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摘要 目的：对栀子（Gardenia jasminoides Ellis）叶片愈伤组织诱导进行优化研究。方法：通过以叶片为外植体，MS和WPM为基本培养基，添加不同激素组合（6-BA、NAA和IBA）进行愈伤组织诱导研究。结果：栀子叶片在WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L以及6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1（或0.5）mg/L中均有100%的诱导率;在MS培养基上，MS+6-BA 1.0（或1.5）mg/L+NAA 0.5 mg/L的诱导率最好，分别为70%和74%。栀子叶片愈伤组织在再分化培养基上均未诱导出丛生芽。结论：WPM培养基比MS培养基更易诱导栀子叶片愈伤组织，且栀子愈伤组织的再分化较困难。
关键词 栀子;叶片;愈伤组织诱导;MS培养基;WPM培养基;6-BA;NAA;IBA
Abstract Objective：To study the optimization of leaf callus induction in Gardenia jasminoides Ellis.Methods：The callus induction was studied using leaves as explant，MS and WPM as basic medium adding different hormone combinations（6-BA，NAA and IBA）.Results：Gardenia leaves had a 100% of callus induction rate in WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L or 6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1（or 0.5）mg/L，while 70% and 74% were the best induction rates in MS+6-BA 1.0（or 1.5）mg/L+NAA 0.5 mg/L，respectively.The leaf callus of Gardenia did not induce cluster buds in the redifferentiation medium.Conclusion：Compared with MS medium，the callus was easy to be induced in WPM medium，and the redifferentiation of Gardenia callus was difficult.
Keywords Gardenia jasminoides Ellis; leaves; Callus induction; MS medium; WPM medium; 6-BA; NAA; IBA
梔子（Gardenia jasminoides Ellis），为茜草科栀子属多年生常绿灌木，生于丘陵山谷或山坡灌丛中，分布于江苏、安徽、浙江、江西、福建和贵州等地[1]。其干燥成熟果实是传统中药，属原卫生部颁布的第一批药食两用资源，性味苦寒，有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒、消肿止痛等功效，主要活性物质有环烯醚萜类（栀子苷）、二萜色素类（西红花苷和西红花酸）、有机酸类（绿原酸和熊果酸）和油脂类等[2]。其中，从栀子成熟果实提取的黄色素着色力强、安全性高、成本较低，且有一定的保健和营养价值，可广泛应用于食品、饮料、医药和化妆品等领域，是国际上允许生产和使用的天然食用黄色素[3-4]。此外，栀子花朵美丽、花香沁人心脾，是园林塑景以及发展休闲和观光农业的优势物种[5]。栀子集药用、食用及观赏价值于一体，应用前景十分广阔。建立栀子组培体系，对栀子优良品种选育及保存具有重要意义。
