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【摘 要】 目的：以汉防己甲素和汉防己乙素的提取率作为考察指标，优化防己中汉防己甲素和汉防己乙素的提取工艺。方法：利用高效液相色谱法测定汉防己甲素和汉防己乙素的含量，采用响应曲面法考察乙醇体积分数、料液比及超声时间对提取效果的影响。结果：Design expert 10预测得到汉防己甲素最佳提取工艺为乙醇浓度为60%，料液比为1∶ 36.07，超声时间为57.12min，提取率为13.53mg/g;最佳提取汉防己乙素的提取工艺为乙醇浓度62.49%，料液比为1∶ 37.71，超声时间为59.38min，提取率为8.71mg/g。结论：该研究为防己中防己甲素和汉防己乙素的提取工艺提供实验依据。
【关键词】 汉防己甲素;汉防己乙素;防己;响应曲面法
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）1-0025-06
Abstract：Objective To optimize operation conditions for tetrandrine and hanfangichin B from Stephaniatetrandra S.Moore using yields as index.Methods HPLC was used to determine the concentrations of tetrandrine and hanfangichin B. Operation condition （ethanol volume fraction， solid-liquids ratio and ultrasonic time） were optimized with response surface methodology. Results According to the Design Expert 10 software as follows：the optimum operating paramaters were： ethanol volume fraction were 60% and 62.49%， solid-liquids ratio were 1∶ 36.07 and 1∶ 37.71， ultrasonic time were 57.12 min and 59.38 min for tetrandrine and hanfangichin B. The highest extraction rate of tetrandrine and hanfangichin B were 13.53mg/g and 8.71mg/g. Conclusion The optimized conditions are reliable and provide experiment evidences for the optimal extraction technology for tetrandrine and hanfangichin B from Stephaniatetrandra S.Moore.
Keywords：Tetrandrine;Hanfangichin B; Stephaniatetrandra S. Moore; Box-Behnken
防己为防己科植物粉防己（Stephaniatetrandra S.Moore）的干燥根，具有祛风止痛、利水消肿、用于风湿痹痛、水肿脚气、小便不利、湿疹疮毒等[1]。防己中的汉防己甲素（又名粉防己碱）和汉防己乙素（又名防己诺林碱）为其主要的活性成分，两者均为天然的双苄基异喹啉类生物碱，汉防己甲素具有抗肿瘤、抗炎、抗心律失常、抗菌、降压等作用[2]，以其为主要成分的中成药“汉防己甲素”和“汉防己甲素注射液”广泛用于临床上对各期矽肺病的治疗[3-4]。汉防己乙素具有抗肝缺血再灌注损伤、诱导人肺癌95D细胞凋亡等作用[5-6]。本实验拟采用单因素试验结合响应曲面法优化防己中的汉防己甲素及汉防己乙素的提取工艺，为防己中的活性成分研究及深度开发利用提供理论依据。
1 材料
