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摘 要 以旗山野生蕉（Musa spp.，AB group）试管苗幼嫩叶片为材料，利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得野生蕉试管苗Mn-SOD基因cDNA序列。结果表明：旗山野生蕉Mn-SOD的cDNA全长序列共831 bp，其中5′UTR为137 bp，3′UTR为151 bp，3′端含有17个poly（A）尾。开放阅读框（ORF）共有543个碱基组成，编码181个氨基酸。蛋白理化性质预测结果显示：Mn-SOD蛋白分子量为20 108.8 u，等电点 7.92，属于碱性蛋白。
关键词 旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）；试管苗；基因克隆；Mn-SOD基因；生物信息学分析
中图分类号 Q943.2 文献标识码 A
Abstract The young leaves of in vitro plantlets of a wild banan（Musa spp.，AB group）grown in Qishan Mountain of Fuzhou were used as the materials to clone Mn-SOD gene by RT-PCR and RACE technology. The full-length cDNA sequence was 831 bp，containing 137 bp 5′UTR，543 bp open reading frame，encoding 181 amino acids，151 bp 3′UTR，and 3′-end involved 17 poly（A）tails. The prediction of protein’s physical and chemical properties showed it belonged to a basic protein with 20 108.8 u and pI7.92.
Key words Wild banana（Musa spp.，AB Group）；In vitro plantlets；Gene cloning；Mn-SOD；Bioinformatics analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.020
正常生命活动中，生物体内活性氧的产生与清除处于动态平衡状态，这种动态平衡是在超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等多种酶的协同作用下完成的[1]，而超氧化物歧化酶（SOD）则是生物体清除逆境反应所产生的活性氧（ROS）的关键酶，广泛存在于植物、动物、微生物中[2]，在清除活性氧和自由基、保护细胞免受氧化损伤、增加膜结构和功能稳定性、增强植物抗逆性等方面发挥重要作用[3]。根据所含金属辅基的不同主要分为3类：Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD，Cu/Zn-SOD主要存在于细胞质中，Mn-SOD主要存在于线粒体中，Fe-SOD主要存在于叶绿体中。
抗氧化酶基因是目前已经发现的与植物抗寒性有关的起膜保护作用的抗寒功能蛋白基因。在膜保护酶与抗寒性的研究中，以SOD的研究最多[4]。将外源SOD基因转到其他植物体内，可以提高逆境条件下植物体内SOD活性，降低胁迫条件下ROS对植物造成的损害，增强植物对各种逆境胁迫的适应性[5]。Bowler等[6]早在1989年就开始研究SOD在耐冻中的作用，该研究把烟草的Mn-SOD cDNA导入苜蓿中，发现转基因植株的SOD活性增强，认为是Mn-SOD抑制了超氧自由基的产生，从而提高抗寒能力。对桉树的抗寒性研究也发现，桉树SOD的活性与其耐寒性有关联，是桉树抗寒生理机制中的一个关键酶[7]。同时，SOD在植物抗病虫、抗旱、耐盐碱、抗涝、抗除草剂等方面也发挥着重要作用[8-9]。
香蕉属芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa）植物。起源于热带亚热带地区，生物学特性决定了其极易受寒害的侵袭，严重影响香蕉的品质和次年产量。多项研究发现施用外源物质在一定程度上可增加细胞保护酶的活性，提高香蕉抗寒能力[10]，但无法从根本上解决香蕉的寒害问题，也不适用于实际生产。截至目前还没有真正有效的方法从根本上解决寒害对香蕉造成的损失。栽培香蕉多数是三倍体、具有高度不育性，在生产上主要靠无性繁殖，很难采用传统的育种方法实现品种改良。因此，要从根本上解决香蕉的寒害问题，最有效的方法就是通过基因工程手段对栽培蕉进行品种改良，提高其抗寒性。吕庆芳等[11]研究发现粉蕉、大蕉（Musa spp.，ABB Group）能抵御0～4 ℃的低温，而野生蕉的抗寒性则更强，且种类不同抗寒性也存在差异，如福州野生蕉[12]（Musa spp.，AA Group）能耐-2 ℃以下的低温，而三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）能耐-5 ℃以下的低温[13]。香蕉（Musa spp.，AAA）则根本无法抵御0 ℃以下的低温。这说明香蕉的抗寒能力在本质上由自身的遗传物质所决定。
Baum等[14]首次从玉米中克隆得到植物SOD基因。随后，植物SOD基因的克隆在国内外迅速开展。目前已从水稻、拟南芥、烟草、柑橘、龙眼、小麦等多种植物中克隆得到Mn-SOD基因，部分已通过遗传转化验证了其功能。但该基因在香蕉中的克隆和研究较少，仅发现了香蕉（AAA）中的部分序列及全序列，在GenBank中的登录号分别为： AF510071.1和AEZ56248.2。目前关于福州旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）的Mn-SOD基因尚未见报道。近年来香蕉基因组测序工作的完成及生物技术的发展为香蕉遗传改良提供了一定的理论依据。本研究首次从福州旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）中克隆得到Mn-SOD基因的cDNA序列，并对其编码的氨基酸序列进行预测和分析，为利用基因工程进行香蕉的抗性育种奠定基础。 1 材料与方法
