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摘要：利用分子标记选育抗病小麦新品种已经成为一种快速有效的育种方法。本研究用29对抗病分子标记对354个小麦品种进行检测，分析这些标记在小麦品种中的分布情况。结果显示，检测到多个小麦品种同时含有多个标记，如黑麦AR132同时含有抗白粉病、叶锈病、纹枯病标记；淮麦0607、SN086218、石新733、徐30、潍74987、周麦28、中麦1219、连05167、淮05155、Jagger、CP02-62-1-2-2-2-1、中育01089同时含有抗白粉病、叶锈病、赤霉病标记。本研究为小麦聚合育种提供了一定依据。
关键词：小麦；抗病性；分子标记检测；分子标记辅助育种；聚合育种
中图分类号：S512.103.53文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）02-0001-09
DNA 分子标记技术产生于20世纪70年代，是一种理想的、基于DNA 变异的新型遗传标记，它能反映生物个体或种群基因组中的差异特征[1]。分子标记突破了表达基因的范围而不受基因表达的影响，可在任何组织、任何发育阶段进行检测。DNA 分子标记的开发和应用为建立分子标记辅助选择的农作物育种体系打开一扇新大门。目前，分子标记辅助育种技术（marker-assisted selection，MAS）在作物遗传育种上的应用越来越广泛，分子标记聚合育种得到很大发展，尤其是分子标记技术与常规育种的紧密结合，为作物育种技术带来一场新的变革。
小麦是我国重要的粮食作物，利用MAS选育高抗小麦品种也已如火如荼地開展起来。到目前为止，已经发现了58个小麦抗白粉病基因[2，3]、90个抗叶锈病基因[4]、100多个抗条锈病基因[5]、52个赤霉病抗性相关QTL[6]、15个抗纹枯病分子标记[7]、1个抗黄矮病基因Bdv2[8]。董建力等[9]通过聚合杂交将3个小麦抗白粉病标记Pm4b、Pm13和Pm21聚合在一起，从F3代群体中筛选出同时含有2～3个标记的株系。王心宇等[10]采用早代进行抗性鉴定结合MAS策略，筛选到14株Pm4a+Pm21的植株，16株Pm2+Pm4a的植株，6株Pm8+Pm21的植株，其后代的抗病性明显提高。曾祥艳等[11]利用MAS选育出兼抗黄矮病、白粉病和条锈病的小麦新种质。这些研究为培育持久、广谱抗病小麦品种奠定了基础。
然而迄今为止，研究者们对中国小麦品种遗传背景的了解仍不全面，每个小麦品种中含有多少个抗性分子标记，至今未做大规模系统调查。本研究检测了354份常规小麦品种的抗病相关分子标记，旨在为抗性小麦品种选育提供一定参考。
1材料与方法
1.1试验材料
本实验室共计保存近600份小麦品种资源，选取其中的354份常规小麦品种进行抗病相关分子标记检测。
1.2试验方法
1.2.1取材每个小麦品种随机取10粒种子进行萌发，萌发10天时，每株取顶叶混合研磨用于提取基因组DNA。
1.2.2基因组DNA提取采用CTAB法提取各材料基因组DNA[12]。用核酸仪测定DNA浓度，并稀释到50～60 ng/μL用于PCR扩增。
1.2.3引物合成根据文献报道的小麦抗病基因引物序列（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成。
1.2.4PCR扩增PCR反应体系：总体积20.0 μL，其中含有2×PCR Mix（百泰克）10.0 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。
PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1.0 min，退火0.5 min（退火温度根据各引物退火温度而定），72℃延伸0.5～1.0 min（根据各引物扩增片段长度而定），共35个循环；72℃终延伸10 min。扩增产物用相应浓度聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，紫外凝胶成像仪观察、拍照。
2结果与分析
2.1抗白粉病分子标记检测结果
利用13对抗白粉病分子标记对354个小麦品种进行检测，结果如表2所示。其中引物Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR（图1A）、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、LAG95+1F/LAG95+2R、Xgwm337F/Xgwm337R检测的小麦品种较多，其检出数量分别占所检品种总数的51.1%、50.3%、40.7%、40.7%。并且这些标记之间具有一定的关联，83个小麦品种均同时含有这四个标记；142个品种同时含有标记Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、Xgwm337F/Xgwm337R；99个品种同时含有标记Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、LAG95+1F/LAG95+2R；177个品种同时含有标记Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR和Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR。
