【摘 要】
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目的 构建逆转录病毒载体pLEGFP-N1-端粒酶逆转录酶(TERT),并观察其在新生鼠真皮细胞中的表达.方法 将聚合酶链反应(PCR)扩增出TERT全部片段,定向连接到被HindⅢ和SalI双酶切的质粒,经酶切测序鉴定后筛选阳性克隆.将pLEGFP-N1-TERT质粒和PIK packaging质粒以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293FT,包装产生逆转录病毒.进行病毒滴度测定后,取病毒上清感染新生
【机 构】
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510515广州,南方医科大学南方医院整形外科,510515广州,南方医科大学南方医院整形外科
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目的 构建逆转录病毒载体pLEGFP-N1-端粒酶逆转录酶(TERT),并观察其在新生鼠真皮细胞中的表达.方法 将聚合酶链反应(PCR)扩增出TERT全部片段,定向连接到被HindⅢ和SalI双酶切的质粒,经酶切测序鉴定后筛选阳性克隆.将pLEGFP-N1-TERT质粒和PIK packaging质粒以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293FT,包装产生逆转录病毒.进行病毒滴度测定后,取病毒上清感染新生鼠真皮细胞,筛选转基因细胞.比较转染前后TERT在mRNA水平的表达,端粒酶活性的变化,荧光显微镜观察细胞荧光表达.结果 BamH Ⅰ酶切鉴定及测序鉴定,证明pLEGFP-N1TERT构建成功.转染后细胞稳定表达绿色荧光蛋白,并经Western blots及免疫组织化学检测TERT高表达.结论 构建的逆转录病毒表达载体pLEGFP-N1-TERT能够产生高滴度的逆转录病毒,促使外源性TERT基因转入新生鼠真皮细胞后得到高表达,为皮肤组织工程及细胞移植疗法奠定基础。
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