在麻疯树的组织培养研究中，赵雪惠等[6]以幼胚为外植体，去除胚乳，接种于4种（MS、LM、WPM和N6）未添加任何植物激素的培养基上进行培养，在MS与WPM培养基上能够大量诱导出愈伤组织，并且WPM培养基上分化出不定芽数量最多。以WPM为基本培养基，添加激素组合6-BA与NAA如悬铃木[7]和青钱柳[8]，或添加激素组合6-BA与IBA如大果榉[9]和胡杨[10]，均可诱导愈伤组织、丛生芽，最后得到再生植株。在栀子的组织培养研究中，多以MS为基本培养基，筛选栀子组织培养最适激素配比[11-12]，未见采用WPM培养基的研究。因此，本研究拟以MS及木本植物培养基WPM为基本培养基，添加激素6-BA、NAA和IBA，对栀子叶片愈伤组织诱导、愈伤组织再分化进行研究，进一步完善栀子组织培养体系，为栀子优良品种选育和保存、栀子功能基因组研究奠定基础。
1 材料
栀子取自重庆市药物种植研究所培育的优良品种ZZ1-9的扦插盆栽苗。选取生长状态良好，无黄叶无病态的栀子幼嫩茎尖为材料。
所需植物激素为6-苄氨基嘌呤（6-BA，华绿源科技有限公司，北京），萘乙酸（NAA，华绿源科技有限公司，北京），吲哚丁酸（IBA，华绿源科技有限公司，北京），所需基本培养基为MS（Murashige & Skoog with Vitamins，Caisson labs，美国，批号：0619003）和WPM（McCown Woody Plant medium with vitamins，COOLABER，中国，批号：PM28151421）培养基。
2 方法
2.1 获取无菌外植体 选取栀子幼嫩茎尖2～3 cm为外植体，自来水冲洗干净后在超净工作台中进行后续灭菌操作。先用75%酒精浸泡30 s，无菌水洗3次，再用2%次氯酸钠消毒10～15 min，无菌水洗5～6次。将消过毒的外植体放在无菌滤纸上吸干表面水分，接种到不添加激素的MS培养基上启动培养，后转入无菌苗培养基上继续培养，无菌苗培养基[13]为MS+6-BA 1 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L，pH=5.8。 2.2 叶片愈伤组织诱导 将栀子无菌苗叶片剪掉边缘后剪成0.5 cm×0.5 cm的小块，使用无菌镊子接种于愈伤组织诱导培养基，以MS和WPM为基本培养基，附加不同浓度6-BA和NAA的激素组合（见表1中YA1-10）。培养30 d后记录栀子叶片在不同激素组合以及在MS和WPM 2种培养基上的愈伤组织诱导情况。愈伤组织诱导率=（长出愈伤组织的外植体数/外植体总数）×100%。
2.3 愈伤组织再分化的诱导 将MS培养基上诱导产生的绿色愈伤组织切分成0.5 cm×0.5 cm的小块，分别接种于愈伤组织再分化培养基上，以MS和WPM为基本培养基，附加不同浓度6-BA和IBA的激素组合（见表1中YB1-10）。培养30 d后记录栀子叶片在不同激素组合以及在MS和WPM 2种培养基上的愈伤组织再分化情况。愈伤组织再分化率=（再分化的愈伤组织数/接种愈伤组织总数）×100%。
3 结果
3.1 MS培养基附加不同激素组合对栀子叶片愈伤组织形成的影响 MS培养基上添加激素6-BA和NAA不同配比对栀子叶片愈伤组织的诱导情况如图1所示。MS培养基若不添加任何激素则无愈伤组织产生。添加不同激素配比的培养基均可诱导愈伤组织，但愈伤组织诱导率及愈伤组织状态有较大差异。在愈伤组织诱导率方面，YA10、YA7的愈伤组织诱导率较高，分别为74.7%、70.7%。从愈伤组织生长情况来看，在YA4中多为白色，其余处理中多为绿色致密。在YA2和YA3中的愈伤组织，到后期愈伤组织生长缓慢，在YA4、YA7和YA10中愈伤组织生长较快。综合考虑愈伤组织诱导率及愈伤组织生长情况，栀子叶片适宜的MS愈伤组织诱导培养基为YA7和YA10，即为MS+6-BA 1.0（或1.5）mg/L+IBA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L，pH=5.8。
3.2 WPM培养基附加不同激素组合对栀子叶片愈伤组织形成的影响 WPM培养基添加激素6-BA和NAA不同配比对栀子叶片愈伤组织的诱导情况如图2所示。WPM培养基若不添加任何激素，和MS培养基一样，均无愈伤组织产生。WPM培养基的诱导率远高于MS培养基，YA4、5和7的愈伤组织诱导率均达到100%，且在添加激素的处理中诱导率均超过80%。其中，YA2、5和8整体为绿色、较小愈伤组织;YA4、7和10多是在愈伤组织底部为绿色致密、边缘为白色疏松，且大部分愈伤组织生长较快。
