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摘 要：实验采用生长速率法和孢子萌发法测定了五倍子、黄连、黄芩及乌梅4种中草药的提取物对水霉菌丝及游动孢子的抑制作用。结果表明，4种中草药的提取物对水霉菌丝生长及游动孢子的萌发均有一定程度的抑制作用。其中以黄芩的乙酸乙酯提取物对水霉菌丝的生长抑制作用最显著，0.1mg/mL时抑制效率为83%，0.5mg/mL时可完全抑制水霉菌丝的生长。黄芩的乙酸乙酯及无水乙醇提取物在浓度为0.4mg/mL，可使80%的水霉游动孢子萌发被抑制。
关键词：中草药；抑菌；水霉病
中图分类号 S943 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）02-11-03
Abstract：The inhibition effects of 4 kinds of Chinese herb medicines，such as Nutgall，Rhizoma Coptidis，Radix scutellariae and Dark plum，on Saprolegia zoospore and mycelium in vitro were studied. The results showed that all the extracts of 4 kinds of Chinese herb medicines had inhibitory action on both Saprolegia mycelial growth and zoospore germination in different degree. Furthermore，the results also show that the ethyl acetate extract of radix scutellariae had the most significant inhibition. It presented a 83% fungistatic rate at a concentration of 0.1mg/mL and could be killed the Saprolegia mycelium above 0.5mg/mL. The activity of 80% of the Saprolegia zoospore could be significantly inhibited by ethanol and ethyl acetate extraction of radix scutellariae when the application concentration at 0.4mg/mL.
Key words：Chinese herb medicines；Antibacterial activity；Saprolegia
水霉病是淡水动物的常见病害之一，其病原水霉（Saprolegnia）隶属于茸鞭生物界（Stramenopila）、卵菌纲（Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）、水霉科（Sprolegniaceae）[1]。可感染草鱼、鲫鱼、花鲈、大银鱼、斑点叉尾鮰、大鲵、黄鳝、乌鳢、虹鳟、月鳢、中华绒鳌蟹等[2-4]众多淡水养殖动物。通常健康鱼体及鱼卵对水霉病原的侵染具有较强的抵抗能力，但是在高密度养殖条件下，鱼体间相互摩擦后造成的损伤、应激作用及水质条件的恶化，均会导致鱼体的抗感染能力降低，使得鱼体更易感染水霉，因此冬末春初气温起伏较大的季节，往往是水霉病的高发期。水霉主要寄生在鱼体伤口和死卵上，危害养殖鱼体和降低鱼卵孵化率，给养殖产业造成了巨大的经济损失。以前孔雀石绿是治疗水霉病的有效药物，但由于该药具有“三致”，高毒性，高残留等问题，2002年农业部已将其列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》[5-7]。生产上虽然也使用氯化钠、福尔马林、过氧化氢、臭氧、腐植酸、二氧化氯、溴硝丙二醇等化学替代品进行水霉病的防治，但是这些药物由于缺乏高效性或其安全风险较高而未得到广泛认可[8-11]。中草药具有安全、有效、毒副作用小、无二次污染、不易产生耐药性等特点，有关中草药防治水产动物水霉病已有先例[12-14]。笔者在前期工作中发现4种对水霉具有较强抑菌作用的中草药，为了进一步研究其主要活性成分，采用系统溶剂极性法对这4种中草药进行提取，通过水霉菌丝生长及孢子萌发的抑制效果测定，初步确定抑菌活性部位，为进一步分离抑菌活性成分，开发新的水霉病防治药物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料 五倍子、黄连、黄芩、乌梅均购自湖州市慕韩斋中药店，水霉菌株分离于患病的异育银鲫，为本实验室保存菌株。