1.1 材料及主要试剂
供试材料为旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）离体保存试管苗幼嫩叶片；菌种DH5α感受态细胞及PCR反应液均购自北京天根生化科技有限公司；植物总RNA通用提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；pMD18-T载体、反转录试剂盒3′RACE均购自Fermentas公司；5′RACE购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 野生蕉总RNA提取及cDNA的合成 利用通用植物总RNA提取试剂盒提取野生蕉试管苗幼嫩叶片总RNA，采用Fermentas公司的RevertAidTM First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成单链cDNA，用于保守区、3′RACE 及ORF的扩增；采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends、Version 2.0试剂盒合成5′RACE cDNA，用于5′RACE的扩增，具体操作详见说明书。
1.2.2 野生蕉Mn-SOD基因保守区引物设计及PCR扩增 根据GenBank中已经登录的不同物种Mn-SOD基因高度保守区序列设计特异上游引物Mn-SOD-F和特异下游引物Mn-SOD-R，以保守区cDNA为模板，进行保守区序列的扩增。PCR反应体系为25 μL，其中上下游引物各1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，模板1 μL，用ddH2O补足25 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，退火57 ℃（根据扩增结果的不同进行调整），共35个循环，72 ℃延伸40 s，35个循环后72 ℃继续延伸10 min，于4 ℃下保存备用。
1.2.3 野生蕉Mn-SOD基因3′RACE引物设计及PCR扩增 运用DNAMAN 6.0和primer premier 5.0软件，根据测序所得到的Mn-SOD基因保守区序列，选择与其他物种序列相对特异的区域设计2条顺式上游引物：3′Mn-SOD-1和3′Mn-SOD-2。以3′RACE cDNA为模板，3′Mn-SOD-1为上游引物，AUAP为下游引物，进行第一轮3′端序列扩增；以第一轮PCR产物为模版，3′Mn-SOD-2为上游引物，AUAP为下游引物，进行第二轮3′端PCR扩增。PCR反应体系及反应程序同保守区。
1.2.4 野生蕉Mn-SOD基因5′RACE引物设计及PCR扩增 运用DNAMAN 6.0软件将测序所得到的Mn-SOD基因3′端序列与保守区序列进行拼接，与其他物种Mn-SOD基因序列进行比对，选择与其他物种序列相对特异的区域设计2条反式下游引物：5′Mn-SOD-1和5′Mn-SOD-2，以AUAP为上游引物。采用巢式PCR进行5′端扩增。所用引物名称、引物序列、目的片段大小及退火温度见表1。
1.2.5 野生蕉Mn-SOD ORF验证 用DNAMAN 6.0软件将所获得的野生蕉Mn-SOD基因的保守区、3′RACE及5′RACE序列进行拼接可得到全长cDNA序列。根据拼接得到野生蕉Mn-SOD基因全长，在包括起始密码子ATG和终止密码子TGA处设计1对特异引物：上游引物ORF-F和下游引物ORF-R，以3′-RACE cDNA为模板进行开放阅读框的扩增，验证所克隆的Mn-SOD基因序列的正确性。
1.2.6 产物检测 以1.0%琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物，使用Solarbio公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，将其连接于载体pMD18-T上，采用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养后挑选白斑单菌落进行菌液培养；通过菌落PCR（与以cDNA为模板的PCR反应条件相同）对阳性克隆菌株进行检测，将PCR产物递交给华大公司进行测序。
1.2.7 生物信息学分析 将测序结果在NCBI中进行在线BLAST，检测结果的正确性，利用DNAMAN 6.0软件和ExPASy系统中的ProtParam工具对Mn-SOD基因编码的蛋白质的理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位、磷酸化位点、分子进化等进行预测分析，以进一步了解其结构和功能。
2 结果与分析
2.1 野生蕉叶片总RNA的提取及质量检测
本研究所提取的总RNA近无色，不呈胶状，基本上排除了多酚、多糖、蛋白质等污染。经琼脂糖凝胶电泳检测可知，无DNA污染，总RNA条带边缘整齐，28S和18S的条带比较清晰，说明通用植物总RNA提取试剂盒所提取的RNA质量好，纯度高，可进行后续试验（图略）。 2.2 野生蕉Mn-SOD基因序列片段的获得
以Olig（dT）18 prime进行逆转录，将所获得的cDNA作为模板进行PCR扩增，获得400 bp左右的单一特异性条带（图1-A），测序结果为426 bp，包含上下游引物序列，与预期结果一致。将该序列在GenBank数据库中进行在线BLAST，结果显示其与别的物种的Mn-SOD基因在核苷酸序列上高度同源，初步推断克隆得到的片段为野生蕉Mn-SOD基因的保守区序列。
