溶液，0.3 μL Taq DNA聚合酶，总体积25 μL；PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.4.3回收PCR扩增产物将扩增的单一条带且大小与目的条带相符的PCR产物重新用2%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下切胶，称质量，放入RNA专用的EP管中。加入3倍胶块质量的Buffer B2，50 ℃水浴5～10 min，再加入1/3 Buffer B2体积的异丙醇；将融化的胶溶液移入吸附柱中，8 000 r/min 离心30 s，弃上清；沉淀中加入500 μL洗涤液，9 000 r/min 离心30 s，弃上清，重复洗1次；吸附柱于 9 000 r/min 离心1 min；将吸附柱置于干净的1.5 mL离心管中，在吸附膜中加入30 μL无菌水溶解DNA，9 000 r/min 离心1 min，-20 ℃保存上清液。
1.2.4.4目的片段与PMD 18-T 载体的连接先将割胶回收的DNA重新进行PCR扩增，检验产物，将符合条件的DNA进行转化。10 μL转化体系：1 μL PMD 18-T 载体，4 μL回收的目的片段DNA，5 μL T4连接酶溶液，在连接仪中，于 16 ℃过夜。
1.2.4.5质粒DNA的转化在DNA连接产物的全量混合液中加入100 μL感受态细胞（大肠杆菌E.coli DH10B），混匀至于冰上30 min（其间每隔15 min，手指弹匀1次），42 ℃ 热激60 s，迅速置冰上2 min；再加入890 μL LB培养基（不含Amp），37 ℃振荡1.0～1.5 h，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含Amp的液体培养基，涂布于LB平板培养基上，于37 ℃恒温培养箱中过夜（约10～12 h）。
1.2.4.6重组质粒的鉴定及测序挑取多个白色单菌落转化子于1.5 mL含有Amp的液体培养基中，37 ℃摇床培养过夜（12 h），然后于4 ℃保存。取菌液进行PCR验证，20 μL PCR反应体系：13.2 μL ddH2O，2.0 μL buffer，0.4 μL dNTP，1.0 μL引物F，1.0 μL引物R，2.0 μL菌液，0.4 μL Taq E。PCR反应程序与“1.2.4.2”节的方法一致，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将鉴定正确的菌液倒入EP管中，另加Amp与甘油，制成甘油菌，委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。 1.2.4.7预测的成熟miRNA序列与测序结果比对成熟体的序列一般为22 nt，位于前体序列的5′端或3′端，与其互补序列的差异不能多于6个碱基。将测序结果、成熟体序列与病毒基因组进行一一比对。
2结果与分析
2.1vMir 软件预测PhcyNPV可能编码的miRNA前体序列
将PhcyNPV全基因组序列（JX404026.1 ）导入分析软件vMir，根据文献介绍，预测参数如下：Window size，500 nt；Step size，10 nt；Min HP size，50 nt。
预测得到4 836个可能的小RNA前体序列，包括miRNA前体序列、长度、方向、分值信息，从而得到前体序列。
然后设置相应的参数，利用vMir软件分析PhcyNPV基因组，产生所有PhcyNPV基因组中可能形成的发夹结构（图1）。
[FK（W14][TPQHY1.tif][FK）]
2.2vMir viewer 查看和过滤 miRNA前体序列
通过文献推荐的过滤参数（Score：115；Max HP size，100 nt；Window count，35），对4 836个miRNA前体进行过滤选择，进一步筛选可能编码的miRNA前体序列。将预测到的可能前体序列再与PhcyNPV 基因组中的ORF序列比对，如果这些预测序列位于蛋白编码区，则应去除。由于病毒基因组中90%以上的序列都编码蛋白，且ORF中几乎不含内含子，因此绝大部分的预测序列将被去除。最终得到71个miRNA前体（表2），其分布展示如图2所示。
2.3提取成熟的miRNA序列
成熟的miRNA分别位于前体的3′或者5′臂端，平均长度为22 nt。通过对71个前体miRNA序列进行分析，提取得到142个成熟的miRNA序列，详见表3。
2.4预测结果与miRBase的同源性比对
将71条前体得到的142条成熟序列，与v20.0版本的miRBase（http：//www.mirbase.org/）数据库的前体序列进行比对分析，发现共有134条成熟序列有同源性miRNA序列，其余8条则未见有同源序列，可能是PhcyNPV中特有的。
2.5PchyNPV可能编码的成熟miRNA的靶基因预测