3.3 MS培养基附加不同激素组合对愈伤组织再分化的影响 MS培养基添加激素6-BA和IBA不同配比对栀子叶片愈伤组织再分化情况见图3（A）所示。叶片诱导的愈伤组织在添加激素6-BA和IBA不同配比的MS培养基上均未诱导出丛生芽。
3.4 WPM培养基附加不同激素组合对愈伤组织再分化的影响 WPM培养基添加激素6-BA和IBA不同配比对栀子叶片愈伤组织再分化情况见图3（B）所示。叶片诱导的愈伤组织在添加激素6-BA和IBA不同配比的WPM培养基上均未诱导出丛生芽。
4 讨论
WPM是木本植物组织培养优选培养基，多种木本植物以WPM为基本培养基建立再生体系，如喜树[14]，中国李[15]、茶条槭[16]等。然而，栀子组培体系研究多以MS为基本培养基，还未见以WPM为基本培养基的研究。本研究以栀子叶片为外植体，MS和WPM为基本培养基，添加不同激素组合的6-BA和NAA或IBA，进行叶片愈伤组织诱导及愈伤组织再分化研究，对栀子叶片愈伤组织诱导进行优化。栀子叶片在MS和WPM培养基不添加任何激素的情况下，均无愈伤组织产生，而在添加不同激素配比的培养基上，虽然诱导率以及愈伤组织生长状态有所差异，但均有愈伤组织产生，表明植物激素在愈伤组织的诱导中起着重要作用。栀子叶片在WPM培养基上的诱导率远高于MS培养基，在添加不同激素配比的WPM培养基上均超过80%，而在MS培养基上，愈伤组织的最高平均诱导率为74.7%。但在MS培养基上诱导的愈伤组织多为绿色致密，在WPM培养基上诱导的愈伤组织多为白色疏松。以MS培养基上诱导的绿色愈伤组织为材料，接种于添加6-BA和IBA不同激素组合的MS和WPM的再分化培养基上，均无愈伤组织再分化。
本研究以固体MS及WPM为基本培养基，栀子叶片诱导愈伤组织材料，添加6-BA及IBA并未诱导出丛生芽。而张庆红等[17]研究表明用栀子种子愈伤组织可通过MS液体培养分化出芽，添加的激素TDZ是一种新型的植物生长调节剂，已成功地用于多种植物不定芽的诱导，对于木本植物的不定芽诱导具有突出的效果[18]。因此，可进一步采用MS或WPM培养基上添加TDZ，以液体培养方式对栀子叶片愈伤组织进行不定芽诱导。
栀子所含西红花苷及西红花酸，是色素类物质，不仅可食用，亦是被誉为“红色黄金”的名贵中药材西红花的主要活性物质。西红花入药部位为柱头，一朵西红花仅有3个柱头，柱头产量低，且人工采收成本高，加上西红花主产地在伊朗、希腊等国家，在我国资源短缺，导致西红花价格昂贵[19]。而栀子栽培地广，果实产量高，更适宜用来研究西红花苷等活性物质。所以，优化栀子组培体系，可为建立栀子功能基因研究体系提供理论依据，对栀子所含活性物质作用机制研究、栀子优良品种选育及保存具有重要意义。
参考文献
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，2004.
[2]史永平，孔浩天，李昊楠，等.梔子的化学成分、药理作用研究进展及质量标志物预测分析[J].中草药，2019，637（2）：281-289.
[3]胡军，罗刚华.栀子黄色素的提取与精制工艺研究进展[J].酿酒，2019，250（3）：12-15.
[4]陈建中，葛水莲，乔莉娟，等.高效液相色谱串联质谱法测定肉制品中栀子黄色素[J].食品科技，2016，291（1）：290-294. [5]郑修完.黄栀子花果两用栽培技术[J].现代农业科技，2019，747（13）：79-80.
[6]赵雪慧，何德.麻疯树组织培养研究[J].绿色科技，2015，6（12）：55-58.
[7]范国强，蒋建平，贺窑青，等.悬铃木叶片植株再生系统的建立[J].园艺学报，2003，30（2）：236-238，254.
[8]阮氏钏，方升佐，尚旭岚，等.青钱柳愈伤组织不定芽诱导技术[J].南京林业大学学报：自然科学版，2014，170（2）：52-56.
[9]金晓玲，何平，张日清.大果榉未成熟胚愈伤组织的诱导和植株再生[J].中南林学院学报，2006，26（5）：98-101.
[10]马艳，王静飞，刘婷，等.胡杨杂种叶片组培技术研究[J].中国野生植物资源，2019，187（4）：1-6，12.