以3′RACE cDNA为模板，经过2轮PCR扩增，得到500 bp左右的单一条带（图1-B），测序结果为509 bp，包含上下游引物序列，与预期片段大小基本相符，终止密码子为TGA，且具有典型的Poly（A）尾巴和加尾信号“AATAA”。用DNAMAN6.0软件将该序列与保守区序列进行拼接，2序列片段具有相应的重复区，且该片段与已登录NCBI的多种Mn-SOD基因高度同源，可认为该片段是野生蕉Mn-SOD基因的3′末端片段。
以5′RACE cDNA为模板，经过2轮巢式PCR扩增，得到约300 bp的单一条带（图1-C），测序结果为315 bp，包含起始密码子ATG。 2.3 野生蕉Mn-SOD基因全长cDNA及ORF验证
将所获得的野生蕉Mn-SOD基因cDNA全长序列在GenBank上登录，登录号为：JF752346。开放阅读框（ORF）共由543个核苷酸组成，编码181个氨基酸（图2），ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，包括完整的5′端非编码区137 bp、3′端非编码区151 bp及3′端poly（A）尾巴17 bp。
以3′RACE cDNA为模板进行PCR扩增，经测序得到550 bp的cDNA片段（图1-D），与推断的ORF序列完全相同，验证了所克隆的Mn-SOD基因的正确性。
将野生蕉Mn-SOD基因在http：//ncbi.nlm.nih.gov、http：//banana-genome.cirad.fr网站上进行在线BLAST，其与不同物种间Mn-SOD基因的核苷酸序列同源性均比较高，其中该序列与芭蕉属（JQ364939.2）同源性86%、荔枝（HQ661041.1）同源性79%、拟南芥（AY085319.1）同源性74%、番木瓜（L77078.1）同源性75%、蓖麻属（XM_002520810.1）同源性74%，与香蕉基因组测序结果中的小果野蕉（Musa acuminata）核苷酸序列同源性高达96.8%，说明本试验通过RACE克隆的基因是Mn-SOD基因。
2.4 野生蕉Mn-SOD基本理化性质的预测及分析
根据DNAMAN 6.0软件和ExPASy系统中的ProtParam工具，预测Mn-SOD蛋白的分子量为20 108.8 u，等电点pI为7.92，属于碱性蛋白；分子式：C917H1402N248O259S2，总原子数为2 828；带负电的氨基酸有18（Asp+Glu），带正电的氨基酸有19（Arg+Lys）；消光系数：在280 nm时为50 420。在哺乳动物网状红细胞的体外表达半衰期为30 h，在酵母和大肠杆菌中的体内表达的半衰期分别大于20 h和10 h。不稳定系数是25.71，在阈值范围内，说明该蛋白属于稳定蛋白；脂肪系数为88.39。总平均疏水性为-0.374，预测该蛋白是亲水蛋白（水溶蛋白）。此蛋白质由20种氨基酸组成，其中Ala、Leu、Lys、Gly、Val、Asn、Glu含量较为丰富，分别为20（11.1%）、18（10.0%）、16（8.9%）、15（8.3%）、13（7.2%）、12（6.7%）、10（5.6%），Met含量最少，只有2个（1.1%）。疏水性分析为跨膜结构提供相互验证的依据。从整体上看，亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，整条多肽链表现为亲水性。运用PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）软件进行亚细胞定位预测与分析可知，Mn-SOD定位在线粒体。推断野生蕉Mn-SOD基因编码的蛋白是一种线粒体蛋白。
通过在线BLAST比较野生蕉（Musa spp.， ABGroup）Mn-SOD和其他物种Mn-SOD的氨基酸序列可知，克隆得到的该序列含有2个保守结构域，包括SOD-Fe-N 和 SOD-Fe-C功能结构域，说明该Mn-SOD基因属于Fe/Mn-SOD超级家族成员。
运用Tmpered（www.ch.embnet.org/software/tepred-form.html）及PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）在线软件进行跨膜结构预测可知，仅在多肽链131～149（19）处有一个内而外螺旋（Inside to outside helices），但分值太低，仅为265分，没有超过500分，经推测可知，野生蕉Mn-SOD没有跨膜结构域，属于非跨膜蛋白。信号肽是指用于指导蛋白质跨膜转移的位于分泌蛋白N-末端的氨基酸序列，一般由15～30个氨基酸组成，包括一个带正电的N末端、以中性氨基酸为主的一个中间疏水序列和一个较长的带负电荷的C末端。信号肽的作用是指导新合成的多肽链进行跨膜转移，信号肽的预测和分析有助于理解蛋白质亚细胞定位及功能域的划分。经SignaIP 3.0 Server在线分析可知，Mn-SOD属于非分泌蛋白，不具信号肽（图3），这和跨膜结构域预测的结果一致。用NetPhos 2.0 Serve软件在线对野生蕉Mn-SOD基因编码的氨基酸进行磷酸化位点预测（图4），推测野生蕉Mn-SOD磷酸化位点为5个，在1个Ser（在肽链第72位）、1个Thr（117位）、3个Tyr（12、151、175位）氨基酸位点处发生磷酸化修饰。在肽链第175位的C末端有Tyr磷酸化位点，分值最高，达0.735，推测Tyr 磷酸化位点可能会影响野生蕉Mn-SOD的构象、核定位调节等功能。
应用InterProScan程序搜索位于EBI的InterPro数据库（图5）可知，Mn-SOD基因对应的181个氨基酸残基编码的蛋白质属于Fe/Mn-SOD超级家族成员。该家族收录了大量的蛋白质成员，其中细菌域（bacteria）最多，由4 241个蛋白质成员组成；集胞藻属、果蝇和病毒最少，分别只有3个成员。通过JPred（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/）预测Mn-SOD蛋白的二级结构，其二级结构包括51.11%的α螺旋、8.89%的延伸链和40.00%的不规则卷曲（图6）。