1.1 仪器 数显恒温水浴鍋HH-S2（金坛市医疗仪器厂），JJ224BC电子天平（常熟双杰），Waters2695 高效液相色谱仪（日本 Waters 公司），KS-3200DE超声波清洗器（昆山洁力美），LDZ4-0.8A离心机（北京医用离心机厂）。
1.2 药材与试剂 防己药材由广西大海阳光药业有限公司提供;汉防己甲素HPLC≥98%（YM0311YBB，上海源叶生物）;汉防己乙素HPLC≥98%（RO1A6F2，上海源叶生物）;乙腈、甲醇、二乙胺为色谱纯;乙醇为分析纯;水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 汉防己甲素和汉防己乙素测定方法
2.1.1 HPLC色谱条件 色谱柱C18柱（4.6mm×250mm，5μm）;流动相：乙腈-甲醇-0.1%二乙胺（30∶ 35∶ 35）;检测波长：282nm;柱温：25℃;理论塔板数：按汉防己甲素峰计算不低于5000;流速：1.0mL/min;进样量：10μL。如图1所示。
2.1.2 溶液配制 ①对照贮备液：分别精密称取12.5mg汉防己甲素、汉防己乙素，用甲醇溶解，定容至25mL量瓶中，摇匀，即得500μg/mL的混合对照品溶液。②供试品溶液：精密称取1.0g防几药材，加适量超声提取得溶液到供试品。按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，如图1所示。2.1.3 标准曲线绘制 分别精密吸取对照品溶液贮备液0.8、1.2、1.6、2、2.4、3. 2mL，稀释到10mL，摇匀，得到40、60、80、100、120、160μg/mL混合对照品溶液。以甲醇作为空白溶液，注入色谱仪，以峰面积为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得汉防己甲素回归方程Y=9038.4X-100992，相关系数r2=0.9997;汉防己乙素回归方程Y=7137X-38969，相关系数r2=0.9998。 2.2 单因素提取试验
2.2.1 乙醇体积分数 称取防几药材粉末1.0g，在料液比1∶ 40g/mL，超声时间40min，分别以60%、70%、80%、95%、100%乙醇提取，结果如图2所示。汉防己甲素、汉防己乙素均在70%提取率最高。2.2.2 料液比 称取防己药材粉末1.0g，在乙醇浓度95%，超声时间40min的条件下，分别以料液比（g∶ mL）1∶ 20、1∶ 30、1∶ 40、1∶ 50、1∶ 60进行提取，结果如图3所示。汉防己甲素在料液比1∶ 40时，提取率最高，汉防己乙素在1∶ 50时提取率最高。2.2.3 超声时间的影响 称取防己药材粉末1.0g，在乙醇浓度95%，在料液比1∶ 40g/mL，分别提取20、30、40、50、60min，结果如图4所示。在20～50min汉防己甲素及汉防己乙素的提取率均呈上升趋势，超过50min提取率下降，因此超声时间在50min较合适。2.3 响应曲面实验设计 根据单因素试验结果和响应面中心组合试验设计原理，选取3个因素为响应因素，浸膏中汉防己甲素、汉防己乙素提取率为响应值，运用Design-Expert 10软件设计三因素三水平响应面试验，结果见表1。
2.4 响应面优化试验结果 试验方案及结果见表2。
拟合试验数据，建立二次多元回归方程：R（汉防己甲素） =13.08-0.42B+0.15B+0.24C+0.20AB-7.500E-0.03AC-0.060BC-0.066A2-0.12B2-0.19C2;R （汉防己乙素） =8.33-0.51A-0.27B+0.073C+0.19AB-0.22AC-0.15BC-0.52 A2-0.33 B2-0.044C2，对其进行方差分析，结果见表3、表4。
对表3中的数据进行分析，由模型P值可知，该模型拟合程度良好，汉防己甲素的提取率与各试验因素之间的线性关系显著（R2 = 0.9327），校正系数R2Adj = 0.8461，说明84.61%的汉防己甲素提取率变化可用该模型解释，因此可用该模型分析和预测汉防己甲素提取率。由F值可知，三个因素对汉防己甲素提取率的影响顺序为：A（乙醇浓度） > C（超声时间） > B（料液比）;由P值可知，二次项中，3个因素均对提取率影响极显著;交互相中，A（乙醇体积分数）与B（料液比）之间作用显著。为评价A（乙醇体积分数）与B（固液比）之間的交互作用对汉防己甲素提取率的显著影响及确定各因素的最佳水平范围，分别绘制如图5的响应面图和等高线图。从图5中看出，以上响应面形状均较陡，等高线呈明显的椭圆形，说明各交互作用均较为明显。求解二次多元回归方程，最佳提取汉防己甲素工艺为乙醇浓度为60%，料液比为1∶ 36.07，超声时间为57.12min，提取率为13.53mg/g。
