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【摘 要】CRISPR/Cas9 技术是一种由gRNA引导的Cas9核酸内切酶靶向编辑技术，已广泛用于基因的敲除、敲入和敲降，其操作简便快速，成本低，已成为人们探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因以及改良经济物种种质性状的重要工具。鱼类是脊椎动物中最大的类群，许多物种对科学研究和水产养殖都有价值。这篇综述着重介绍了新一代基因组编辑技术CRISPR/Cas9在鱼类中的最新进展和应用，特别强调了它们在性别决定和生殖功能方面的应用。
【关键词】CRISPR/Cas9;性别决定;疾病模型;水产养殖
引言
CRISPR/Cas9技术是一种由gRNA引导的Cas9核酸内切酶靶向编辑技术，已广泛用于基因的敲除、敲入和敲降，已成为人们探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因以及改良经济物种种质性状的重要工具。基因组编辑是基因功能反向遗传学研究的有力工具。鱼类具有多种多样的生殖方式，养殖的苗种主要靠人工繁殖，因此控制性别是水产养殖增加产量的有效途径。还有其他的目的需要控制鱼类的性别，性别控制技术在水产养殖中的一些种类得到了应用，它是建立在鱼类性别决定与分化的生物学基础上开展的。这些新出现的基因组编辑技术首次允许在包括高效鱼类在内的多种物种中进行基因定位或编辑。尽管基因敲除已成为模式鱼的主要反向遗传途径，但它往往存在特异性低、毒性高的问题。本文就CRISPR/Cas9在鱼类中的研究进展和应用作一综述，重点介绍它们在性别决定和生殖基因功能研究中的应用。
1.性别决定及其分子机制
鱼类的雌雄个体在生长速度、个体大小、形态颜色方面具有明显差异，掌握鱼类性别决定和分化机制，可以调控鱼类向某一单向性别发育，从而创造更多的经济价值。许多养殖鱼类生长具有明显的性别二态性，尼罗罗非鱼雄鱼比雌鱼生长快。研究中采用CRISP/Cas9对非模式生物罗非鱼进行基因敲除，说明Dmrt基因对于精子的发育和成熟具有重要作用。类固醇生成因子I（SF-1/NR5A1），是核受体超家族中一个调控类固醇生成，对性腺发育，性别决定与分化不可缺少的转录因子。利用靶向基因敲除技术产生sf-1突变体，F0代导致性腺发育缺陷，肥满度增加，甚至出现由雌向雄的性逆转，为罗非鱼的性别控制提供了理论依据。黄颡鱼是我国一种重要的淡水经济鱼类，通过对XY和YY黄颡鱼精巢进行了转录组比较分析，揭示了miR-141/429和靶基因相互作用在精巢发育和精子生成过程中发挥着重要作用。性或性腺分化是一个复杂的事件，其机制在硬骨鱼类中尚不清楚。尽管其复杂性和可塑性，卵巢分化过程被认为涉及性腺芳香化酶。
2.鱼类疾病模型的基因组编辑
斑马鱼有两种形式的蛋白。最近利用CRISPR/Cas9在斑马鱼中对这两个基因进行了突变，这两个突变体表现出了人类癫痫的典型症状，使其成为研究疾病机制和开发治疗方法的绝佳动物模型。最近的一项研究利用TALEN创建了一个马赛克斑马鱼突变体，在部分体细胞中敲除了肿瘤抑制因子视网膜母细胞瘤1，导致肿瘤最早在3.5个月内发生，且多发生在大脑。骨质疏松症是老年人的主要健康问题。全基因组关联研究发现了大量骨质疏松症的潜在遗传因素，包括ATP6V1H，通过CRISPR/Cas9对斑马鱼ATP6V1H同源物进行突变，产生了一个突变体，表现出与人类骨质疏松症相似的表型。用MMP9和MMP13的小分子抑制剂处理突变体鱼，成功地挽救了atpovlh突变体的表型。这些研究证明了鱼种和基因组编辑在人类疾病建模和治疗开发方面的巨大潜力。
3.基因编辑技术在水产养殖中潜在应用
鱼类的生殖发育一直是生命科学研究的重要研究课题之一，在品种改良上具有重要意义。尽管基因组编辑仍处于起步阶段，但它将在水产养殖领域得到巨大的应用。许多在水产养殖中具有重要意义的性状都可以成为基因组编辑改进的目标，包括生长和繁殖性能、抗病性、饲料转化效率和对环境胁迫因素的耐受性。在水产养殖中，为了控制家鱼和转基因鱼的逃逸，通常希望实现无菌化。研究表明，基因组编辑在水产养殖中应用于培育有价值性状的新品种的潜力巨大。编码黑色素产生酶酪氨酸酶的基因是该方法发展和评价的最初目标。CRISPR极大地提高了我们直接研究小鱼中基因功能的能力，为AOP的验证和开发提供了先进的方法。
4.结语
随着基因组编辑在模型鱼种和具有重要经济意义的鱼种中的高效应用，我们现在正进入一个时代，这些强大的技术将在广泛的鱼种中得到爆炸性的应用，以研究基因功能或创造具有特殊特性的新的转基因染色体。基因组编辑在鱼类模型中越来越受欢迎，部分原因是由于鱼类物种的生物学和技术优势。随着这些技术在各种鱼类模型上的成熟，预计它们将在水产养殖中找到更多的应用，用于改善具有经济价值的性状，如生长和抗病性，在环境科学中用于监测干扰特定生理事件和途径的污染物，以及在生物医学中用于疾病建模和药物筛选。作为生物多样性最丰富的脊椎动物群体，基因组编辑技术在鱼类物种中的获得和应用将为基因功能及其在脊椎动物中的进化提供巨大的信息和启示。
通讯作者：卫福磊
参考文献
[1]郭华荣，陶奕文.CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进展[J].中国海洋大学学报（自然科学版），2020，50（09）：105-112.
