【摘 要】
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目的:制备用于铜绿假单胞菌PAO1 quiP基因(PA1032)实时荧光定量PCR检测的质粒标准品pMD18-quiP.方法:通过PCR扩增出目的片断,纯化后连接至pMD18-T载体,转化宿主菌E.coli DH5
【机 构】
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武汉长江航运总医院(武汉,430015);华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科
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目的:制备用于铜绿假单胞菌PAO1 quiP基因(PA1032)实时荧光定量PCR检测的质粒标准品pMD18-quiP.方法:通过PCR扩增出目的片断,纯化后连接至pMD18-T载体,转化宿主菌E.coli DH5α,获得阳性克隆,通过PCR扩增、双酶切鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确,大量抽提重组质粒,测定其拷贝浓度,10倍稀释成梯度标准品,并进行荧光定量PCR检测分析.结果:quiP基因目的片段成功重组至pMD18 -T载体上,获得的重组质粒保持了目的片段的特异性和序列完整性.梯度浓度标准质粒的荧光定量PCR结果显示,循环阈值(Ct)与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系.结论:成功构建了quiP基因实时荧光定量PCR质粒标准品.
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