对表4中的数据进行分析，由模型P值可知，该模型拟合程度良好，汉防己乙素的提取率与各试验因素之间的线性关系显著（R2 = 0.9679），校正系数R2Adj = 0.9265，说明92.65%的汉防己乙素提取率变化可用该模型解释，因此可用该模型分析和预测柠檬酚提取率。由F值可知，三个因素对汉防己乙素提取率的影响顺序为：A（乙醇浓度） > B（料液比） > C（超声时间）;由P值可知，二次项中，A（乙醇浓度）、B（料液比）对提取率影响显著;交互相中，A（乙醇体积分数）与B（固液比）、A（乙醇体积分数）与C（超声时间）之间作用显著。为评价A（乙醇体积分数）与B（固液比）、A（乙醇体积分数）与C（超声时间）之间的交互作用对汉防己乙素提取率的显著影响及确定各因素的最佳水平范围，分别绘制如图5的响应面图和等高线图。从图6～7中看出，以上响应面形状均较陡，等高线呈明显的椭圆形，说明各交互作用均较为明显。求解二次多元回归方程，最佳提取汉防己乙素工艺为乙醇浓度为62.49%，料液比为1∶ 37.71，超声时间为59.38min，提取率为8.71mg/g。
2.5 验证试验 在最佳提取汉防己甲素工艺乙醇体积分数为60%，料液比为1∶ 36.07，超声时间为57.12min，进行3次试验，提取率分别为13.48mg/g、13.51mg/g、13.54mg/g，平均值为13.51mg/g。在最佳提取汉防己乙素工艺乙醇体积分数为62.49%，料液比为1∶ 37.71，超声时间为59.38min，提取率分别为为8.75mg/g、8.74mg/g、8.67mg/g，平均值为8.72mg/g。结果分析见表5，试验值与理论值无显著性差异。
3 讨论
在选择提取溶剂时考察了乙醇、甲醇两种溶剂，发现防己中汉防己甲素和汉防己乙素在甲醇中提取率低，这是由于两种生物碱为双苄基异喹啉类生物碱，碱性较强，容易结合氢离子成盐，在甲醇中溶解率低[7]。
用乙醇进行超声提取防己药材仅得到汉防己甲素和汉防己乙素的粗提物，需进一步纯化才能得到高纯度的汉防己甲素和汉防己乙素。杨欣欣等采用AB-8大孔树脂法进行分离纯化，但汉防己甲素和汉防己乙素的纯度仅为50%[8]。魏晋宝等采用回流提取、萃取、氧化铝色谱柱层析、重结晶法得到了高纯度的汉防己甲素[9]。
本实验采用响应曲面法考察乙醇体积分数、料液比及超声时间对提取效果的影响。Design expert 10预测得到汉防己甲素最佳提取工艺为乙醇浓度为60%，料液比为1∶ 36.07，超声时间为57.12 min，提取率为13.53mg/g;最佳提取汉防己乙素的提取工艺为乙醇浓度62.49%，料液比为1∶ 37.71，超声时间为59.38min，提取率为8.71mg/g，验证值与预测值相近，本实验的提取工艺及含量测定研究均为其今后的质量控制提供依据。
参考文献
[1]国家药典委员.中国药典（一部）[S]. 北京：中国医药科技出版社，2015：148
[2]季宇彬，魏驰，辛国松.粉防己碱抗肿瘤机制的研究进展[J]. 中成药，2018，40（12）：2724-2728.
[3]宋占帅，张娟，张蓉，等.补阳还五汤联合汉防己甲素片改善矽肺病纤维化效果观察[J]. 山东医药，2017，57（42）：51-53.
[4]范为民，赵春江.基于JAK通路探讨汉防己甲素改善佐剂性关节炎大鼠滑膜血管新生的机制[J]. 中药新药与临床药理，2018，29（6）：725-730.
[5]刘正，金京顺，张华芳，等. 汉防己乙素抗肝缺血再灌注损伤[J]. 基础医学与临床，2006，26（11）：1262-1263
[6]于有江，罗雪，叶记林，等. 汉防己乙素对人肺癌95D细胞凋亡的诱导作用及机制[J]. 山东医药，2017，57（38）：5-7.
[7]刘永刚，刘勇，何瑞杰，等. HPLC测定防己中防己诺林碱和粉防己碱的含量[J]. 中国实验方剂学杂志，2010，16（9）：49-51.
