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摘要[目的]揭示不同产地金樱子30个居群间的遗传多样性和亲缘关系。[方法]采用RAPD分子标记技术，从35条RAPD随机引物中，筛选出8条有效引物进行扩增，用NTSYSpc，ver.2.02软件进行UPGMA聚类分析。[结果]共扩增出86条带，其中多态性条带84条，多态性百分率（PPB）97.67%。30个居群的相似性系数在0.11～0.58，聚成A、B、C三大类群。[结论]金樱子具有丰富的遗传多态性，产自贵州地区的金樱子有较近的亲缘关系。
关键词金樱子；随机扩增多态性DNA；亲缘关系
中图分类号S188；R284.2文献标识码A文章编号0517-6611（2015）07-023-02
金樱子为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx.的干燥成熟果实，又名倒蜂糖罐、糖桔子、刺梨子、山石榴等，性酸、涩、平，能补肾益气、补血益精、涩精缩尿、止泻。久服令人耐寒轻身。现代药理研究表明，金樱子具有抗氧化、免疫调节、降血糖、降低血清胆固醇含量、降血脂、抗动脉粥样硬化等功能，并有明显的抑菌及抗病毒等作用。主要用于治疗尿频遗尿、遗精滑精、久泻久痢、白带过多、妇女子宫脱垂等症。因其富含维生素C、糖等，民间将其果实作为食用；也可用于泡酒，金樱子酒具有滋补、强身健体的功效。2002年，我国卫生部将金樱子列入保健食品的行列。金樱子具有药食同源的重要价值，开发应用前景十分广阔，经济效益潜力颇大。金樱子在我国西南、华南、华中、华东均有分布，尤其以贵州分布最广，产量最高，是贵州大宗药材之一。目前关于全樱子随机扩增多态性DNA分析国内外尚未见报道[1-5]。为了探讨以贵州为主不同生长地区金樱子的遗传分化情况，笔者在DNA分子水平上，采用RAPD（DNA随机扩增多态性）分子标记技术，对金樱子的遗传多样性和亲缘关系进行分析，为对金樱子优良性评价和资源保护具有十分重要的意义。
1材料与方法
1.1供试样品
于2012年，主要采集于贵州及相邻省份，不同产地品种共30个居群，经贵阳医学院生药学教研室鉴定为金樱子Rosa laevigata Michx.（表1）。
表1样品编号及产地
1.2试剂
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，Farco），PVP（聚乙烯吡咯烷酮，Basf），琼脂糖（Promega），溴化乙锭（EB， Sigma），RNASE（Promega），限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq酶、聚丙烯酰胺等均购自上海生物工程有限公司。
1.3仪器
低温高速离心机（BECKMAN，GS-15R）；凝胶成像仪（UVP，GDS7600G）；电泳仪（北京六一仪器厂）。
1.4金樱子基因组DNA的提取
DNA提取采用CTAB法[6-7]。
1.5引物筛选[8]
先用1个DNA 样品，对引物初选，再用4个样品DNA 进行第2 次筛选，选取多态性高的8个引物用于RAPD 试验，这8个引物分别为S1：GTTTCGCTCC，S22：TGCCGAGCTG，S5：TGCGCCCTTC，S29：GGGTAACGCC，S6：TGCTCTGCCC，S40：GTTGCGATCC，S10：CTGCTGGGAC，S45：TGAGCGGACA。
1.6PCR反应体系和程序
PCR反应体系总体积20 μl：ddH2O 6.5 μl，2×PCRMix10 μl，引物（10 μmol/L ）1.5 μl，DNA 2 μl。反应程序：94 ℃预变性8 min，然后进行35个循环（每个循环包括94 ℃变性30 s、36 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min） ，最后在72 ℃下延伸10 min。PCR反应产物加2 μl上样缓冲液（40%蔗糖、0.25%溴酚蓝） ，经电压110 V，电泳50 min，1.5%琼脂糖检测，然后用溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色10 min，并在凝胶成像仪（UVP，GDS7600G）系统下拍照记录。每个反应重复2 次，确定所得条带的可重复性。
1.7数据分析
记录金樱子RAPD扩增出的总条带数，记录可辨认的、2次扩增结果一致的条带。经Gel-Pro Analyzer Version 4.5软件识别，根据扩增条带的迁移率，同一迁移率有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，采用软件SYSpc， ver.2.2计算金樱子各样品的遗传相似度，绘制聚类分析树状图。
2 结果与分析
2.1金樱子DNA检测结果
金樱子DNA检测结果见图1。由图1可知，电泳条带较为清晰可辨，说明供试DNA样品的浓度适合于后续试验。
2.2RAPD引物扩增检测结果