螺旋主要位于C端。纵观该蛋白的整体结构，α螺旋和不规则卷曲是野生蕉叶片Mn-SOD蛋白最大的结构元件，贯穿于整个蛋白质结构中，而延伸链较少，分散其中。利用SWISS-MODEL在线工具对Mn-SOD进行蛋白质三维结构预测，Mn-SOD蛋白有4个β折叠，5个α螺旋。
将所获得的野生蕉Mn-SOD基因编码的氨基酸序列与番木瓜（Carica papaya，GenBank登录号：AAB02052.1）、荔枝（Litchi chinensis，GenBank登录号：AEK05514.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，GenBank登录号：AAM62550.1）、蓖麻（Ricinus communis，GenBank登录号：XP_002520856.1）、天宝蕉（Musa acuminata AAA Group，GenBank登录号：AEZ56248.2）、基因组测序中的小果野蕉（Musa acuminata1，2，3）等几个物种的Mn-SOD基因编码的氨基酸序列进行比对，用MEGA4.1软件中的NJ法构建系统进化树（图7）。从图中可以看出，9种植物可分为3个大组：5种芭蕉属植物处于同一分支中，具有很高的同源性，聚为一类的概率为90%；蓖麻单独为一组；番木瓜、荔枝、拟南芥为一组，聚为一类的概率为76%；克隆所得到的旗山野生蕉（Musa spp.， AB Group）Mn-SOD与基因组测序中的小果野芭蕉（Musa acuminate 1）同源性最高，两者聚为一类的概率为100%；天宝蕉（Musa acuminata AAA Group）与基因组测序中的小果野芭蕉（Musa acuminate 2）聚为一类的概率为85%。上述结果说明了Mn-SOD在进化过程中的高度保守性及不同物种间该基因的特异性。 3 讨论与结论
3.1 Mn-SOD基因功能多样性
多项研究结果表明，Mn-SOD基因与植物的抗逆性有关，是一种重要的抗氧化剂，具有多种生物学功能。外源Mn-SOD基因的转入可以提高植物清除活性氧的能力，明显增强植物的抗性。McKersie等[15-16]将烟草Mn-SOD基因导入苜蓿线粒体中，提高了苜蓿的产量和植株的抗冷性；应用基因枪法将小麦锰超氧化物歧化酶基因（Mn-SOD）导入玉米胚性愈伤组织，获得的转基因植株中SOD的活性高于非转基因植株，明显提高了转基因玉米的抗氧化损伤能力[17]；将豌豆锰超氧化物歧化酶导入水稻叶绿体中可以增强转基因水稻植株的耐旱性[18]；邓婷婷等[19]将极端耐盐的盐生杜氏藻的锰超氧化物歧化酶（DsMnSOD）基因转染SOD缺陷型大肠杆菌并诱导其表达后发现，该大肠杆菌在耐盐、耐辐射和抗寒方面的耐受性均明显提高。上述结果进一步证明了利用转基因技术将Mn-SOD基因转入植物基因组，能明显提高植物的抗逆性。
本课题组多年来对野生蕉的调查研究表明，福州野生蕉（Musa spp.，AA Group）和三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）均具有一定程度的抗寒性，三明野生蕉的抗寒性略高于福州野生蕉。张妙霞[20]已对三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）抗寒相关基因进行了克隆与表达分析，在功能上进一步验证了野生蕉可能具有的抗寒性。植物的抗寒性为数量性状，受微效多基因控制，应该结合多个相关基因进行系统的研究[21-22]。Mn-SOD作为一种抗寒功能蛋白基因，其抗寒性已在多种植物上得到证实，但在野生蕉中尚未见报道，因此从旗山野生蕉中克隆得到Mn-SOD基因并将其转入栽培蕉基因组，所获得的转基因植株很可能会提高栽培蕉的抗寒性，为利用转基因技术培育香蕉抗寒新品种奠定基础。
3.2 Mn-SOD蛋白质功能预测与抗寒性
蛋白理化性质预测结果显示该蛋白是亲水蛋白。亲水蛋白较高的亲水性可避免膜构像发生变化，对维持蛋白质的二级结构具有重要作用，可能在抗冻过程中也起重要作用[20]；蛋白质需要定位在一个或多个亚细胞位置来发挥其职能作用，亚细胞定位显示该基因定位在线粒体，一些亚细胞结构如线粒体、叶绿体等是细胞内活性氧的主要来源[23]。野生蕉具备较强的抗寒性，可能是由于植株在受到低温胁迫时，线粒体内高活性的Mn-SOD有效清除了细胞内过多的活性氧和自由基，在调节膜透性、增加膜结构和功能稳定性方面发挥了重要作用，这可能是野生蕉具有一定抗寒性的机理之一。二级结构中α螺旋的比例最大，α螺旋的主要功能是作为蛋白质骨架起稳定作用，而无规则卷曲区则决定蛋白质的功能。有研究认为α螺旋一方面可以和冰晶结合，阻止其他水分子与冰晶结合，从而抑制冰晶生长，另一方面可与其它蛋白质或膜结合，稳定膜功能，防止膜受低温损伤[24]。关于Mn-SOD在野生蕉生长过程中的功能及其调控机制尚需进一步深入研究。
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Abstract The young leaves of in vitro plantlets of a wild banan（Musa spp.，AB group）grown in Qishan Mountain of Fuzhou were used as the materials to clone Mn-SOD gene by RT-PCR and RACE technology. The full-length cDNA sequence was 831 bp，containing 137 bp 5′UTR，543 bp open reading frame，encoding 181 amino acids，151 bp 3′UTR，and 3′-end involved 17 poly（A）tails. The prediction of protein’s physical and chemical properties showed it belonged to a basic protein with 20 108.8 u and pI7.92.