[8]杨欣欣，包永睿，王帅，等. 防己生物碱类成分提取纯化工艺研究[J]. 中成药，2014，36（6）：1306-1309.
[9]魏晋宝，杨光义，张晨宁，等. 粉防己中汉防己甲素的提取分离纯化工艺研究[J]. 中国药师，2016，19（11）：2029-2031.
（收稿日期：2019-11-27 编辑：程鹏飞）
【关键词】 汉防己甲素;汉防己乙素;防己;响应曲面法
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）1-0025-06
Abstract：Objective To optimize operation conditions for tetrandrine and hanfangichin B from Stephaniatetrandra S.Moore using yields as index.Methods HPLC was used to determine the concentrations of tetrandrine and hanfangichin B. Operation condition （ethanol volume fraction， solid-liquids ratio and ultrasonic time） were optimized with response surface methodology. Results According to the Design Expert 10 software as follows：the optimum operating paramaters were： ethanol volume fraction were 60% and 62.49%， solid-liquids ratio were 1∶ 36.07 and 1∶ 37.71， ultrasonic time were 57.12 min and 59.38 min for tetrandrine and hanfangichin B. The highest extraction rate of tetrandrine and hanfangichin B were 13.53mg/g and 8.71mg/g. Conclusion The optimized conditions are reliable and provide experiment evidences for the optimal extraction technology for tetrandrine and hanfangichin B from Stephaniatetrandra S.Moore.
Keywords：Tetrandrine;Hanfangichin B; Stephaniatetrandra S. Moore; Box-Behnken
防己为防己科植物粉防己（Stephaniatetrandra S.Moore）的干燥根，具有祛风止痛、利水消肿、用于风湿痹痛、水肿脚气、小便不利、湿疹疮毒等[1]。防己中的汉防己甲素（又名粉防己碱）和汉防己乙素（又名防己诺林碱）为其主要的活性成分，两者均为天然的双苄基异喹啉类生物碱，汉防己甲素具有抗肿瘤、抗炎、抗心律失常、抗菌、降压等作用[2]，以其为主要成分的中成药“汉防己甲素”和“汉防己甲素注射液”广泛用于临床上对各期矽肺病的治疗[3-4]。汉防己乙素具有抗肝缺血再灌注损伤、诱导人肺癌95D细胞凋亡等作用[5-6]。本实验拟采用单因素试验结合响应曲面法优化防己中的汉防己甲素及汉防己乙素的提取工艺，为防己中的活性成分研究及深度开发利用提供理论依据。
1 材料
1.1 仪器 数显恒温水浴鍋HH-S2（金坛市医疗仪器厂），JJ224BC电子天平（常熟双杰），Waters2695 高效液相色谱仪（日本 Waters 公司），KS-3200DE超声波清洗器（昆山洁力美），LDZ4-0.8A离心机（北京医用离心机厂）。
1.2 药材与试剂 防己药材由广西大海阳光药业有限公司提供;汉防己甲素HPLC≥98%（YM0311YBB，上海源叶生物）;汉防己乙素HPLC≥98%（RO1A6F2，上海源叶生物）;乙腈、甲醇、二乙胺为色谱纯;乙醇为分析纯;水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 汉防己甲素和汉防己乙素测定方法