1.2 仪器与试剂 FZ102微型植物试样粉碎机，热回流提取装置，R-210/215型旋转蒸发仪（瑞士Buchi），Olympus-BX51显微镜（日本）。无水乙醇（分析纯），乙酸乙酯（分析纯），石油醚（分析纯）均购于上海化学试剂有限公司。
1.3 方法
1.3.1 五倍子、黄连等中草药粗提物的制备 中草药经粉碎机粉碎后，分装到广口瓶中备用。称取经粉碎的各种中草药粉末5份各20g，分别用6～8倍的石油醚（沸程60～90℃）、乙酸乙酯、无水乙醇和水回流提取3次，每次2h，合并各提取液，减压浓缩至浸膏，冰箱4℃保存备用。
1.3.2 药物对水霉菌丝的抑制效果 挑取保存于试管内的水霉菌丝接种于PDA平板，25℃培养至菌丝长满平板。将供试药物用20%二甲亚砜溶解后，制成不同浓度的含药平板，以加入等量20%二甲亚砜的平板为对照。将打孔器制备的直径1cm的菌饼置于PDA平板中央，每个浓度设3个平行，25℃恒温培养48h后，用十字交叉法测量其在含不同药剂浓度的培养基上菌落直径并与对照比较，计算各药剂处理对菌落扩展的生长抑制率。抑菌率（%）=[（对照菌落直径-菌饼直径）-（处理菌落直径-菌饼直径）]/（对照菌落直径-菌饼直径）×100。 1.3.3 药物对水霉孢子萌发的最小抑菌浓度测定 水霉孢子悬浮液的制备参考夏文伟等的方法。即将1.3.3中活化的菌株，转接至新的PDA平板，并在菌饼四周放置灭菌的油菜籽，待油菜籽长满菌丝后将其取出置于灭菌河水中，25℃培养直至产生大量游动孢子。然后用3层无菌纱布过滤制成终浓度为5×103个/mL的孢子悬液。取0.1mL水霉孢子悬液涂布含各浓度药物的PDA平板。25℃培养2d。每个浓度设2个对照，空白对照为加入等量20%的二甲亚砜平板。显微镜下观察孢子萌发情况。以80%以上的孢子被抑制萌发的最小药物浓度作为MIC80。
2 结果与分析
2.1 4种中草药提取物对水霉菌丝生长的抑制效果比较 4种中草药不同溶剂提取物的抑菌作用见表1。由表1可知，五倍子粗提物浓度小于0.2mg/mL时均对水霉菌丝的扩展没有任何抑制能力，0.5mg/mL及以上才表现出一定的抑制效果，其中无水乙醇>水>乙酸乙酯>石油醚。黄连各溶剂粗提物的抑菌效果：无水乙醇>水>乙酸乙酯>石油醚，浓度越高抑菌力越强。黄芩各溶剂粗提物均有较好的抑菌效果，其中以乙酸乙酯水粗提物抑制效果最好，0.1mg/mL时抑制率可达83%，0.5mg/mL则完全抑制菌丝的扩展。无水乙醇粗提物的抑制效果次之，低浓度效果比较明显，0.1mg/mL抑制率为66%，当浓度增至1.5mg/mL时抑菌效果增强并不显著，仅为87%。黄芩水粗提物在浓度0.1～1.5mg/mL时，抑制率在55%～61%。乌梅的乙酸乙酯及无水乙醇粗提物的抑菌效果略强于石油醚及水粗提物。虽然各粗提物在0.1mg/mL时的最低抑菌率为24%，但是药物浓度提高至1.5mg/mL时的最高抑菌率仅为73%。
3 结论与讨论
植物中化学成分十分复杂，在提取植物有效成分时，若仅用某一种溶剂不可能将植物的组成成分都提取出来，因此有必要采用极性由弱到强的几种不同溶剂对同一植物进行提取，使各成分依其在不同极性溶剂中的溶解度差异而分离出来，从而避免最强活性物质的“漏筛”。本研究通过石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇和水4种溶剂对五倍子、黄连、黄芩、乌梅等进行系统提取，并通过体外抑菌试验，进行药效活性追踪。结果表明，五倍子的活性成分主要存在于无水乙醇提取物；黄连对限制菌丝生长的活性成分主要存在无水乙醇提取物，而乙酸乙酯提取物对孢子萌发的抑制效果最明显；黄芩的活性成分主要存在于乙酸乙酯提取物；乌梅有效成分的分离效果不理想，乙酸乙酯、无水乙醇及水提取物对菌丝生长的限制作用差别不大，无水乙醇提取物对孢子萌发的抑制作用好于其他3种溶剂。
本试验结果显示，黄芩的乙酸乙酯提取物对供试水霉菌株菌丝及孢子的抑制效果最显著，但该活性部位仍然为含有多种成分的混合物，还需要通过活性追踪的方法进一步研究，最终获取水霉抑菌活性单体成分，并对其结构和功能的关系进行分析。所以本研究可为鱼类水霉病的下一步进行防治水霉活性物质的分离、鉴定，以及仿生合成，最终实现水产抗真菌渔药的产业化提供理论基础，也可为开发无公害杀虫渔药提供思路。
参考文献
[1]阿历索保罗CJ，明斯CW，布莱克韦尔M.菌物学概论[M].北京：中国农业出版社，2002：599-601.