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正常生命活动中，生物体内活性氧的产生与清除处于动态平衡状态，这种动态平衡是在超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等多种酶的协同作用下完成的[1]，而超氧化物歧化酶（SOD）则是生物体清除逆境反应所产生的活性氧（ROS）的关键酶，广泛存在于植物、动物、微生物中[2]，在清除活性氧和自由基、保护细胞免受氧化损伤、增加膜结构和功能稳定性、增强植物抗逆性等方面发挥重要作用[3]。根据所含金属辅基的不同主要分为3类：Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD，Cu/Zn-SOD主要存在于细胞质中，Mn-SOD主要存在于线粒体中，Fe-SOD主要存在于叶绿体中。
抗氧化酶基因是目前已经发现的与植物抗寒性有关的起膜保护作用的抗寒功能蛋白基因。在膜保护酶与抗寒性的研究中，以SOD的研究最多[4]。将外源SOD基因转到其他植物体内，可以提高逆境条件下植物体内SOD活性，降低胁迫条件下ROS对植物造成的损害，增强植物对各种逆境胁迫的适应性[5]。Bowler等[6]早在1989年就开始研究SOD在耐冻中的作用，该研究把烟草的Mn-SOD cDNA导入苜蓿中，发现转基因植株的SOD活性增强，认为是Mn-SOD抑制了超氧自由基的产生，从而提高抗寒能力。对桉树的抗寒性研究也发现，桉树SOD的活性与其耐寒性有关联，是桉树抗寒生理机制中的一个关键酶[7]。同时，SOD在植物抗病虫、抗旱、耐盐碱、抗涝、抗除草剂等方面也发挥着重要作用[8-9]。
香蕉属芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa）植物。起源于热带亚热带地区，生物学特性决定了其极易受寒害的侵袭，严重影响香蕉的品质和次年产量。多项研究发现施用外源物质在一定程度上可增加细胞保护酶的活性，提高香蕉抗寒能力[10]，但无法从根本上解决香蕉的寒害问题，也不适用于实际生产。截至目前还没有真正有效的方法从根本上解决寒害对香蕉造成的损失。栽培香蕉多数是三倍体、具有高度不育性，在生产上主要靠无性繁殖，很难采用传统的育种方法实现品种改良。因此，要从根本上解决香蕉的寒害问题，最有效的方法就是通过基因工程手段对栽培蕉进行品种改良，提高其抗寒性。吕庆芳等[11]研究发现粉蕉、大蕉（Musa spp.，ABB Group）能抵御0～4 ℃的低温，而野生蕉的抗寒性则更强，且种类不同抗寒性也存在差异，如福州野生蕉[12]（Musa spp.，AA Group）能耐-2 ℃以下的低温，而三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）能耐-5 ℃以下的低温[13]。香蕉（Musa spp.，AAA）则根本无法抵御0 ℃以下的低温。这说明香蕉的抗寒能力在本质上由自身的遗传物质所决定。
Baum等[14]首次从玉米中克隆得到植物SOD基因。随后，植物SOD基因的克隆在国内外迅速开展。目前已从水稻、拟南芥、烟草、柑橘、龙眼、小麦等多种植物中克隆得到Mn-SOD基因，部分已通过遗传转化验证了其功能。但该基因在香蕉中的克隆和研究较少，仅发现了香蕉（AAA）中的部分序列及全序列，在GenBank中的登录号分别为： AF510071.1和AEZ56248.2。目前关于福州旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）的Mn-SOD基因尚未见报道。近年来香蕉基因组测序工作的完成及生物技术的发展为香蕉遗传改良提供了一定的理论依据。本研究首次从福州旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）中克隆得到Mn-SOD基因的cDNA序列，并对其编码的氨基酸序列进行预测和分析，为利用基因工程进行香蕉的抗性育种奠定基础。 1 材料与方法
1.1 材料及主要试剂
供试材料为旗山野生蕉（Musa spp.，AB Group）离体保存试管苗幼嫩叶片；菌种DH5α感受态细胞及PCR反应液均购自北京天根生化科技有限公司；植物总RNA通用提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；pMD18-T载体、反转录试剂盒3′RACE均购自Fermentas公司；5′RACE购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 野生蕉总RNA提取及cDNA的合成 利用通用植物总RNA提取试剂盒提取野生蕉试管苗幼嫩叶片总RNA，采用Fermentas公司的RevertAidTM First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成单链cDNA，用于保守区、3′RACE 及ORF的扩增；采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends、Version 2.0试剂盒合成5′RACE cDNA，用于5′RACE的扩增，具体操作详见说明书。
