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摘要 利用高效液相色谱串联质谱仪，建立快速准确测定苹果中赤霉素（GA3）残留量的方法：用乙腈作为提取试剂，振荡提取样品中的赤霉素，经QuEChERS试剂包净化，用高效反相液相色谱柱分离，串联质谱检测定量。结果表明：该方法线性范围为0.008～0.200 mg/kg，回收率大于80%。
关键词 赤霉素；QuEChERS；高效液相色谱-串联质谱
中图分类号 S611 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0265-02
生长调节剂是一类能对植物生长起调节作用的活性物质，其中赤霉素（GA3）是较常见的一种。赤霉素（GA3）属于植物内源激素，在植物体内本来就有，它在植物生长与发育的各个阶段中都发挥着重要的调节作用，是一种广谱性的植物生长调节剂[1]。赤霉素具有促进植物细胞伸长、诱导植物细胞的分裂与分化的作用，对瓜果类具有显著的增产效果[2]，因而在农产品生产中有广泛应用。赤霉素可能干扰人体正常的内分泌系统，长期食用会在人体中蓄积，造成器官的慢性中毒，并可能引起癌变，严重危及消费者的身心健康[1]。国内外都已经对蔬菜水果中的赤霉素残留量做了一定限制。为了提高产量、增加收入，部分生产者滥用赤霉素，会导致农产品中赤霉素残留超标，危害群众身体健康，存在极大的安全隐患。
苹果作为我国最常见的水果之一，其食用安全备受关注。高效液相色谱法[3]和传统的液相色谱串联质谱法检测赤霉素残留量，过程复杂，耗时长。本试验以苹果为样品代表，研究了利用QuEChERS离散型固相萃取包净化，液相色谱-串联质谱仪测定水果中赤霉素残留的方法，过程简单快速，并优化了前处理方法和仪器条件。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验仪器。Agilent 1290-6420 高效液相色谱串联质谱仪；Milli-Q Advantage A10超纯水仪；Sartorius 电子天平；Hitachi CR21N 高速冷冻离心机；Caliper水浴氮吹儀；VWR漩涡混合器。
1.1.2 试验材料。Merck 色谱纯乙腈；Merck色谱纯甲醇；色谱纯甲酸；分析纯氯化钠（广州试剂）；德国Dr.Ehrenstorfer的赤霉素标准品（纯度≥99%）；安捷伦QuEChERS提取包（含离心管，货号5982-5058CH）。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液配制。准确称量赤霉素标准品0.1 000 g，用色谱纯甲醇溶解，用容量瓶定容至100 mL，配制成1 000 μg/mL 的赤霉素标准储备液，置于-20 ℃的冰箱保存。本试验所使用的赤霉素标准溶液均由储备液稀释而成。
1.2.2 样品前处理。取苹果样品经食物调理机打碎至匀浆状，用塑料有盖样品瓶保存。称取苹果样品10.0 g于50 mL的塑料离心管，加入氯化钠3～5 g，再加入乙腈10 mL，盖上离心管盖子，用振荡机振荡30 min，然后在8 000 r/min条件下离心3 min，吸取5 mL上清液到QuEChERS试剂包的离心管（内含PSA 4 g和无水硫酸镁1.2 g）中，盖上盖子，用漩涡混合器混合1 min，8 000 r/min离心2 min，取上清液过0.2 μm滤膜，待测。
1.2.3 色谱条件。色谱柱：Agilent ZORBAX ECLIPSE PLUS C18柱（2.1×100 mm，1.8 μm），柱温40 ℃；流动相：A是甲醇，B是0.1%甲酸水（V/V）；流动相变化梯度如表1所示；流速0.3 mL/min； 进样体积2.0 μL。
1.2.4 质谱条件。离子源使用电喷雾离子源（ESI），干燥气温度为350 ℃，流速为11 mL/min，雾化器压力为310.275 kPa，采用负离子采集模式，多反应监测（MRM）方法测定。赤霉素母离子，定性离子定量离子等质谱采集参数具体如表2所示。
2 结果与分析
2.1 提取液的选取
由于赤霉素难溶于水，因此本试验考虑使用甲醇以及乙腈作为提取剂。试验结果表明，使用甲醇作为提取剂时，赤霉素的回收率不理想。而使用乙腈作为提取剂时，回收率均大于80%，优于甲醇提取的结果，因此试验最终选择乙腈作为样品提取试剂。
2.2 流动相选择
试验初期，使用甲醇和纯水作为流动相，结果响应偏低，灵敏度不高，并且重复性差，这可能是由于赤霉素在水溶液中不稳定容易分解有关。把流动相中的纯水换成0.1%甲酸水（V/V），情况有所好转，响应增高了，也更稳定了，这是因为赤霉素在酸性条件下稳定，并且流动相中的酸能促进增强负离子模式下的赤霉素分子离子化的结果。