[11]杨光军，李铁军.栀子叶片形成愈伤组织的最佳浓度配比探究[J].实验教学与仪器，2016，344（12）：36-37.
[12]高敏霞，韦晓霞.栀子不同外植体愈伤组织诱导效果比较分析[J].东南园艺，2016，4（4）：8-10.
[13]曾妮，唐琳，沈文尉，等.栀子腋芽丛生离体繁殖及开花诱导[J].四川大学学报：自然科学版，2008，185（5）：1269-1272.
[14]董凤丽，祖元刚，王慧梅.96-Ⅱ喜树叶片高频率植株再生体系建立[J].东北林业大学学报，2012，40（12）：56-59.
[15]孙源蔚，李果果，姚延兴，等.中国李Nubiana胚性愈伤组织诱导及植株再生[J].果树学报，2011，28（1）：42-45，190.
[16]李海艳，宋继园，董杰，等.茶条槭愈伤组织的再生体系建立及其没食子酸含量的测定[J].植物学通报，2008，25（2）：212-219.
[17]张庆红，汤丽云，司徒少金，等.药用植物栀子的组织培养[J].植物学报，2014，49（3）：331-336.
[18]王旭炜，付杰，王青，等.TDZ在木本植物再生中的应用趋势及桑树中的前景[J].蚕学通讯，2014，122（1）：22-30.
[19]夏詩琪，彭逸珍，贾全全，等.栀子来源藏红花苷类成分研究进展[J].南方林业科学，2018，252（6）：51-54.
（2020-02-10收稿 责任编辑：芮莉莉）
关键词 栀子;叶片;愈伤组织诱导;MS培养基;WPM培养基;6-BA;NAA;IBA
Abstract Objective：To study the optimization of leaf callus induction in Gardenia jasminoides Ellis.Methods：The callus induction was studied using leaves as explant，MS and WPM as basic medium adding different hormone combinations（6-BA，NAA and IBA）.Results：Gardenia leaves had a 100% of callus induction rate in WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L or 6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1（or 0.5）mg/L，while 70% and 74% were the best induction rates in MS+6-BA 1.0（or 1.5）mg/L+NAA 0.5 mg/L，respectively.The leaf callus of Gardenia did not induce cluster buds in the redifferentiation medium.Conclusion：Compared with MS medium，the callus was easy to be induced in WPM medium，and the redifferentiation of Gardenia callus was difficult.
Keywords Gardenia jasminoides Ellis; leaves; Callus induction; MS medium; WPM medium; 6-BA; NAA; IBA
梔子（Gardenia jasminoides Ellis），为茜草科栀子属多年生常绿灌木，生于丘陵山谷或山坡灌丛中，分布于江苏、安徽、浙江、江西、福建和贵州等地[1]。其干燥成熟果实是传统中药，属原卫生部颁布的第一批药食两用资源，性味苦寒，有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒、消肿止痛等功效，主要活性物质有环烯醚萜类（栀子苷）、二萜色素类（西红花苷和西红花酸）、有机酸类（绿原酸和熊果酸）和油脂类等[2]。其中，从栀子成熟果实提取的黄色素着色力强、安全性高、成本较低，且有一定的保健和营养价值，可广泛应用于食品、饮料、医药和化妆品等领域，是国际上允许生产和使用的天然食用黄色素[3-4]。此外，栀子花朵美丽、花香沁人心脾，是园林塑景以及发展休闲和观光农业的优势物种[5]。栀子集药用、食用及观赏价值于一体，应用前景十分广阔。建立栀子组培体系，对栀子优良品种选育及保存具有重要意义。
