补肾固表颗粒对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响

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   摘要:目的  观察补肾固表颗粒对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响,探讨其作用机制。方法  将60只ICR雄性小鼠随机分为空白对照组、模型组、玉屏风组和补肾固表高、中、低剂量组,除空白对照组外,其余各组小鼠腹腔注射环磷酰胺50 mg/(kg·d),连续3 d,建立免疫抑制动物模型,各给药组给予相应药物,连续28 d。末次给药后眼球取血,脱颈处死小鼠后无菌取出脾脏,MTT法检测脾淋巴细胞增殖,LDH法检测NK细胞活力,ELISA检测血清白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)水平。结果  与空白对照组比较,模型组小鼠脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞活力、IL-2和IFN-γ水平均明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,补肾固表各剂量组小鼠脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞活力、IL-2和IFN-γ水平均明显增强(P<0.05,P<0.01,P<0.001),脾脏质量及营养状况亦有改善。结论  补肾固表颗粒通过增强免疫低下小鼠脾淋巴细胞转化和杀伤能力,提高血清IL-2和IFN-γ分泌水平,从而改善机体的免疫功能。
   关键词:补肾固表颗粒;白细胞介素-2;干扰素-γ;NK细胞活力;脾淋巴细胞增殖;小鼠
   中图分类号:R285.5    文献标识码:A    文章编号:1005-5304(2019)07-0052-04
   Abstract: Objective To investigate the effects of Bushen Gubiao Granules on the immune function of immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide; To explore the mechanism of immune function regulation. Methods Totally sixty ICR male mice were randomly divided into blank control group, model group, Yupingfeng group, Bushen Gubiao Granules high-, medium- and low-dosage groups. Except for the blank control group, the other groups were injected cyclophosphamide 50 mg/(kg·d) intraperitoneally for 3 consecutive days to establish an animal model of immunosuppression. Each administration group was given the corresponding medicine for gavage for 28 days. After the last administration, the eyeballs were bled; the mice were sacrificed by cervical dislocation; the spleens were aseptically removed. The proliferation of spleen lymphocytes was detected by MTT colorimetry. The killing activity of NK cells was detected by LDH method. Serum levels of IL-2 and IFN-γ were detected by ELISA. Results Compared with the blank control group, the spleen lymphocyte proliferation, NK cell activity, IL-2 and IFN-γ levels in the model group were significantly lower (P<0.05, P<0.01). Compared with the model group, Bushen Gubiao Granules high-, medium- and low-dosage groups could significantly enhance the proliferation of mouse spleen lymphocytes and NK cell killing activity, and increase serum IL-2 and IFN-γ levels (P<0.05, P<0.01, P<0.001). The