1.2.2 野生蕉Mn-SOD基因保守区引物设计及PCR扩增 根据GenBank中已经登录的不同物种Mn-SOD基因高度保守区序列设计特异上游引物Mn-SOD-F和特异下游引物Mn-SOD-R，以保守区cDNA为模板，进行保守区序列的扩增。PCR反应体系为25 μL，其中上下游引物各1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，模板1 μL，用ddH2O补足25 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，退火57 ℃（根据扩增结果的不同进行调整），共35个循环，72 ℃延伸40 s，35个循环后72 ℃继续延伸10 min，于4 ℃下保存备用。
1.2.3 野生蕉Mn-SOD基因3′RACE引物设计及PCR扩增 运用DNAMAN 6.0和primer premier 5.0软件，根据测序所得到的Mn-SOD基因保守区序列，选择与其他物种序列相对特异的区域设计2条顺式上游引物：3′Mn-SOD-1和3′Mn-SOD-2。以3′RACE cDNA为模板，3′Mn-SOD-1为上游引物，AUAP为下游引物，进行第一轮3′端序列扩增；以第一轮PCR产物为模版，3′Mn-SOD-2为上游引物，AUAP为下游引物，进行第二轮3′端PCR扩增。PCR反应体系及反应程序同保守区。
1.2.4 野生蕉Mn-SOD基因5′RACE引物设计及PCR扩增 运用DNAMAN 6.0软件将测序所得到的Mn-SOD基因3′端序列与保守区序列进行拼接，与其他物种Mn-SOD基因序列进行比对，选择与其他物种序列相对特异的区域设计2条反式下游引物：5′Mn-SOD-1和5′Mn-SOD-2，以AUAP为上游引物。采用巢式PCR进行5′端扩增。所用引物名称、引物序列、目的片段大小及退火温度见表1。
1.2.5 野生蕉Mn-SOD ORF验证 用DNAMAN 6.0软件将所获得的野生蕉Mn-SOD基因的保守区、3′RACE及5′RACE序列进行拼接可得到全长cDNA序列。根据拼接得到野生蕉Mn-SOD基因全长，在包括起始密码子ATG和终止密码子TGA处设计1对特异引物：上游引物ORF-F和下游引物ORF-R，以3′-RACE cDNA为模板进行开放阅读框的扩增，验证所克隆的Mn-SOD基因序列的正确性。
1.2.6 产物检测 以1.0%琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物，使用Solarbio公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，将其连接于载体pMD18-T上，采用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养后挑选白斑单菌落进行菌液培养；通过菌落PCR（与以cDNA为模板的PCR反应条件相同）对阳性克隆菌株进行检测，将PCR产物递交给华大公司进行测序。
1.2.7 生物信息学分析 将测序结果在NCBI中进行在线BLAST，检测结果的正确性，利用DNAMAN 6.0软件和ExPASy系统中的ProtParam工具对Mn-SOD基因编码的蛋白质的理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位、磷酸化位点、分子进化等进行预测分析，以进一步了解其结构和功能。
2 结果与分析
2.1 野生蕉叶片总RNA的提取及质量检测
本研究所提取的总RNA近无色，不呈胶状，基本上排除了多酚、多糖、蛋白质等污染。经琼脂糖凝胶电泳检测可知，无DNA污染，总RNA条带边缘整齐，28S和18S的条带比较清晰，说明通用植物总RNA提取试剂盒所提取的RNA质量好，纯度高，可进行后续试验（图略）。 2.2 野生蕉Mn-SOD基因序列片段的获得
以Olig（dT）18 prime进行逆转录，将所获得的cDNA作为模板进行PCR扩增，获得400 bp左右的单一特异性条带（图1-A），测序结果为426 bp，包含上下游引物序列，与预期结果一致。将该序列在GenBank数据库中进行在线BLAST，结果显示其与别的物种的Mn-SOD基因在核苷酸序列上高度同源，初步推断克隆得到的片段为野生蕉Mn-SOD基因的保守区序列。
以3′RACE cDNA为模板，经过2轮PCR扩增，得到500 bp左右的单一条带（图1-B），测序结果为509 bp，包含上下游引物序列，与预期片段大小基本相符，终止密码子为TGA，且具有典型的Poly（A）尾巴和加尾信号“AATAA”。用DNAMAN6.0软件将该序列与保守区序列进行拼接，2序列片段具有相应的重复区，且该片段与已登录NCBI的多种Mn-SOD基因高度同源，可认为该片段是野生蕉Mn-SOD基因的3′末端片段。
以5′RACE cDNA为模板，经过2轮巢式PCR扩增，得到约300 bp的单一条带（图1-C），测序结果为315 bp，包含起始密码子ATG。 2.3 野生蕉Mn-SOD基因全长cDNA及ORF验证