2.1.1 HPLC色谱条件 色谱柱C18柱（4.6mm×250mm，5μm）;流动相：乙腈-甲醇-0.1%二乙胺（30∶ 35∶ 35）;检测波长：282nm;柱温：25℃;理论塔板数：按汉防己甲素峰计算不低于5000;流速：1.0mL/min;进样量：10μL。如图1所示。
2.1.2 溶液配制 ①对照贮备液：分别精密称取12.5mg汉防己甲素、汉防己乙素，用甲醇溶解，定容至25mL量瓶中，摇匀，即得500μg/mL的混合对照品溶液。②供试品溶液：精密称取1.0g防几药材，加适量超声提取得溶液到供试品。按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，如图1所示。2.1.3 标准曲线绘制 分别精密吸取对照品溶液贮备液0.8、1.2、1.6、2、2.4、3. 2mL，稀释到10mL，摇匀，得到40、60、80、100、120、160μg/mL混合对照品溶液。以甲醇作为空白溶液，注入色谱仪，以峰面积为纵坐标，以对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得汉防己甲素回归方程Y=9038.4X-100992，相关系数r2=0.9997;汉防己乙素回归方程Y=7137X-38969，相关系数r2=0.9998。 2.2 单因素提取试验
2.2.1 乙醇体积分数 称取防几药材粉末1.0g，在料液比1∶ 40g/mL，超声时间40min，分别以60%、70%、80%、95%、100%乙醇提取，结果如图2所示。汉防己甲素、汉防己乙素均在70%提取率最高。2.2.2 料液比 称取防己药材粉末1.0g，在乙醇浓度95%，超声时间40min的条件下，分别以料液比（g∶ mL）1∶ 20、1∶ 30、1∶ 40、1∶ 50、1∶ 60进行提取，结果如图3所示。汉防己甲素在料液比1∶ 40时，提取率最高，汉防己乙素在1∶ 50时提取率最高。2.2.3 超声时间的影响 称取防己药材粉末1.0g，在乙醇浓度95%，在料液比1∶ 40g/mL，分别提取20、30、40、50、60min，结果如图4所示。在20～50min汉防己甲素及汉防己乙素的提取率均呈上升趋势，超过50min提取率下降，因此超声时间在50min较合适。2.3 响应曲面实验设计 根据单因素试验结果和响应面中心组合试验设计原理，选取3个因素为响应因素，浸膏中汉防己甲素、汉防己乙素提取率为响应值，运用Design-Expert 10软件设计三因素三水平响应面试验，结果见表1。
2.4 响应面优化试验结果 试验方案及结果见表2。
拟合试验数据，建立二次多元回归方程：R（汉防己甲素） =13.08-0.42B+0.15B+0.24C+0.20AB-7.500E-0.03AC-0.060BC-0.066A2-0.12B2-0.19C2;R （汉防己乙素） =8.33-0.51A-0.27B+0.073C+0.19AB-0.22AC-0.15BC-0.52 A2-0.33 B2-0.044C2，对其进行方差分析，结果见表3、表4。
对表3中的数据进行分析，由模型P值可知，该模型拟合程度良好，汉防己甲素的提取率与各试验因素之间的线性关系显著（R2 = 0.9327），校正系数R2Adj = 0.8461，说明84.61%的汉防己甲素提取率变化可用该模型解释，因此可用该模型分析和预测汉防己甲素提取率。由F值可知，三个因素对汉防己甲素提取率的影响顺序为：A（乙醇浓度） > C（超声时间） > B（料液比）;由P值可知，二次项中，3个因素均对提取率影响极显著;交互相中，A（乙醇体积分数）与B（料液比）之间作用显著。为评价A（乙醇体积分数）与B（固液比）之間的交互作用对汉防己甲素提取率的显著影响及确定各因素的最佳水平范围，分别绘制如图5的响应面图和等高线图。从图5中看出，以上响应面形状均较陡，等高线呈明显的椭圆形，说明各交互作用均较为明显。求解二次多元回归方程，最佳提取汉防己甲素工艺为乙醇浓度为60%，料液比为1∶ 36.07，超声时间为57.12min，提取率为13.53mg/g。