[2]Quiniou SMA，Bigler S，Clem LM，et al.Effects of water temperature on mucous cell distribution in channel catfish epidermis：a factor in winter saprolegniasis[J].Fish &Shellfish Immunology，1998，8（1）：1-11.
[3]Diéguez-Uribeondo J，Cerenius L，S derh ll K.Physiological characterization of Saprolegnia parasitica isolates from brown trout[J].Aquaculture，1996，140（3）：247-257.
[4]李爱华，聂品，卢全章.花鲈水霉病及其病原的初步研究[J].水生生物学报，1999，23（4）：389-391.
[5]Prast H，Sopinska A.Evaluation of activity of the celluar protective process in crop with Saprolegnia infection and treatnent with mala chite green and immunostimulant[J].Medycyna Weterynaryjna，1989，45：603-605.
[6]翟毓秀，郭莹莹，耿霞，等.孔雀石绿的代谢机理及生物毒性研究进展[J].中国海洋大学学报，2007，37（1）：27-32.
[7]谢文，丁慧瑛，奚君阳，等.水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物残留量的检测[J].色谱，2006，24（5）：529-530。
[8]KITANCHAROEN N，ONO A，YAMAMOTO A，et a1.The fungistatic effect of NaCI On rainbow trout egg saprolegniasis [J].Fish Pathology，1997，32：159-162.
[9]Fomerisa G，Bellardib S，Palmegiano G B，et al.The use of ozone in trout hatchery to reduce Saprolegniasis incidence [J].Aquaculture，2003，221（1）：157-166
[10]GIESEKER C M，SERFLING S G.REIMSCHUESSEL R.Formalin treatment to reduce mortality associated with SapmLegnia parasitica in rainbow trout，Otworhynchus mykiss[J].Aquaculture，2006，253：120-129.
[11]Jeff J.Rach，James J.Valentine，Theresa M.Schreier，Mark P.Gaikowski，Tommie G.Crawford.Efficacy of hydrogen peroxide to control saprolegniasis on channel catfish（Ictalurus punctatus） eggs[J].Aquaculture，2004，238：135-142.
[12]蔡焰值，雷晓中，杨德忠，等.斑点叉尾鲴受精卵水霉病中草药防治的研究[J].湖北农业科学，2010，49（5）：1170-1172.
[13]李川，何登菊，牟洪民，等.大鲵水霉病中草药治疗试验[J].河北渔业，2010，1：33，57.
[14]陈晓艳，肖翰，付晓艳.55种中草药对广东乌龟水霉病致病菌的抑制作用[J].安徽农业科学，2010，38（33）：18855-18857.
（责编：张宏民）
关键词：中草药；抑菌；水霉病
中图分类号 S943 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）02-11-03
Abstract：The inhibition effects of 4 kinds of Chinese herb medicines，such as Nutgall，Rhizoma Coptidis，Radix scutellariae and Dark plum，on Saprolegia zoospore and mycelium in vitro were studied. The results showed that all the extracts of 4 kinds of Chinese herb medicines had inhibitory action on both Saprolegia mycelial growth and zoospore germination in different degree. Furthermore，the results also show that the ethyl acetate extract of radix scutellariae had the most significant inhibition. It presented a 83% fungistatic rate at a concentration of 0.1mg/mL and could be killed the Saprolegia mycelium above 0.5mg/mL. The activity of 80% of the Saprolegia zoospore could be significantly inhibited by ethanol and ethyl acetate extraction of radix scutellariae when the application concentration at 0.4mg/mL.