为了提高预测的准确度，使用2个软件（miRanda、RNAhybird）分别预测miRNA成熟体的靶基因，然后提取这2个软件预测的交集作为最终的预测结果。有33条miRNA成熟体序列预测到61个ORF（即病毒自身的靶基因）上，见表5。可以看出，成熟體miRNA可能调控的靶基因涉及PchyNPV基因组中各类基因，从时间上看有极早期基因（[WTBX][STBX]PE 38、pnk/pnl[WTBZ][STBZ]）、早期基因（[WTBX][STBX]ME53/hr2、P12、HE65）、滞早期基因（p31）、晚期表达基因（lef-3、lef-8、lef-9[WTBZ][STBZ]）；从功能上看，有与病毒复制相关基因、能影响病毒包埋相关基因、与经口感染相关因子、与宿主域相关基因、抑制宿主细胞凋亡基因、编码合成与病毒复制及感染相关的酶与调节蛋白基因等，有的是核心基因，有的则是杆状病毒的非必需基因。由此可见，在PchyNPV基因组中可能编码的成熟体miRNA在蓖麻蚕核型多角体病毒侵染宿主蓖麻蚕的过程中，从侵染的起始到后期各个阶段都可能通过调控病毒自身基因来实现病毒侵染寄主细胞的作用。
2.6预测的miRNA成熟体的RT-PCR验证
根据“2.5”节中用miRanda、RNAhybird2个软件分别预测成熟体miRNA的靶基因，有33条成熟体miRNA在2个软件中都预测到相关的靶基因。选取这33条miRNA为研究对象，用RT-PCR验证这些miRNA成熟体的序列。
根据成熟体序列设计相应的反转录引物以及PCR上游引物，将对照组和试验组的蓖麻蚕脂肪体总RNA反转录成特异性的cDNA后进行PCR扩增，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，有8条序列是单一条带且序列的大小与理论预测值相符，部分电泳结果如图3所示。
分别挑出这8条单一且大小接近64 bp的条带，重新进行PCR验证，依然呈现单一条带，且大小符合理论值。由图4可见，这8条带对应的成熟体miRNA从1～8分别是Phcy-miR-177_3p、Phcy-miR-996_5p、Phcy-miR-696-5P、Phcy-miR-664_3p、Phcy-miR-30_5p、Phcy-miR-217_5p、Phcy-miR-1483_3p、Phcy-miR-177_5p。
将这些PCR产物进行割胶回收、连接转化，菌液PCR后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序产物与PhcyNPV基因组比对，有6条带在基因组内有完全一致的序列，另外2条与基因组序列不一致。6条可能为PhcyNPV编码的miRNA成熟体序列，分别为Phcy-miR-996_5p、Phcy-miR-5P、Phcy-miR-664_3p、Phcy-miR-30_5p、Phcy-miR-217_5p、Phcy-miR-1483_3p。PCR产物的电泳图中显示对照组的脂肪体cDNA也能扩增出大小相似的条带（图5），但是这些条带经测序比对后发现与PchyNPV基因组不完全一致，因此认为不是目的条带。
3结论与讨论
本试验利用计算机预测PhcyNPV中可能编码的miRNA分子，共得到142条miRNAs序列。通过比对miRBase数据库，发现134条有同源序列，其余8条则没有同源序列，可能是PhcyNPV特有的miRNA分子。目前大多数研究都将重点放在miRNAs在宿主与病毒互作中的功能研究上，但越来越多的证据表明，miRNAs通过直接靶向病毒基因或改变自身基因的表达在防御反应中也起到重要作用。此外，由于本研究中预测的PhcyNPV的miRNAs数量较之前已研究的 BmNPV 的miRNA要多， 在试验验证miRNA成熟体序列之前，笔者先用miRanda、RNAhybird 2个软件预测miRNA对病毒自身靶基因，然后选择2个软件均预测到相同靶基因的33条miRNA，再对这33条miRNA做试验验证，相对提高了验证序列的可靠性。 从对BmNPV及其宿主家蚕的miRNA研究[4，9]看，miRNA的表达具有时间和空间的特异性，因此取什么组织作样[CM（25]本和什么时间取样就很重要。以往研究家蚕及
时，一般取病毒感染后的血液（或马氏管）作为研究对象，因为这二者中病毒的复制数较高；考虑到病毒感染家蚕后，病毒和家蚕有个相互抗衡的过程，病毒需要有足够的时间产生miRNA起作用，因此通常选择感染后72 h取样，希望获得更多的miRNA分子序列。但是钱荷英等研究发现，在PhcyNPV感染蓖麻蚕后期的各组织中，脂肪体内的病毒基因拷贝数远远高于其他组织，且直到120 h还保持增殖趋势[10]，这可能也间接提示PhcyNPV、BmNPV在感染各自寄主时有其相对特殊的感染方式。
在用RT-PCR进行PhcyNPV的miRNA成熟体序列验证时，有的PCR产物出现并非专一的非目的条带，可能是扩增了蓖麻蚕基因组产物所致，因为所取试验材料中蓖麻蚕的组织样品含量远高于PhcyNPV，因此这些扩增条带没有割胶回收验证。至于对照组织中也扩增出与目的片段大小相似且表达量相对较高的miRNA分子，可能是由于蓖麻蚕本身也会编码产生相应的miRNA，而且这些miRNA 在病毒感染过程中也起到抑制、调控病毒的复制和侵染作用，因此导致对照组织中有miRNA分子被扩增出。鉴于目前没有相对完整的蓖麻蚕基因组信息，因此对照组中扩增出的成熟miRNA分子无法验证，只好忽略。
从靶基因预测结果看，1个miRNA可能作用于多个靶基因，而1个基因又可能受多条miRNA的调控，可见miRNA对病毒自身的调控是个复杂的网络系统，涉及多种基因及病毒侵染的各个阶段。由于完善的蓖麻蚕细胞系尚没有建立，而PhcyNPV对已经成熟的几个细胞系如Bm、sf等的感染性不理想，miRNA的生物学功能验证试验很难开展，这也是本研究的一大缺憾。
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