探讨软脂酸对人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因表达的调节及果蝇样受体4(TLR4)信号通路的作用。
方法采用不同剂量的软脂酸(100、200、400 μmol/L)处理HA-VSMC 6、12、24 h，采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞MCP-1 mRNA表达，酶联免疫吸附实验(ELISA)检测MCP-1蛋白表达，观察软脂酸调节MCP-1表达的剂量依赖关系和时间效应；采用蛋白激酶C(PKC)抑制剂白屈菜红碱、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂wortmannin、神经酰胺抑制剂myriocin和核因子κB(NF-κB)抑制剂parthenolide分别处理细胞30 min，再加入软脂酸(400 μmol/L)处理细胞6 h后，实时荧光定量PCR检测MCP-1 mRNA的表达水平，ELISA检测MCP-1的蛋白表达水平，研究软脂酸调节MCP-1表达依赖的信号通路；构建TLR4短发夹RNA(shRNA)腺病毒pGSadeno-TLR4并感染HA-VSMC沉默TLR4基因表达，实验同时设空白对照组(PBS缓冲液)和对照病毒(pGSadeno-GFP)组。细胞感染96 h后更换培养基，再加入软脂酸(400 μmol/L)处理细胞6 h，采用实时荧光定量PCR检测MCP-1 mRNA表达水平，ELISA检测MCP-1的蛋白表达水平。提取细胞核蛋白，采用ELISA检测NF-κB p65亚基活性，观察TLR4/NF-κB通路在软脂酸调节HA-VSMC MCP-1基因表达中的作用。组间均数比较采用单因素方差分析。
结果采用软脂酸处理细胞6 h后，对照组及100、200和400 μmol/L软脂酸组MCP-1 mRNA表达分别为1.00±0.02、3.30±2.84、8.21±4.31和11.25±2.73(F＝7.57，P<0.05)；MCP-1蛋白表达分别为(127±10)、(147±10)、(163±18)和(194±14)ng/L(F＝7.81，P<0.05)。软脂酸可促进HA-VSMC MCP-1 mRNA和蛋白表达且具有明显的剂量依赖关系。细胞培养12 h和24 h后，随着软脂酸浓度的增加，MCP-1 mRNA和蛋白表达水平呈逐渐增加趋势，但时间效应则不明显。采用不同的信号通路抑制剂和软脂酸处理细胞6 h后，对照组、软脂酸组、软脂酸＋parthenolide组、软脂酸＋白屈菜红碱组、软脂酸＋wortmannin组和软脂酸＋myriocin组MCP-1 mRNA表达分别为1.00±0.02、10.80±1.23、3.49±0.28、10.84±0.24、11.24±0.27和10.62±0.36(F＝1313.07，P<0.05)；MCP-1蛋白表达分别为(132±8)、(218±12)、(152±4)、(213±12)、(225±7)和(226±9)ng/L(F＝106.83, P<0.05)。成功地构建并获得TLR4 shRNA腺病毒pGSadeno-TLR4，采用pGSadeno-TLR4感染HA-VSMC阻断TLR4信号后，软脂酸＋pGSadeno-TLR4组的NF-κB p65结合活性、MCP-1 mRNA和蛋白表达均显著低于软脂酸组[分别为0.48±0.12比1.24±0.16、1.88±0.33比10.80±1.23、(154±10)比(218±12)ng/L；F＝591.86、659.16、118.37，均P<0.01]。而对照病毒pGSadeno-GFP对软脂酸诱导的NF-κB p65结合活性和MCP-1表达均无明显影响。
结论TLR4/NF-κB信号通路介导了软脂酸诱导的人主动脉血管平滑肌细胞MCP-1基因表达。