[2]李明辉.罗非鱼基因敲除技术的建立及其在性别决定与分化研究中的应用[D].西南大学，2014.
[3]葛家春.黄颡鱼转基因与基因敲除的技术研究[D].南京师范大学，2015.
[4]江东能.Gsdf和Wt1在罗非鱼性别分化和性腺发育中的功能研究[D].西南大学，2016.
[5] Xin LUO，Min LI，Bing SU.Application of the genome editing tool CRISPR/Cas9 in non-human primates[J].Zoological Research，2016，37（04）：214-219.
[6]李明輝.罗非鱼基因敲除技术的建立及其在性别决定与分化研究中的应用[D].西南大学，2014.
[7]谢庆平.SF-1是尼罗罗非鱼性类固醇激素生成、性腺发育以及性别分化所必需的关键因子[D].西南大学，2016.
[8]于淼.团头鲂干细胞相关因子nanog和oct4的鉴定[D].华中农业大学，2017.
[9]Barbara Vona， Julia Doll， Michaela A.H. Hofrichter， et al. Small fish， big prospects： using zebrafish to unravel the mechanisms of hereditary hearing loss. 2020，518
[10]Tao Wenjing， Shi Hongjuan， Yang Jing， et al. Homozygous mutation of foxh1 arrests oogenesis causing infertility in female Nile tilapia?.2020，102（3）：758-769.
青海大学生态环境工程学院 青海西宁 810016
【关键词】CRISPR/Cas9;性别决定;疾病模型;水产养殖
引言
CRISPR/Cas9技术是一种由gRNA引导的Cas9核酸内切酶靶向编辑技术，已广泛用于基因的敲除、敲入和敲降，已成为人们探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因以及改良经济物种种质性状的重要工具。基因组编辑是基因功能反向遗传学研究的有力工具。鱼类具有多种多样的生殖方式，养殖的苗种主要靠人工繁殖，因此控制性别是水产养殖增加产量的有效途径。还有其他的目的需要控制鱼类的性别，性别控制技术在水产养殖中的一些种类得到了应用，它是建立在鱼类性别决定与分化的生物学基础上开展的。这些新出现的基因组编辑技术首次允许在包括高效鱼类在内的多种物种中进行基因定位或编辑。尽管基因敲除已成为模式鱼的主要反向遗传途径，但它往往存在特异性低、毒性高的问题。本文就CRISPR/Cas9在鱼类中的研究进展和应用作一综述，重点介绍它们在性别决定和生殖基因功能研究中的应用。
1.性别决定及其分子机制
鱼类的雌雄个体在生长速度、个体大小、形态颜色方面具有明显差异，掌握鱼类性别决定和分化机制，可以调控鱼类向某一单向性别发育，从而创造更多的经济价值。许多养殖鱼类生长具有明显的性别二态性，尼罗罗非鱼雄鱼比雌鱼生长快。研究中采用CRISP/Cas9对非模式生物罗非鱼进行基因敲除，说明Dmrt基因对于精子的发育和成熟具有重要作用。类固醇生成因子I（SF-1/NR5A1），是核受体超家族中一个调控类固醇生成，对性腺发育，性别决定与分化不可缺少的转录因子。利用靶向基因敲除技术产生sf-1突变体，F0代导致性腺发育缺陷，肥满度增加，甚至出现由雌向雄的性逆转，为罗非鱼的性别控制提供了理论依据。黄颡鱼是我国一种重要的淡水经济鱼类，通过对XY和YY黄颡鱼精巢进行了转录组比较分析，揭示了miR-141/429和靶基因相互作用在精巢发育和精子生成过程中发挥着重要作用。性或性腺分化是一个复杂的事件，其机制在硬骨鱼类中尚不清楚。尽管其复杂性和可塑性，卵巢分化过程被认为涉及性腺芳香化酶。
2.鱼类疾病模型的基因组编辑