参考蔷薇科部分植物多态性随机引物，从35个随机引物中筛选出8个重复性好、多态性强的引物扩增，共得到86条带，其中84条表现出多态性，占总带数的97.67%，平均每个引物扩增的DNA带数为
10.75条。扩增位点分子量在200～2 000 bp（图2）。
图1金樱子DNA检测结果
图2引物S45的RAPD指纹图谱
2.3 聚类分析
由图3可知，金樱子RAPD扩增结果的遗传相似性系数在0.11～0.58，生长在不同地区金樱子的DNA具有一定的变异，供试品金樱子聚成了A、B、C三大类群。产自贵州铜仁的1～2号供试品聚为A类，产自乌当、马铃、黔桃、金沙、丹寨、兴仁、都匀、三都的3～29号供试品聚为B类；产自广东肇庆的30号供试品单独聚为C类。A、B两类群的亲缘关系较近，C与A、B的亲缘关系较远。
图3金樱子RAPD分子标记UPGMA聚类图 3结论与讨论
（1）该试验通过严格控制反应体系和条件，得到重复性好的扩增结果，有效地揭示供试样品金樱子种质资源具有丰富的遗传多样性与宽广的遗传基础。广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和。狭义的遗传多样性是指种内的遗传多样性，即种内个体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和。物种的遗传多样性越高，遗传变异越丰富，对外界环境变化的适应能力就越强，说明物种生存繁衍的能力越强。因而，可以利用其优良变异类型，创造新的变异，选育优良品种 [9-10]。
（2）该试验从35个RAPD引物中筛选出8个可扩增出清晰、稳定图谱的引物，用于指纹图谱构建，共扩增出86条带，其中多态性条带84条，平均多态性位点百分率（PPB）达97.67%。
（3）通过聚类分析，结果表明，30个居群RAPD扩增结果的遗传相似性系数在0.11～0.58，聚成A、B、C三大类群。
A、B两类群的亲缘关系较近，C与A、B的亲缘关系较远。
地理分布越近，金樱子居群间的遗传差异越小。产自贵州地区的金樱子之间有较近的亲缘关系。
（4）随机扩增多态性（RAPD）技术现已广泛应用于药用
植物种质资源及品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究。遗传资源保存和品种资源目录的建立都依赖对其遗传多样性及亲缘关系的掌握，该研究采用随机扩增多态性（RAPD）技术，为金樱子种质提供准确的遗传信息，并对其遗传多样性及亲缘关系进行了科学分析，该研究结果对金樱子品种指纹图谱的构建、品质评价、种质资源保护等具有重要意义[11-14]。
参考文献
[1]
贵州省中药资源普查办公室，贵州省中药研究所. 贵州中药资源[M]. 北京：中国医药科技出版社， 1992：293-296.
[2] 李连芳，王晓丽. 贵州产金樱子多糖的含量测定[J]. 贵阳医学院学报，2013，38（2）：162-168.
[3] 曹运长，文红波，吴玉兰，等. 金樱子总黄酮对过氧化氢损伤内皮细胞的保护作用[J].时珍国医国药，2013， 24（5）：1159-1161.
[4] 刘学贵，李佳骆，高品一，等.药食两用金樱子的研究进展[J].食品科学，2013，34（11）：392-398.
[5] 陈祖云，王晓丽，宋聚先.贵州天麻遗传多态性的ISSR初步分析[J].中华中医药杂志，2007，22（7）：436-439.
[6] 王晓玲，王晓多.天麻总DNA提取的研究[J].世界科学技术-中医药现代，2005，7（2）：110-111.
[7] 邹佳宁，宋聚先，常楚瑞，等.贵州天麻种质资源的RAPD分析[J].中药材，2006，29（9）：881-883.
[8] 陈阳，周先治，陈晟，等.花椰菜RAPD随机引物的筛选[J].中国农学通报，2010，26（12）：22-25.
[9] 陈祥平，范小敏，柯皓天，等.湖北省桑属植物亲缘关系RAPD分析[J].安徽农业科学，2014，42（7）：1917-1920.
[10] MA X，CHEN S Y，BAI S Q，et al. RAPD analysis of genetic diversity and population structure of Elymus sibiricus（ Poaceae ） native to the southeastern Qinghai Tibet Plateau，China[J]. Genet Mol Res，2012，11（ 3） ： 2708-2718.
[11] 李小梅，张立微，张景涛.芫荽遗传多样性RAPD分析[J].北方园艺，2014（15）：97-100.
[12] 王晓丽，王晓玲，王晓多.天麻亲本材料的分子标记[J].贵州农业科学，2010，38（2）：10-12.
[13] 王晓丽，陈祖云，宋聚先.野生与杂交天麻的DNA标记鉴定[J].安徽农业科学，2010，38（27）：14860，14916.
[14] 王晓丽，常楚瑞，宋聚先，等.天麻不同种质的AFLP和SSR分析[J].中华中医药杂志（原中国医药学报），2012，27（3）：555-558.