对表4中的数据进行分析，由模型P值可知，该模型拟合程度良好，汉防己乙素的提取率与各试验因素之间的线性关系显著（R2 = 0.9679），校正系数R2Adj = 0.9265，说明92.65%的汉防己乙素提取率变化可用该模型解释，因此可用该模型分析和预测柠檬酚提取率。由F值可知，三个因素对汉防己乙素提取率的影响顺序为：A（乙醇浓度） > B（料液比） > C（超声时间）;由P值可知，二次项中，A（乙醇浓度）、B（料液比）对提取率影响显著;交互相中，A（乙醇体积分数）与B（固液比）、A（乙醇体积分数）与C（超声时间）之间作用显著。为评价A（乙醇体积分数）与B（固液比）、A（乙醇体积分数）与C（超声时间）之间的交互作用对汉防己乙素提取率的显著影响及确定各因素的最佳水平范围，分别绘制如图5的响应面图和等高线图。从图6～7中看出，以上响应面形状均较陡，等高线呈明显的椭圆形，说明各交互作用均较为明显。求解二次多元回归方程，最佳提取汉防己乙素工艺为乙醇浓度为62.49%，料液比为1∶ 37.71，超声时间为59.38min，提取率为8.71mg/g。
2.5 验证试验 在最佳提取汉防己甲素工艺乙醇体积分数为60%，料液比为1∶ 36.07，超声时间为57.12min，进行3次试验，提取率分别为13.48mg/g、13.51mg/g、13.54mg/g，平均值为13.51mg/g。在最佳提取汉防己乙素工艺乙醇体积分数为62.49%，料液比为1∶ 37.71，超声时间为59.38min，提取率分别为为8.75mg/g、8.74mg/g、8.67mg/g，平均值为8.72mg/g。结果分析见表5，试验值与理论值无显著性差异。
3 讨论
在选择提取溶剂时考察了乙醇、甲醇两种溶剂，发现防己中汉防己甲素和汉防己乙素在甲醇中提取率低，这是由于两种生物碱为双苄基异喹啉类生物碱，碱性较强，容易结合氢离子成盐，在甲醇中溶解率低[7]。
用乙醇进行超声提取防己药材仅得到汉防己甲素和汉防己乙素的粗提物，需进一步纯化才能得到高纯度的汉防己甲素和汉防己乙素。杨欣欣等采用AB-8大孔树脂法进行分离纯化，但汉防己甲素和汉防己乙素的纯度仅为50%[8]。魏晋宝等采用回流提取、萃取、氧化铝色谱柱层析、重结晶法得到了高纯度的汉防己甲素[9]。
本实验采用响应曲面法考察乙醇体积分数、料液比及超声时间对提取效果的影响。Design expert 10预测得到汉防己甲素最佳提取工艺为乙醇浓度为60%，料液比为1∶ 36.07，超声时间为57.12 min，提取率为13.53mg/g;最佳提取汉防己乙素的提取工艺为乙醇浓度62.49%，料液比为1∶ 37.71，超声时间为59.38min，提取率为8.71mg/g，验证值与预测值相近，本实验的提取工艺及含量测定研究均为其今后的质量控制提供依据。
参考文献
[1]国家药典委员.中国药典（一部）[S]. 北京：中国医药科技出版社，2015：148
[2]季宇彬，魏驰，辛国松.粉防己碱抗肿瘤机制的研究进展[J]. 中成药，2018，40（12）：2724-2728.
[3]宋占帅，张娟，张蓉，等.补阳还五汤联合汉防己甲素片改善矽肺病纤维化效果观察[J]. 山东医药，2017，57（42）：51-53.
[4]范为民，赵春江.基于JAK通路探讨汉防己甲素改善佐剂性关节炎大鼠滑膜血管新生的机制[J]. 中药新药与临床药理，2018，29（6）：725-730.
[5]刘正，金京顺，张华芳，等. 汉防己乙素抗肝缺血再灌注损伤[J]. 基础医学与临床，2006，26（11）：1262-1263
[6]于有江，罗雪，叶记林，等. 汉防己乙素对人肺癌95D细胞凋亡的诱导作用及机制[J]. 山东医药，2017，57（38）：5-7.
[7]刘永刚，刘勇，何瑞杰，等. HPLC测定防己中防己诺林碱和粉防己碱的含量[J]. 中国实验方剂学杂志，2010，16（9）：49-51.
[8]杨欣欣，包永睿，王帅，等. 防己生物碱类成分提取纯化工艺研究[J]. 中成药，2014，36（6）：1306-1309.
[9]魏晋宝，杨光义，张晨宁，等. 粉防己中汉防己甲素的提取分离纯化工艺研究[J]. 中国药师，2016，19（11）：2029-2031.
（收稿日期：2019-11-27 编辑：程鹏飞）