在麻疯树的组织培养研究中，赵雪惠等[6]以幼胚为外植体，去除胚乳，接种于4种（MS、LM、WPM和N6）未添加任何植物激素的培养基上进行培养，在MS与WPM培养基上能够大量诱导出愈伤组织，并且WPM培养基上分化出不定芽数量最多。以WPM为基本培养基，添加激素组合6-BA与NAA如悬铃木[7]和青钱柳[8]，或添加激素组合6-BA与IBA如大果榉[9]和胡杨[10]，均可诱导愈伤组织、丛生芽，最后得到再生植株。在栀子的组织培养研究中，多以MS为基本培养基，筛选栀子组织培养最适激素配比[11-12]，未见采用WPM培养基的研究。因此，本研究拟以MS及木本植物培养基WPM为基本培养基，添加激素6-BA、NAA和IBA，对栀子叶片愈伤组织诱导、愈伤组织再分化进行研究，进一步完善栀子组织培养体系，为栀子优良品种选育和保存、栀子功能基因组研究奠定基础。
1 材料
栀子取自重庆市药物种植研究所培育的优良品种ZZ1-9的扦插盆栽苗。选取生长状态良好，无黄叶无病态的栀子幼嫩茎尖为材料。
所需植物激素为6-苄氨基嘌呤（6-BA，华绿源科技有限公司，北京），萘乙酸（NAA，华绿源科技有限公司，北京），吲哚丁酸（IBA，华绿源科技有限公司，北京），所需基本培养基为MS（Murashige & Skoog with Vitamins，Caisson labs，美国，批号：0619003）和WPM（McCown Woody Plant medium with vitamins，COOLABER，中国，批号：PM28151421）培养基。
2 方法
2.1 获取无菌外植体 选取栀子幼嫩茎尖2～3 cm为外植体，自来水冲洗干净后在超净工作台中进行后续灭菌操作。先用75%酒精浸泡30 s，无菌水洗3次，再用2%次氯酸钠消毒10～15 min，无菌水洗5～6次。将消过毒的外植体放在无菌滤纸上吸干表面水分，接种到不添加激素的MS培养基上启动培养，后转入无菌苗培养基上继续培养，无菌苗培养基[13]为MS+6-BA 1 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L，pH=5.8。 2.2 叶片愈伤组织诱导 将栀子无菌苗叶片剪掉边缘后剪成0.5 cm×0.5 cm的小块，使用无菌镊子接种于愈伤组织诱导培养基，以MS和WPM为基本培养基，附加不同浓度6-BA和NAA的激素组合（见表1中YA1-10）。培养30 d后记录栀子叶片在不同激素组合以及在MS和WPM 2种培养基上的愈伤组织诱导情况。愈伤组织诱导率=（长出愈伤组织的外植体数/外植体总数）×100%。
2.3 愈伤组织再分化的诱导 将MS培养基上诱导产生的绿色愈伤组织切分成0.5 cm×0.5 cm的小块，分别接种于愈伤组织再分化培养基上，以MS和WPM为基本培养基，附加不同浓度6-BA和IBA的激素组合（见表1中YB1-10）。培养30 d后记录栀子叶片在不同激素组合以及在MS和WPM 2种培养基上的愈伤组织再分化情况。愈伤组织再分化率=（再分化的愈伤组织数/接种愈伤组织总数）×100%。
3 结果
3.1 MS培养基附加不同激素组合对栀子叶片愈伤组织形成的影响 MS培养基上添加激素6-BA和NAA不同配比对栀子叶片愈伤组织的诱导情况如图1所示。MS培养基若不添加任何激素则无愈伤组织产生。添加不同激素配比的培养基均可诱导愈伤组织，但愈伤组织诱导率及愈伤组织状态有较大差异。在愈伤组织诱导率方面，YA10、YA7的愈伤组织诱导率较高，分别为74.7%、70.7%。从愈伤组织生长情况来看，在YA4中多为白色，其余处理中多为绿色致密。在YA2和YA3中的愈伤组织，到后期愈伤组织生长缓慢，在YA4、YA7和YA10中愈伤组织生长较快。综合考虑愈伤组织诱导率及愈伤组织生长情况，栀子叶片适宜的MS愈伤组织诱导培养基为YA7和YA10，即为MS+6-BA 1.0（或1.5）mg/L+IBA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L，pH=5.8。