2.3 色谱条件优化
本试验尝试使用Agilent ZORBAX ECLIPSE PLUS C18柱和Agilent ZORBAX SB-C18柱对样品进行分离，结果显示，在相同的流动相条件下，2种柱子的赤霉素都能得到分离，而使用Agilent ZORBAX PLUS C18分离得到的赤霉素谱图中，保留时间稍长，峰高也更高（图1）。因此试验选择Agilent ZORBAX ECLIPSE PLUS C18柱作为试验色谱柱。
2.4 质谱参数的优化
在电喷雾离子源负离子模式下，用0.2 μg/mL赤霉素标准液直接进样，对母离子进行全扫分析，得到最高的离子峰为345.2 m/z，确定为母离子（图2）。
2.5 方法检出限和线性范围
以0.008、0.020、0.040、0.100、0.200 μg/mL赤霉素标准溶液绘制曲线，回归线性方程为Y=53 527.5X 23.9，R2=0.999，曲线在0.008～0.200 μg/mL范围内线性良好，对应的样品检测定量范围是0.008～0.20 0mg/kg。用3倍噪音值计算可得方法最低检出达到0.004 μg/mL。
2.6 方法的回收率和精密度
以同一空白样品作为基质，分别以0.02、0.10、0.20 mg/kg的浓度进行6个平行样的添加回收试验，结果如表3所示，3个浓度的添加回收率均在80%以上，RSD均小于4%，能满足对样品中赤霉素残留量的检测要求。
3 结论
本试验以QuEChERS净化包为基础，建立了一种苹果中赤霉素残留量的快速准确的高效液相色谱-串联质谱检测方法。方法以乙腈作为提取液，QuEChERS净化包作为样品净化手段，甲醇和0.1%甲酸水作为流动相，高效液相色谱-串联质谱仪检测，具有操作简单，耗时较短的优点，适合样品中赤霉素残留量的快速定量检测[4]。
4 参考文献
[1] 刘艳琴，王浩，杨红梅，等. 高效液相色谱-串联四极杆质谱联用测定水果和蔬菜中赤霉素残量[J].现代农业科技，2009（16）：330-331.
[2] 张国华，张艳洁，丛日晨，等，古润泽赤霉素作用机制研究进展[J].西北植物学报， 2009， 29（2）：412-419.
[3] 陈小鹏，王秀峰，孙小镭，等.高效液相色谱测定黄瓜瓜条中赤霉素和脱落酸含量[J].山东农业科学，2005（1）：74-76.
[4] 盖喜乐，崔新仪.应用QuEchERS方法测定苹果中有机磷[J].天津农业科学，2015（8）：105-108.
关键词 赤霉素；QuEChERS；高效液相色谱-串联质谱
中图分类号 S611 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0265-02
生长调节剂是一类能对植物生长起调节作用的活性物质，其中赤霉素（GA3）是较常见的一种。赤霉素（GA3）属于植物内源激素，在植物体内本来就有，它在植物生长与发育的各个阶段中都发挥着重要的调节作用，是一种广谱性的植物生长调节剂[1]。赤霉素具有促进植物细胞伸长、诱导植物细胞的分裂与分化的作用，对瓜果类具有显著的增产效果[2]，因而在农产品生产中有广泛应用。赤霉素可能干扰人体正常的内分泌系统，长期食用会在人体中蓄积，造成器官的慢性中毒，并可能引起癌变，严重危及消费者的身心健康[1]。国内外都已经对蔬菜水果中的赤霉素残留量做了一定限制。为了提高产量、增加收入，部分生产者滥用赤霉素，会导致农产品中赤霉素残留超标，危害群众身体健康，存在极大的安全隐患。
苹果作为我国最常见的水果之一，其食用安全备受关注。高效液相色谱法[3]和传统的液相色谱串联质谱法检测赤霉素残留量，过程复杂，耗时长。本试验以苹果为样品代表，研究了利用QuEChERS离散型固相萃取包净化，液相色谱-串联质谱仪测定水果中赤霉素残留的方法，过程简单快速，并优化了前处理方法和仪器条件。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验仪器。Agilent 1290-6420 高效液相色谱串联质谱仪；Milli-Q Advantage A10超纯水仪；Sartorius 电子天平；Hitachi CR21N 高速冷冻离心机；Caliper水浴氮吹儀；VWR漩涡混合器。
1.1.2 试验材料。Merck 色谱纯乙腈；Merck色谱纯甲醇；色谱纯甲酸；分析纯氯化钠（广州试剂）；德国Dr.Ehrenstorfer的赤霉素标准品（纯度≥99%）；安捷伦QuEChERS提取包（含离心管，货号5982-5058CH）。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液配制。准确称量赤霉素标准品0.1 000 g，用色谱纯甲醇溶解，用容量瓶定容至100 mL，配制成1 000 μg/mL 的赤霉素标准储备液，置于-20 ℃的冰箱保存。本试验所使用的赤霉素标准溶液均由储备液稀释而成。