Key words：Chinese herb medicines；Antibacterial activity；Saprolegia
水霉病是淡水动物的常见病害之一，其病原水霉（Saprolegnia）隶属于茸鞭生物界（Stramenopila）、卵菌纲（Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）、水霉科（Sprolegniaceae）[1]。可感染草鱼、鲫鱼、花鲈、大银鱼、斑点叉尾鮰、大鲵、黄鳝、乌鳢、虹鳟、月鳢、中华绒鳌蟹等[2-4]众多淡水养殖动物。通常健康鱼体及鱼卵对水霉病原的侵染具有较强的抵抗能力，但是在高密度养殖条件下，鱼体间相互摩擦后造成的损伤、应激作用及水质条件的恶化，均会导致鱼体的抗感染能力降低，使得鱼体更易感染水霉，因此冬末春初气温起伏较大的季节，往往是水霉病的高发期。水霉主要寄生在鱼体伤口和死卵上，危害养殖鱼体和降低鱼卵孵化率，给养殖产业造成了巨大的经济损失。以前孔雀石绿是治疗水霉病的有效药物，但由于该药具有“三致”，高毒性，高残留等问题，2002年农业部已将其列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》[5-7]。生产上虽然也使用氯化钠、福尔马林、过氧化氢、臭氧、腐植酸、二氧化氯、溴硝丙二醇等化学替代品进行水霉病的防治，但是这些药物由于缺乏高效性或其安全风险较高而未得到广泛认可[8-11]。中草药具有安全、有效、毒副作用小、无二次污染、不易产生耐药性等特点，有关中草药防治水产动物水霉病已有先例[12-14]。笔者在前期工作中发现4种对水霉具有较强抑菌作用的中草药，为了进一步研究其主要活性成分，采用系统溶剂极性法对这4种中草药进行提取，通过水霉菌丝生长及孢子萌发的抑制效果测定，初步确定抑菌活性部位，为进一步分离抑菌活性成分，开发新的水霉病防治药物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料 五倍子、黄连、黄芩、乌梅均购自湖州市慕韩斋中药店，水霉菌株分离于患病的异育银鲫，为本实验室保存菌株。
1.2 仪器与试剂 FZ102微型植物试样粉碎机，热回流提取装置，R-210/215型旋转蒸发仪（瑞士Buchi），Olympus-BX51显微镜（日本）。无水乙醇（分析纯），乙酸乙酯（分析纯），石油醚（分析纯）均购于上海化学试剂有限公司。
1.3 方法
1.3.1 五倍子、黄连等中草药粗提物的制备 中草药经粉碎机粉碎后，分装到广口瓶中备用。称取经粉碎的各种中草药粉末5份各20g，分别用6～8倍的石油醚（沸程60～90℃）、乙酸乙酯、无水乙醇和水回流提取3次，每次2h，合并各提取液，减压浓缩至浸膏，冰箱4℃保存备用。
1.3.2 药物对水霉菌丝的抑制效果 挑取保存于试管内的水霉菌丝接种于PDA平板，25℃培养至菌丝长满平板。将供试药物用20%二甲亚砜溶解后，制成不同浓度的含药平板，以加入等量20%二甲亚砜的平板为对照。将打孔器制备的直径1cm的菌饼置于PDA平板中央，每个浓度设3个平行，25℃恒温培养48h后，用十字交叉法测量其在含不同药剂浓度的培养基上菌落直径并与对照比较，计算各药剂处理对菌落扩展的生长抑制率。抑菌率（%）=[（对照菌落直径-菌饼直径）-（处理菌落直径-菌饼直径）]/（对照菌落直径-菌饼直径）×100。 1.3.3 药物对水霉孢子萌发的最小抑菌浓度测定 水霉孢子悬浮液的制备参考夏文伟等的方法。即将1.3.3中活化的菌株，转接至新的PDA平板，并在菌饼四周放置灭菌的油菜籽，待油菜籽长满菌丝后将其取出置于灭菌河水中，25℃培养直至产生大量游动孢子。然后用3层无菌纱布过滤制成终浓度为5×103个/mL的孢子悬液。取0.1mL水霉孢子悬液涂布含各浓度药物的PDA平板。25℃培养2d。每个浓度设2个对照，空白对照为加入等量20%的二甲亚砜平板。显微镜下观察孢子萌发情况。以80%以上的孢子被抑制萌发的最小药物浓度作为MIC80。
2 结果与分析
2.1 4种中草药提取物对水霉菌丝生长的抑制效果比较 4种中草药不同溶剂提取物的抑菌作用见表1。由表1可知，五倍子粗提物浓度小于0.2mg/mL时均对水霉菌丝的扩展没有任何抑制能力，0.5mg/mL及以上才表现出一定的抑制效果，其中无水乙醇>水>乙酸乙酯>石油醚。黄连各溶剂粗提物的抑菌效果：无水乙醇>水>乙酸乙酯>石油醚，浓度越高抑菌力越强。黄芩各溶剂粗提物均有较好的抑菌效果，其中以乙酸乙酯水粗提物抑制效果最好，0.1mg/mL时抑制率可达83%，0.5mg/mL则完全抑制菌丝的扩展。无水乙醇粗提物的抑制效果次之，低浓度效果比较明显，0.1mg/mL抑制率为66%，当浓度增至1.5mg/mL时抑菌效果增强并不显著，仅为87%。黄芩水粗提物在浓度0.1～1.5mg/mL时，抑制率在55%～61%。乌梅的乙酸乙酯及无水乙醇粗提物的抑菌效果略强于石油醚及水粗提物。虽然各粗提物在0.1mg/mL时的最低抑菌率为24%，但是药物浓度提高至1.5mg/mL时的最高抑菌率仅为73%。
3 结论与讨论