   補肾固表颗粒由补骨脂、黄芪、柴胡、防风、白术、乌梅按1∶2∶1∶1∶1比例制成,具有补肾固表、健脾益肺、和解祛邪功效。原方是虞坚尔教授根据小儿肺肾不足的生理特点创制,临床主要运用于小儿反复呼吸道感染缓解期的治疗,疗效显著,尤其对患儿汗多、食少等症状有明显的改善作用[1]。前期研究发现,补肾固表方对氢化可的松所致免疫功能低下小鼠免疫指标及血清皮质醇水平均有显著改善[2]。玉屏风颗粒在儿童呼吸系统疾病中的临床应用已形成专家共识,在免疫学方面,动物体内体外实验表明,其可显著促进小鼠脾细胞增殖,提高地塞米松所致免疫功能低下小鼠模型淋巴细胞活力、抑制淋巴细胞凋亡,增加NK细胞活力[3-5]。本实验以玉屏风颗粒作为阳性对照,观察补肾固表颗粒对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)及NK细胞活力,脾淋巴细胞增殖能力的影响,探讨其对小鼠免疫功能的调节作用。   1  实验材料
  1.1  动物
   雄性健康ICR小鼠60只,SPF级,3~4周龄,体质量18~22 g,上海斯莱克实验动物有限责任公司公司提供,动物许可证号SOXK(沪)2007-0005。分笼饲养于厦门市医药研究所SPF级动物房,温度24~26 ℃,相对湿度50%~60%,通风良好,每日光照12 h,昼夜交替。
  1.2  药物
   补肾固表颗粒,厦门市医药研究所制剂室制备,批号20180425;玉屏风颗粒,广东环球制药有限公司,批号170918;环磷酰胺粉末(98%)100 mg,上海麦克林科技有限公司,批号C10196709。
  1.3  主要试剂与仪器
   YAC-1小鼠淋巴瘤细胞,上海富祥生物科技有限公司;刀豆蛋白A,Sigma公司,货号C5275-5MG;MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒,江苏凯基生物技术股份有限公司,批号20180419;乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;IL-2、IFN-γ ELISA试剂盒,武汉爱博泰克生物科技有限公司。Nikon倒置显微镜,上海普赫光电科技有限公司;SpectraMax M3全波长酶标仪,美谷分子仪器(上海)有限公司;Universal320高速离心机,德国Hettich公司;CO2细胞培养箱,新加坡Esco公司;梅特勒-托利多电子天平。
  2  实验方法
  2.1  分组及造模
   采用随机数字表法将60只ICR小鼠分为空白对照组、模型组、玉屏风组和补肾固表高、中、低剂量组,每组10只。除空白对照组外,其余各组小鼠参照文献[4-5]方法,腹腔注射环磷酰胺50 mg/(kg·d),连续3 d,建立免疫抑制动物模型。
  2.2  给药
   于造模结束后次日灌胃给药,补肾固表高、中、低剂量组给药剂量分别为36、18、9 g/(kg·d),玉屏风组给药剂量为2.25 g/(kg·d),空白对照组予等量生理盐水。给药体积均为0.5 mL/只,每日1次,连续28 d。
  2.3  观察指标及检测方法
   给药结束后次日,称取小鼠体质量,摘眼球取血制备血清。快速打开腹腔,无菌条件下摘取脾脏,用无菌纸吸干脏器表面血迹,电子天平称重,记录,制备脾淋巴细胞悬液。
  2.3.1  脾淋巴细胞增殖能力检测
   MTT法检测脾淋巴细胞增殖能力。吸取100 μL细胞悬液接种于96孔板,每份样品设6个复孔,前3个分别加入50 μL刀豆蛋白A(终浓度为5 μg/mL),后3个为对照孔,每孔加入50 μL RPMI-1640培养液。置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养24 h。培养结束前4 h,取出细胞培养板,严格按试剂盒说明书操作,结果以刺激指数(SI)表示。SI=试验孔OD490值÷对照孔OD490值。
  2.3.2  NK细胞活力检测
   LDH法检测NK细胞活力。取传代培养24~28 h、生长良好的YAC-1细胞,用RPMI-1640培养液洗涤2次,1000 r/min离心5 min。再以10%RPMI-1640培养液洗涤1次,然后悬浮,调整浓度至1×105/mL。在96孔细胞培养板中,试验孔加入效应细胞、靶细胞各100 ?L,每份样品设3个复孔,同时设靶细胞自然释放孔(100 ?L靶细胞+100 ?L培养液)和最大释放孔(100 ?L靶细胞+LDH释放试剂),置37 ℃、5%CO2孵育24 h,培养结束前1 h,从细胞培养箱里取出细胞培养板,在最大释放孔中加入试剂盒提供的LDH释放试剂,反复吹打数次混匀,继续在细胞培养箱中孵育。培养结束后,400×g离心5 min。吸取各孔上清120 ?L,置于新96孔板中,同时加入60 ?L新配制的LDH检测工作液,置于水平摇床,避光反应30 min。于酶标仪490 nm波长处测定各孔吸光度,计算NK细胞活力。结果以杀伤率表示。杀伤率(%)=(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)÷(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100%。
  2.3.3  血清白细胞介素-2和干扰素-γ水平检测
   取小鼠血清,ELISA检测小鼠血清IL-2与IFN-γ水平,严格按照试剂盒说明书进行操作。
  3  统计学方法