将所获得的野生蕉Mn-SOD基因cDNA全长序列在GenBank上登录，登录号为：JF752346。开放阅读框（ORF）共由543个核苷酸组成，编码181个氨基酸（图2），ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，包括完整的5′端非编码区137 bp、3′端非编码区151 bp及3′端poly（A）尾巴17 bp。
以3′RACE cDNA为模板进行PCR扩增，经测序得到550 bp的cDNA片段（图1-D），与推断的ORF序列完全相同，验证了所克隆的Mn-SOD基因的正确性。
将野生蕉Mn-SOD基因在http：//ncbi.nlm.nih.gov、http：//banana-genome.cirad.fr网站上进行在线BLAST，其与不同物种间Mn-SOD基因的核苷酸序列同源性均比较高，其中该序列与芭蕉属（JQ364939.2）同源性86%、荔枝（HQ661041.1）同源性79%、拟南芥（AY085319.1）同源性74%、番木瓜（L77078.1）同源性75%、蓖麻属（XM_002520810.1）同源性74%，与香蕉基因组测序结果中的小果野蕉（Musa acuminata）核苷酸序列同源性高达96.8%，说明本试验通过RACE克隆的基因是Mn-SOD基因。
2.4 野生蕉Mn-SOD基本理化性质的预测及分析
根据DNAMAN 6.0软件和ExPASy系统中的ProtParam工具，预测Mn-SOD蛋白的分子量为20 108.8 u，等电点pI为7.92，属于碱性蛋白；分子式：C917H1402N248O259S2，总原子数为2 828；带负电的氨基酸有18（Asp+Glu），带正电的氨基酸有19（Arg+Lys）；消光系数：在280 nm时为50 420。在哺乳动物网状红细胞的体外表达半衰期为30 h，在酵母和大肠杆菌中的体内表达的半衰期分别大于20 h和10 h。不稳定系数是25.71，在阈值范围内，说明该蛋白属于稳定蛋白；脂肪系数为88.39。总平均疏水性为-0.374，预测该蛋白是亲水蛋白（水溶蛋白）。此蛋白质由20种氨基酸组成，其中Ala、Leu、Lys、Gly、Val、Asn、Glu含量较为丰富，分别为20（11.1%）、18（10.0%）、16（8.9%）、15（8.3%）、13（7.2%）、12（6.7%）、10（5.6%），Met含量最少，只有2个（1.1%）。疏水性分析为跨膜结构提供相互验证的依据。从整体上看，亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，整条多肽链表现为亲水性。运用PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）软件进行亚细胞定位预测与分析可知，Mn-SOD定位在线粒体。推断野生蕉Mn-SOD基因编码的蛋白是一种线粒体蛋白。
通过在线BLAST比较野生蕉（Musa spp.， ABGroup）Mn-SOD和其他物种Mn-SOD的氨基酸序列可知，克隆得到的该序列含有2个保守结构域，包括SOD-Fe-N 和 SOD-Fe-C功能结构域，说明该Mn-SOD基因属于Fe/Mn-SOD超级家族成员。
运用Tmpered（www.ch.embnet.org/software/tepred-form.html）及PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）在线软件进行跨膜结构预测可知，仅在多肽链131～149（19）处有一个内而外螺旋（Inside to outside helices），但分值太低，仅为265分，没有超过500分，经推测可知，野生蕉Mn-SOD没有跨膜结构域，属于非跨膜蛋白。信号肽是指用于指导蛋白质跨膜转移的位于分泌蛋白N-末端的氨基酸序列，一般由15～30个氨基酸组成，包括一个带正电的N末端、以中性氨基酸为主的一个中间疏水序列和一个较长的带负电荷的C末端。信号肽的作用是指导新合成的多肽链进行跨膜转移，信号肽的预测和分析有助于理解蛋白质亚细胞定位及功能域的划分。经SignaIP 3.0 Server在线分析可知，Mn-SOD属于非分泌蛋白，不具信号肽（图3），这和跨膜结构域预测的结果一致。用NetPhos 2.0 Serve软件在线对野生蕉Mn-SOD基因编码的氨基酸进行磷酸化位点预测（图4），推测野生蕉Mn-SOD磷酸化位点为5个，在1个Ser（在肽链第72位）、1个Thr（117位）、3个Tyr（12、151、175位）氨基酸位点处发生磷酸化修饰。在肽链第175位的C末端有Tyr磷酸化位点，分值最高，达0.735，推测Tyr 磷酸化位点可能会影响野生蕉Mn-SOD的构象、核定位调节等功能。
应用InterProScan程序搜索位于EBI的InterPro数据库（图5）可知，Mn-SOD基因对应的181个氨基酸残基编码的蛋白质属于Fe/Mn-SOD超级家族成员。该家族收录了大量的蛋白质成员，其中细菌域（bacteria）最多，由4 241个蛋白质成员组成；集胞藻属、果蝇和病毒最少，分别只有3个成员。通过JPred（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/）预测Mn-SOD蛋白的二级结构，其二级结构包括51.11%的α螺旋、8.89%的延伸链和40.00%的不规则卷曲（图6）。