1.2.2 样品前处理。取苹果样品经食物调理机打碎至匀浆状，用塑料有盖样品瓶保存。称取苹果样品10.0 g于50 mL的塑料离心管，加入氯化钠3～5 g，再加入乙腈10 mL，盖上离心管盖子，用振荡机振荡30 min，然后在8 000 r/min条件下离心3 min，吸取5 mL上清液到QuEChERS试剂包的离心管（内含PSA 4 g和无水硫酸镁1.2 g）中，盖上盖子，用漩涡混合器混合1 min，8 000 r/min离心2 min，取上清液过0.2 μm滤膜，待测。
1.2.3 色谱条件。色谱柱：Agilent ZORBAX ECLIPSE PLUS C18柱（2.1×100 mm，1.8 μm），柱温40 ℃；流动相：A是甲醇，B是0.1%甲酸水（V/V）；流动相变化梯度如表1所示；流速0.3 mL/min； 进样体积2.0 μL。
1.2.4 质谱条件。离子源使用电喷雾离子源（ESI），干燥气温度为350 ℃，流速为11 mL/min，雾化器压力为310.275 kPa，采用负离子采集模式，多反应监测（MRM）方法测定。赤霉素母离子，定性离子定量离子等质谱采集参数具体如表2所示。
2 结果与分析
2.1 提取液的选取
由于赤霉素难溶于水，因此本试验考虑使用甲醇以及乙腈作为提取剂。试验结果表明，使用甲醇作为提取剂时，赤霉素的回收率不理想。而使用乙腈作为提取剂时，回收率均大于80%，优于甲醇提取的结果，因此试验最终选择乙腈作为样品提取试剂。
2.2 流动相选择
试验初期，使用甲醇和纯水作为流动相，结果响应偏低，灵敏度不高，并且重复性差，这可能是由于赤霉素在水溶液中不稳定容易分解有关。把流动相中的纯水换成0.1%甲酸水（V/V），情况有所好转，响应增高了，也更稳定了，这是因为赤霉素在酸性条件下稳定，并且流动相中的酸能促进增强负离子模式下的赤霉素分子离子化的结果。
2.3 色谱条件优化
本试验尝试使用Agilent ZORBAX ECLIPSE PLUS C18柱和Agilent ZORBAX SB-C18柱对样品进行分离，结果显示，在相同的流动相条件下，2种柱子的赤霉素都能得到分离，而使用Agilent ZORBAX PLUS C18分离得到的赤霉素谱图中，保留时间稍长，峰高也更高（图1）。因此试验选择Agilent ZORBAX ECLIPSE PLUS C18柱作为试验色谱柱。
2.4 质谱参数的优化
在电喷雾离子源负离子模式下，用0.2 μg/mL赤霉素标准液直接进样，对母离子进行全扫分析，得到最高的离子峰为345.2 m/z，确定为母离子（图2）。
2.5 方法检出限和线性范围
以0.008、0.020、0.040、0.100、0.200 μg/mL赤霉素标准溶液绘制曲线，回归线性方程为Y=53 527.5X 23.9，R2=0.999，曲线在0.008～0.200 μg/mL范围内线性良好，对应的样品检测定量范围是0.008～0.20 0mg/kg。用3倍噪音值计算可得方法最低检出达到0.004 μg/mL。
2.6 方法的回收率和精密度
以同一空白样品作为基质，分别以0.02、0.10、0.20 mg/kg的浓度进行6个平行样的添加回收试验，结果如表3所示，3个浓度的添加回收率均在80%以上，RSD均小于4%，能满足对样品中赤霉素残留量的检测要求。
3 结论
本试验以QuEChERS净化包为基础，建立了一种苹果中赤霉素残留量的快速准确的高效液相色谱-串联质谱检测方法。方法以乙腈作为提取液，QuEChERS净化包作为样品净化手段，甲醇和0.1%甲酸水作为流动相，高效液相色谱-串联质谱仪检测，具有操作简单，耗时较短的优点，适合样品中赤霉素残留量的快速定量检测[4]。
4 参考文献
[1] 刘艳琴，王浩，杨红梅，等. 高效液相色谱-串联四极杆质谱联用测定水果和蔬菜中赤霉素残量[J].现代农业科技，2009（16）：330-331.
[2] 张国华，张艳洁，丛日晨，等，古润泽赤霉素作用机制研究进展[J].西北植物学报， 2009， 29（2）：412-419.
[3] 陈小鹏，王秀峰，孙小镭，等.高效液相色谱测定黄瓜瓜条中赤霉素和脱落酸含量[J].山东农业科学，2005（1）：74-76.
[4] 盖喜乐，崔新仪.应用QuEchERS方法测定苹果中有机磷[J].天津农业科学，2015（8）：105-108.