植物中化学成分十分复杂，在提取植物有效成分时，若仅用某一种溶剂不可能将植物的组成成分都提取出来，因此有必要采用极性由弱到强的几种不同溶剂对同一植物进行提取，使各成分依其在不同极性溶剂中的溶解度差异而分离出来，从而避免最强活性物质的“漏筛”。本研究通过石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇和水4种溶剂对五倍子、黄连、黄芩、乌梅等进行系统提取，并通过体外抑菌试验，进行药效活性追踪。结果表明，五倍子的活性成分主要存在于无水乙醇提取物；黄连对限制菌丝生长的活性成分主要存在无水乙醇提取物，而乙酸乙酯提取物对孢子萌发的抑制效果最明显；黄芩的活性成分主要存在于乙酸乙酯提取物；乌梅有效成分的分离效果不理想，乙酸乙酯、无水乙醇及水提取物对菌丝生长的限制作用差别不大，无水乙醇提取物对孢子萌发的抑制作用好于其他3种溶剂。
本试验结果显示，黄芩的乙酸乙酯提取物对供试水霉菌株菌丝及孢子的抑制效果最显著，但该活性部位仍然为含有多种成分的混合物，还需要通过活性追踪的方法进一步研究，最终获取水霉抑菌活性单体成分，并对其结构和功能的关系进行分析。所以本研究可为鱼类水霉病的下一步进行防治水霉活性物质的分离、鉴定，以及仿生合成，最终实现水产抗真菌渔药的产业化提供理论基础，也可为开发无公害杀虫渔药提供思路。
参考文献
[1]阿历索保罗CJ，明斯CW，布莱克韦尔M.菌物学概论[M].北京：中国农业出版社，2002：599-601.
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[3]Diéguez-Uribeondo J，Cerenius L，S derh ll K.Physiological characterization of Saprolegnia parasitica isolates from brown trout[J].Aquaculture，1996，140（3）：247-257.
[4]李爱华，聂品，卢全章.花鲈水霉病及其病原的初步研究[J].水生生物学报，1999，23（4）：389-391.
[5]Prast H，Sopinska A.Evaluation of activity of the celluar protective process in crop with Saprolegnia infection and treatnent with mala chite green and immunostimulant[J].Medycyna Weterynaryjna，1989，45：603-605.
[6]翟毓秀，郭莹莹，耿霞，等.孔雀石绿的代谢机理及生物毒性研究进展[J].中国海洋大学学报，2007，37（1）：27-32.
[7]谢文，丁慧瑛，奚君阳，等.水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物残留量的检测[J].色谱，2006，24（5）：529-530。
[8]KITANCHAROEN N，ONO A，YAMAMOTO A，et a1.The fungistatic effect of NaCI On rainbow trout egg saprolegniasis [J].Fish Pathology，1997，32：159-162.
[9]Fomerisa G，Bellardib S，Palmegiano G B，et al.The use of ozone in trout hatchery to reduce Saprolegniasis incidence [J].Aquaculture，2003，221（1）：157-166
[10]GIESEKER C M，SERFLING S G.REIMSCHUESSEL R.Formalin treatment to reduce mortality associated with SapmLegnia parasitica in rainbow trout，Otworhynchus mykiss[J].Aquaculture，2006，253：120-129.
[11]Jeff J.Rach，James J.Valentine，Theresa M.Schreier，Mark P.Gaikowski，Tommie G.Crawford.Efficacy of hydrogen peroxide to control saprolegniasis on channel catfish（Ictalurus punctatus） eggs[J].Aquaculture，2004，238：135-142.
[12]蔡焰值，雷晓中，杨德忠，等.斑点叉尾鲴受精卵水霉病中草药防治的研究[J].湖北农业科学，2010，49（5）：1170-1172.
[13]李川，何登菊，牟洪民，等.大鲵水霉病中草药治疗试验[J].河北渔业，2010，1：33，57.
[14]陈晓艳，肖翰，付晓艳.55种中草药对广东乌龟水霉病致病菌的抑制作用[J].安徽农业科学，2010，38（33）：18855-18857.
（责编：张宏民）