3.2 WPM培养基附加不同激素组合对栀子叶片愈伤组织形成的影响 WPM培养基添加激素6-BA和NAA不同配比对栀子叶片愈伤组织的诱导情况如图2所示。WPM培养基若不添加任何激素，和MS培养基一样，均无愈伤组织产生。WPM培养基的诱导率远高于MS培养基，YA4、5和7的愈伤组织诱导率均达到100%，且在添加激素的处理中诱导率均超过80%。其中，YA2、5和8整体为绿色、较小愈伤组织;YA4、7和10多是在愈伤组织底部为绿色致密、边缘为白色疏松，且大部分愈伤组织生长较快。
3.3 MS培养基附加不同激素组合对愈伤组织再分化的影响 MS培养基添加激素6-BA和IBA不同配比对栀子叶片愈伤组织再分化情况见图3（A）所示。叶片诱导的愈伤组织在添加激素6-BA和IBA不同配比的MS培养基上均未诱导出丛生芽。
3.4 WPM培养基附加不同激素组合对愈伤组织再分化的影响 WPM培养基添加激素6-BA和IBA不同配比对栀子叶片愈伤组织再分化情况见图3（B）所示。叶片诱导的愈伤组织在添加激素6-BA和IBA不同配比的WPM培养基上均未诱导出丛生芽。
4 讨论
WPM是木本植物组织培养优选培养基，多种木本植物以WPM为基本培养基建立再生体系，如喜树[14]，中国李[15]、茶条槭[16]等。然而，栀子组培体系研究多以MS为基本培养基，还未见以WPM为基本培养基的研究。本研究以栀子叶片为外植体，MS和WPM为基本培养基，添加不同激素组合的6-BA和NAA或IBA，进行叶片愈伤组织诱导及愈伤组织再分化研究，对栀子叶片愈伤组织诱导进行优化。栀子叶片在MS和WPM培养基不添加任何激素的情况下，均无愈伤组织产生，而在添加不同激素配比的培养基上，虽然诱导率以及愈伤组织生长状态有所差异，但均有愈伤组织产生，表明植物激素在愈伤组织的诱导中起着重要作用。栀子叶片在WPM培养基上的诱导率远高于MS培养基，在添加不同激素配比的WPM培养基上均超过80%，而在MS培养基上，愈伤组织的最高平均诱导率为74.7%。但在MS培养基上诱导的愈伤组织多为绿色致密，在WPM培养基上诱导的愈伤组织多为白色疏松。以MS培养基上诱导的绿色愈伤组织为材料，接种于添加6-BA和IBA不同激素组合的MS和WPM的再分化培养基上，均无愈伤组织再分化。
本研究以固体MS及WPM为基本培养基，栀子叶片诱导愈伤组织材料，添加6-BA及IBA并未诱导出丛生芽。而张庆红等[17]研究表明用栀子种子愈伤组织可通过MS液体培养分化出芽，添加的激素TDZ是一种新型的植物生长调节剂，已成功地用于多种植物不定芽的诱导，对于木本植物的不定芽诱导具有突出的效果[18]。因此，可进一步采用MS或WPM培养基上添加TDZ，以液体培养方式对栀子叶片愈伤组织进行不定芽诱导。
栀子所含西红花苷及西红花酸，是色素类物质，不仅可食用，亦是被誉为“红色黄金”的名贵中药材西红花的主要活性物质。西红花入药部位为柱头，一朵西红花仅有3个柱头，柱头产量低，且人工采收成本高，加上西红花主产地在伊朗、希腊等国家，在我国资源短缺，导致西红花价格昂贵[19]。而栀子栽培地广，果实产量高，更适宜用来研究西红花苷等活性物质。所以，优化栀子组培体系，可为建立栀子功能基因研究体系提供理论依据，对栀子所含活性物质作用机制研究、栀子优良品种选育及保存具有重要意义。
参考文献
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[12]高敏霞，韦晓霞.栀子不同外植体愈伤组织诱导效果比较分析[J].东南园艺，2016，4（4）：8-10.
[13]曾妮，唐琳，沈文尉，等.栀子腋芽丛生离体繁殖及开花诱导[J].四川大学学报：自然科学版，2008，185（5）：1269-1272.
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[19]夏詩琪，彭逸珍，贾全全，等.栀子来源藏红花苷类成分研究进展[J].南方林业科学，2018，252（6）：51-54.
（2020-02-10收稿 责任编辑：芮莉莉）