   采用SPSS25.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示,两样本均数比较采用独立样本t检验,多重比较采用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
  4  结果
  4.1  一般状况
   空白对照组小鼠毛发光亮,活动灵活,大便棕黑色,干湿适度;模型组小鼠腹腔注射环磷酰胺后第3日出现活动减少,食量下降,扎堆明显,喜抱团,易惊,毛色黯淡,出現阴囊皱缩,炸毛、掉毛现象;给予补肾固表颗粒28 d后小鼠食量逐渐增加,活动增多,扎堆减少,停止掉毛,毛色恢复柔顺光亮。
  4.2  补肾固表颗粒对小鼠体质量及脾脏质量的影响
   与空白对照组比较,模型组小鼠体质量和脾脏质量明显降低(P<0.05);与模型组比较,各给药组小鼠体质量和脾脏质量明显增加(P<0.05,P<0.001)。结果见表1。
  4.3  补肾固表颗粒对模型小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
   与空白对照组比较,模型组小鼠脾淋巴细胞增殖能力显著下降(P<0.01);与模型组比较,各给药组小鼠脾淋巴细胞增殖能力增强(P<0.05,P<0.01),并接近正常水平。结果见表2。
  4.4  补肾固表颗粒对模型小鼠NK细胞活力的影响    与空白对照组比较,模型组小鼠NK细胞活力明显降低(P<0.05);与模型组比较,各给药组小鼠NK细胞活力明显增强(P<0.05,P<0.01,P<0.001);与玉屏风组比较,补肾固表中、高剂量组小鼠NK细胞活力明显增强(P<0.05)。结果见表3。
  4.5  补肾固表颗粒对模型小鼠血清白细胞介素-2和干扰素-γ水平的影响
   与空白对照组比较,模型组小鼠血清IL-2和IFN-γ含量明显降低(P<0.05);与模型组比较,补肾固表各剂量组小鼠血清IL-2和IFN-γ含量明显升高(P<0.05,P<0.01);补肾固表中、高剂量组小鼠血清IL-2含量优于玉屏风组(P<0.05)。结果见表4。
  5  讨论
   补肾固表颗粒主要用于反复呼吸道感染缓解期的治疗,缓解期多以正虚卫表不固为主,治疗当以固本为要,补肺固表、健脾温肾。虞坚尔教授指出补肾实为固卫[6]。卫气是行于皮肤、分肉、腠理之间的精微物质,出于脾,功在肺,根于肾。方中补骨脂和黄芪为君药,共同发挥温肾健脾、固表止汗的作用;白术、防风一收一散,使邪去而不伤正;柴胡、黄芩为常用药对,清热疏肝、和解祛邪,在反复呼吸道感染缓解期,邪气尚未完全退去,正虚邪恋,用柴胡、黄芩以和解祛邪;乌梅敛肺止咳之功著。全方补中有清,以补为主,用药平和,组方精当,专为小儿特殊生理病理特点而设。现代药理研究表明,补骨脂在免疫器官、免疫细胞及免疫分子各个方面都有不同的促进或抑制作用,且补骨脂具有耐药性低、不良反应少、毒副作用小等优点[7]。黄芪可促进体液免疫,增强单核巨噬细胞的吞噬能力,刺激T、B淋巴细胞的吞噬,还能促进NK细胞功能。Du等[8]发现,黄芪多糖在促进T细胞增殖活性的同时诱导CD4+T细胞分泌IL-4、IL-2及IFN-γ。柴胡和黄芩可解热抗炎、抗病毒[9]。
   脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞活力、IL-2和IFN-γ是反映免疫功能的常用指标。脾脏是人体最主要的免疫器官,在维持机体免疫功能方面发挥着重要作用,它可以产生浆细胞和淋巴细胞,当抗原侵袭机体时产生免疫应答和免疫效应物质,还能合成干扰素、补体和细胞因子等生物活性物质。淋巴细胞增殖并产生效应淋巴细胞,清除非己抗原,维护机体内环境的稳定,淋巴细胞增殖能力决定了效应淋巴细胞的数量和机体免疫应答反应的强度,反映了机体的细胞免疫状态。NK细胞活力代表机体的天然防御功能,其作用范围远远大于杀伤性T细胞,其能杀伤某些病毒感染细胞,而对正常未感染细胞没有杀伤作用。NK细胞还能调节B淋巴细胞的分化并分泌IL-2、IFN-γ等。IL-2和IFN-γ是具有广泛的免疫调节作用的细胞因子。IL-2主要由T细胞产生,以自分泌和旁分泌方式发挥效应,具有重要的免疫调节作用。能活化T细胞,促进细胞因子产生,刺激NK细胞增殖,增强NK细胞活力及产生细胞因子。NK细胞和IL-2相互促进,增强机体的免疫功能。IFN-γ产生于CD4+T和CD8+T,可通过促进抗原提呈过程而增强免疫功能。
   本研究结果表明,腹腔注射环磷酰胺能建立稳定的免疫低下动物模型,与空白对照组比较,模型小鼠一般状况稍差,饮食减少,喜抱团,体质量减轻,脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞活力、血清IL-2和IFN-γ水平均明显下降,表明小鼠免疫功能降低。灌胃4周后,补肾固表颗粒能明显增强小鼠脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞活力(P<0.05),提高血清IL-2和IFN-γ水平(P<0.05,P<0.01),对脾脏质量及营养状况亦有改善。且补肾固表高剂量组对小鼠体质量、脾脏质量、NK细胞活力及IFN-γ水平均有显著提高(P<0.01)。补肾固表颗粒对脾脏质量、NK细胞活力及IL-2水平的提高优于玉屏风组。我们认为,补肾固表颗粒通过提高血清IL-2、IFN-γ、脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞活力,从而增强机体的免疫功能。
  参考文献:
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