螺旋主要位于C端。纵观该蛋白的整体结构，α螺旋和不规则卷曲是野生蕉叶片Mn-SOD蛋白最大的结构元件，贯穿于整个蛋白质结构中，而延伸链较少，分散其中。利用SWISS-MODEL在线工具对Mn-SOD进行蛋白质三维结构预测，Mn-SOD蛋白有4个β折叠，5个α螺旋。
将所获得的野生蕉Mn-SOD基因编码的氨基酸序列与番木瓜（Carica papaya，GenBank登录号：AAB02052.1）、荔枝（Litchi chinensis，GenBank登录号：AEK05514.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，GenBank登录号：AAM62550.1）、蓖麻（Ricinus communis，GenBank登录号：XP_002520856.1）、天宝蕉（Musa acuminata AAA Group，GenBank登录号：AEZ56248.2）、基因组测序中的小果野蕉（Musa acuminata1，2，3）等几个物种的Mn-SOD基因编码的氨基酸序列进行比对，用MEGA4.1软件中的NJ法构建系统进化树（图7）。从图中可以看出，9种植物可分为3个大组：5种芭蕉属植物处于同一分支中，具有很高的同源性，聚为一类的概率为90%；蓖麻单独为一组；番木瓜、荔枝、拟南芥为一组，聚为一类的概率为76%；克隆所得到的旗山野生蕉（Musa spp.， AB Group）Mn-SOD与基因组测序中的小果野芭蕉（Musa acuminate 1）同源性最高，两者聚为一类的概率为100%；天宝蕉（Musa acuminata AAA Group）与基因组测序中的小果野芭蕉（Musa acuminate 2）聚为一类的概率为85%。上述结果说明了Mn-SOD在进化过程中的高度保守性及不同物种间该基因的特异性。 3 讨论与结论
3.1 Mn-SOD基因功能多样性
多项研究结果表明，Mn-SOD基因与植物的抗逆性有关，是一种重要的抗氧化剂，具有多种生物学功能。外源Mn-SOD基因的转入可以提高植物清除活性氧的能力，明显增强植物的抗性。McKersie等[15-16]将烟草Mn-SOD基因导入苜蓿线粒体中，提高了苜蓿的产量和植株的抗冷性；应用基因枪法将小麦锰超氧化物歧化酶基因（Mn-SOD）导入玉米胚性愈伤组织，获得的转基因植株中SOD的活性高于非转基因植株，明显提高了转基因玉米的抗氧化损伤能力[17]；将豌豆锰超氧化物歧化酶导入水稻叶绿体中可以增强转基因水稻植株的耐旱性[18]；邓婷婷等[19]将极端耐盐的盐生杜氏藻的锰超氧化物歧化酶（DsMnSOD）基因转染SOD缺陷型大肠杆菌并诱导其表达后发现，该大肠杆菌在耐盐、耐辐射和抗寒方面的耐受性均明显提高。上述结果进一步证明了利用转基因技术将Mn-SOD基因转入植物基因组，能明显提高植物的抗逆性。
本课题组多年来对野生蕉的调查研究表明，福州野生蕉（Musa spp.，AA Group）和三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）均具有一定程度的抗寒性，三明野生蕉的抗寒性略高于福州野生蕉。张妙霞[20]已对三明野生蕉（Musa spp.，AB Group）抗寒相关基因进行了克隆与表达分析，在功能上进一步验证了野生蕉可能具有的抗寒性。植物的抗寒性为数量性状，受微效多基因控制，应该结合多个相关基因进行系统的研究[21-22]。Mn-SOD作为一种抗寒功能蛋白基因，其抗寒性已在多种植物上得到证实，但在野生蕉中尚未见报道，因此从旗山野生蕉中克隆得到Mn-SOD基因并将其转入栽培蕉基因组，所获得的转基因植株很可能会提高栽培蕉的抗寒性，为利用转基因技术培育香蕉抗寒新品种奠定基础。
3.2 Mn-SOD蛋白质功能预测与抗寒性
蛋白理化性质预测结果显示该蛋白是亲水蛋白。亲水蛋白较高的亲水性可避免膜构像发生变化，对维持蛋白质的二级结构具有重要作用，可能在抗冻过程中也起重要作用[20]；蛋白质需要定位在一个或多个亚细胞位置来发挥其职能作用，亚细胞定位显示该基因定位在线粒体，一些亚细胞结构如线粒体、叶绿体等是细胞内活性氧的主要来源[23]。野生蕉具备较强的抗寒性，可能是由于植株在受到低温胁迫时，线粒体内高活性的Mn-SOD有效清除了细胞内过多的活性氧和自由基，在调节膜透性、增加膜结构和功能稳定性方面发挥了重要作用，这可能是野生蕉具有一定抗寒性的机理之一。二级结构中α螺旋的比例最大，α螺旋的主要功能是作为蛋白质骨架起稳定作用，而无规则卷曲区则决定蛋白质的功能。有研究认为α螺旋一方面可以和冰晶结合，阻止其他水分子与冰晶结合，从而抑制冰晶生长，另一方面可与其它蛋白质或膜结合，稳定膜功能，防止膜受低温损伤[24]。关于Mn-SOD在野生蕉生长过程中的功能及其调控机制尚需进一步深入研究。
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