关键词金樱子；随机扩增多态性DNA；亲缘关系
中图分类号S188；R284.2文献标识码A文章编号0517-6611（2015）07-023-02
金樱子为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx.的干燥成熟果实，又名倒蜂糖罐、糖桔子、刺梨子、山石榴等，性酸、涩、平，能补肾益气、补血益精、涩精缩尿、止泻。久服令人耐寒轻身。现代药理研究表明，金樱子具有抗氧化、免疫调节、降血糖、降低血清胆固醇含量、降血脂、抗动脉粥样硬化等功能，并有明显的抑菌及抗病毒等作用。主要用于治疗尿频遗尿、遗精滑精、久泻久痢、白带过多、妇女子宫脱垂等症。因其富含维生素C、糖等，民间将其果实作为食用；也可用于泡酒，金樱子酒具有滋补、强身健体的功效。2002年，我国卫生部将金樱子列入保健食品的行列。金樱子具有药食同源的重要价值，开发应用前景十分广阔，经济效益潜力颇大。金樱子在我国西南、华南、华中、华东均有分布，尤其以贵州分布最广，产量最高，是贵州大宗药材之一。目前关于全樱子随机扩增多态性DNA分析国内外尚未见报道[1-5]。为了探讨以贵州为主不同生长地区金樱子的遗传分化情况，笔者在DNA分子水平上，采用RAPD（DNA随机扩增多态性）分子标记技术，对金樱子的遗传多样性和亲缘关系进行分析，为对金樱子优良性评价和资源保护具有十分重要的意义。
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1.6PCR反应体系和程序
PCR反应体系总体积20 μl：ddH2O 6.5 μl，2×PCRMix10 μl，引物（10 μmol/L ）1.5 μl，DNA 2 μl。反应程序：94 ℃预变性8 min，然后进行35个循环（每个循环包括94 ℃变性30 s、36 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min） ，最后在72 ℃下延伸10 min。PCR反应产物加2 μl上样缓冲液（40%蔗糖、0.25%溴酚蓝） ，经电压110 V，电泳50 min，1.5%琼脂糖检测，然后用溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色10 min，并在凝胶成像仪（UVP，GDS7600G）系统下拍照记录。每个反应重复2 次，确定所得条带的可重复性。
1.7数据分析
记录金樱子RAPD扩增出的总条带数，记录可辨认的、2次扩增结果一致的条带。经Gel-Pro Analyzer Version 4.5软件识别，根据扩增条带的迁移率，同一迁移率有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，采用软件SYSpc， ver.2.2计算金樱子各样品的遗传相似度，绘制聚类分析树状图。
2 结果与分析
2.1金樱子DNA检测结果
金樱子DNA检测结果见图1。由图1可知，电泳条带较为清晰可辨，说明供试DNA样品的浓度适合于后续试验。
2.2RAPD引物扩增检测结果
参考蔷薇科部分植物多态性随机引物，从35个随机引物中筛选出8个重复性好、多态性强的引物扩增，共得到86条带，其中84条表现出多态性，占总带数的97.67%，平均每个引物扩增的DNA带数为
10.75条。扩增位点分子量在200～2 000 bp（图2）。
图1金樱子DNA检测结果
图2引物S45的RAPD指纹图谱
2.3 聚类分析
由图3可知，金樱子RAPD扩增结果的遗传相似性系数在0.11～0.58，生长在不同地区金樱子的DNA具有一定的变异，供试品金樱子聚成了A、B、C三大类群。产自贵州铜仁的1～2号供试品聚为A类，产自乌当、马铃、黔桃、金沙、丹寨、兴仁、都匀、三都的3～29号供试品聚为B类；产自广东肇庆的30号供试品单独聚为C类。A、B两类群的亲缘关系较近，C与A、B的亲缘关系较远。
图3金樱子RAPD分子标记UPGMA聚类图 3结论与讨论
（1）该试验通过严格控制反应体系和条件，得到重复性好的扩增结果，有效地揭示供试样品金樱子种质资源具有丰富的遗传多样性与宽广的遗传基础。广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和。狭义的遗传多样性是指种内的遗传多样性，即种内个体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和。物种的遗传多样性越高，遗传变异越丰富，对外界环境变化的适应能力就越强，说明物种生存繁衍的能力越强。因而，可以利用其优良变异类型，创造新的变异，选育优良品种 [9-10]。
（2）该试验从35个RAPD引物中筛选出8个可扩增出清晰、稳定图谱的引物，用于指纹图谱构建，共扩增出86条带，其中多态性条带84条，平均多态性位点百分率（PPB）达97.67%。
（3）通过聚类分析，结果表明，30个居群RAPD扩增结果的遗传相似性系数在0.11～0.58，聚成A、B、C三大类群。
A、B两类群的亲缘关系较近，C与A、B的亲缘关系较远。
地理分布越近，金樱子居群间的遗传差异越小。产自贵州地区的金樱子之间有较近的亲缘关系。
（4）随机扩增多态性（RAPD）技术现已广泛应用于药用
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[8] 陈阳，周先治，陈晟，等.花椰菜RAPD随机引物的筛选[J].中国农学通报，2010，26（12）：22-25.
[9] 陈祥平，范小敏，柯皓天，等.湖北省桑属植物亲缘关系RAPD分析[J].安徽农业科学，2014，42（7）：1917-1920.
[10] MA X，CHEN S Y，BAI S Q，et al. RAPD analysis of genetic diversity and population structure of Elymus sibiricus（ Poaceae ） native to the southeastern Qinghai Tibet Plateau，China[J]. Genet Mol Res，2012，11（ 3） ： 2708-2718.
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