斑马鱼有两种形式的蛋白。最近利用CRISPR/Cas9在斑马鱼中对这两个基因进行了突变，这两个突变体表现出了人类癫痫的典型症状，使其成为研究疾病机制和开发治疗方法的绝佳动物模型。最近的一项研究利用TALEN创建了一个马赛克斑马鱼突变体，在部分体细胞中敲除了肿瘤抑制因子视网膜母细胞瘤1，导致肿瘤最早在3.5个月内发生，且多发生在大脑。骨质疏松症是老年人的主要健康问题。全基因组关联研究发现了大量骨质疏松症的潜在遗传因素，包括ATP6V1H，通过CRISPR/Cas9对斑马鱼ATP6V1H同源物进行突变，产生了一个突变体，表现出与人类骨质疏松症相似的表型。用MMP9和MMP13的小分子抑制剂处理突变体鱼，成功地挽救了atpovlh突变体的表型。这些研究证明了鱼种和基因组编辑在人类疾病建模和治疗开发方面的巨大潜力。
3.基因编辑技术在水产养殖中潜在应用
鱼类的生殖发育一直是生命科学研究的重要研究课题之一，在品种改良上具有重要意义。尽管基因组编辑仍处于起步阶段，但它将在水产养殖领域得到巨大的应用。许多在水产养殖中具有重要意义的性状都可以成为基因组编辑改进的目标，包括生长和繁殖性能、抗病性、饲料转化效率和对环境胁迫因素的耐受性。在水产养殖中，为了控制家鱼和转基因鱼的逃逸，通常希望实现无菌化。研究表明，基因组编辑在水产养殖中应用于培育有价值性状的新品种的潜力巨大。编码黑色素产生酶酪氨酸酶的基因是该方法发展和评价的最初目标。CRISPR极大地提高了我们直接研究小鱼中基因功能的能力，为AOP的验证和开发提供了先进的方法。
4.结语
随着基因组编辑在模型鱼种和具有重要经济意义的鱼种中的高效应用，我们现在正进入一个时代，这些强大的技术将在广泛的鱼种中得到爆炸性的应用，以研究基因功能或创造具有特殊特性的新的转基因染色体。基因组编辑在鱼类模型中越来越受欢迎，部分原因是由于鱼类物种的生物学和技术优势。随着这些技术在各种鱼类模型上的成熟，预计它们将在水产养殖中找到更多的应用，用于改善具有经济价值的性状，如生长和抗病性，在环境科学中用于监测干扰特定生理事件和途径的污染物，以及在生物医学中用于疾病建模和药物筛选。作为生物多样性最丰富的脊椎动物群体，基因组编辑技术在鱼类物种中的获得和应用将为基因功能及其在脊椎动物中的进化提供巨大的信息和启示。
通讯作者：卫福磊
参考文献
[1]郭华荣，陶奕文.CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进展[J].中国海洋大学学报（自然科学版），2020，50（09）：105-112.
[2]李明辉.罗非鱼基因敲除技术的建立及其在性别决定与分化研究中的应用[D].西南大学，2014.
[3]葛家春.黄颡鱼转基因与基因敲除的技术研究[D].南京师范大学，2015.
[4]江东能.Gsdf和Wt1在罗非鱼性别分化和性腺发育中的功能研究[D].西南大学，2016.
[5] Xin LUO，Min LI，Bing SU.Application of the genome editing tool CRISPR/Cas9 in non-human primates[J].Zoological Research，2016，37（04）：214-219.
[6]李明輝.罗非鱼基因敲除技术的建立及其在性别决定与分化研究中的应用[D].西南大学，2014.
[7]谢庆平.SF-1是尼罗罗非鱼性类固醇激素生成、性腺发育以及性别分化所必需的关键因子[D].西南大学，2016.
[8]于淼.团头鲂干细胞相关因子nanog和oct4的鉴定[D].华中农业大学，2017.
[9]Barbara Vona， Julia Doll， Michaela A.H. Hofrichter， et al. Small fish， big prospects： using zebrafish to unravel the mechanisms of hereditary hearing loss. 2020，518
[10]Tao Wenjing， Shi Hongjuan， Yang Jing， et al. Homozygous mutation of foxh1 arrests oogenesis causing infertility in female Nile tilapia?.2020，102（3）：758-769.
青海大学生态环境工程学院 青海西宁 810016