Pm4bF/Pm4bR能够在38个小麦品种中扩增出目的条带（475 bp）（图1B），占所有检查品种的10.7%。C1F/R1R能够在44个小麦品种中检测出目的条带（470 bp）（图1C），占所有检查品种的 12.4%。BCD135-1F/BCD135-1R、BCD135-2F/BCD135-2R二对引物未在任何品种中检测出目的条带。
3讨论与结论
随着分子生物学的发展，利用MAS将是未来抗性小麦品种培育的方向。因此全面了解各个小麦品种至少是小麦核心种质分子水平的遗传背景是必不可少的，因为只有这样才能做到有的放矢地配制多种杂交组合，将多个抗性基因聚合到一起，培育多抗小麦品种。但是目前国内有关这方面的研究报道还不多。本研究用13对抗白粉病分子标记、7对抗叶锈病分子标记、2对抗条锈病分子标记、4对抗赤霉病分子标记、2对抗纹枯病分子标记、1对抗黄矮病分子标记对354个小麦品种的抗性背景在分子层面进行检测，检测到多个小麦品种同时含有多个标记，如黑麦AR132同时含有抗白粉病、叶锈病、纹枯病基因；淮麦0607、SN086218、石新733、徐30、潍74987、周麦28、中麦1219、连05167、淮05155、Jagger、CP02-62-1-2-2-2-1、中育01089同时含有抗白粉病、叶锈病、赤霉病基因。 孙果忠[43]用Pm4a/bF/Pm4a/bR检测了75个小麦品种，其中4个品种含有此标记，占5%。本试验检出4%的小麦品种含有此标记，二者基本相符。胡娜[44]用Pm2、Pm4、Pm13、Pm21、Pm30、Pm34分子标记对260份小麦育种亲本材料进行多态性检测，其中149份材料含有Pm2单基因（占57.31%），这与本研究结论相符（51.1%），可见Pm2标记在小麦中广泛存在。魏新燕等[36]对150个小麦品种的抗叶锈基因Lr35进行分子检测，检测出 8 个小麦品种（6068、白蚰包、中麦9、早洋、碧玛1号、小偃7631、东方红3号和 Madsen）含有Lr35标记，检出率较低，本研究在354个小麦品种中仅检出周麦20含有该标记，检出率也相当低。
利用分子标记选育小麦新品种具有诸多优势，但是随着时间的推移，一些生理小种出现了变异导致部分标记失效。孙果忠[43]对101个分子标记的实用性进行了评价，发现可用于MAS的标记有51个，占供试标记的50.5%，此类标记可直接用于MAS育种；28个标记丧失了有效性，不能再用于MAS育种。雷秀玉[45]对145个主推小麦品种进行了苗期白粉病抗性鉴定以及小麦抗白粉病基因分子标记的实用性评价，结果表明，Pm8基因在145个供试品种（系）中的分布频率为52.4%，但对白粉病菌群体已丧失抗性；Pm2、Pm4、Pm6、Pm12、Pm13、Pm16、Pm17、Pm21和Pm24基因对白粉病菌群体抗性好，但在145個供试品种中的分布频率较低，介于0～9.7%。研究表明，将多个抗病基因聚合在一起可以显著提高品种抗病性。董建力等[9]通过复合杂交将抗小麦白粉病基因Pm4b、Pm13、Pm21聚合到推广品种。王心宇发现聚合Pm2+Pm4a、Pm4a+Pm21、Pm8+Pm21的后代植株抗性增强[10]。全面系统地调查不同小麦品种中含有的抗病分子标记，对于小麦聚合育种具有重大意义。
参考文献：
[1]周延清. DNA 分子标记技术在植物研究中的应用[M]. 北京：化学工业出版社， 2005：61-87.
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关键词：小麦；抗病性；分子标记检测；分子标记辅助育种；聚合育种
中图分类号：S512.103.53文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）02-0001-09
DNA 分子标记技术产生于20世纪70年代，是一种理想的、基于DNA 变异的新型遗传标记，它能反映生物个体或种群基因组中的差异特征[1]。分子标记突破了表达基因的范围而不受基因表达的影响，可在任何组织、任何发育阶段进行检测。DNA 分子标记的开发和应用为建立分子标记辅助选择的农作物育种体系打开一扇新大门。目前，分子标记辅助育种技术（marker-assisted selection，MAS）在作物遗传育种上的应用越来越广泛，分子标记聚合育种得到很大发展，尤其是分子标记技术与常规育种的紧密结合，为作物育种技术带来一场新的变革。
小麦是我国重要的粮食作物，利用MAS选育高抗小麦品种也已如火如荼地開展起来。到目前为止，已经发现了58个小麦抗白粉病基因[2，3]、90个抗叶锈病基因[4]、100多个抗条锈病基因[5]、52个赤霉病抗性相关QTL[6]、15个抗纹枯病分子标记[7]、1个抗黄矮病基因Bdv2[8]。董建力等[9]通过聚合杂交将3个小麦抗白粉病标记Pm4b、Pm13和Pm21聚合在一起，从F3代群体中筛选出同时含有2～3个标记的株系。王心宇等[10]采用早代进行抗性鉴定结合MAS策略，筛选到14株Pm4a+Pm21的植株，16株Pm2+Pm4a的植株，6株Pm8+Pm21的植株，其后代的抗病性明显提高。曾祥艳等[11]利用MAS选育出兼抗黄矮病、白粉病和条锈病的小麦新种质。这些研究为培育持久、广谱抗病小麦品种奠定了基础。
然而迄今为止，研究者们对中国小麦品种遗传背景的了解仍不全面，每个小麦品种中含有多少个抗性分子标记，至今未做大规模系统调查。本研究检测了354份常规小麦品种的抗病相关分子标记，旨在为抗性小麦品种选育提供一定参考。
1材料与方法
1.1试验材料
本实验室共计保存近600份小麦品种资源，选取其中的354份常规小麦品种进行抗病相关分子标记检测。
1.2试验方法
1.2.1取材每个小麦品种随机取10粒种子进行萌发，萌发10天时，每株取顶叶混合研磨用于提取基因组DNA。
1.2.2基因组DNA提取采用CTAB法提取各材料基因组DNA[12]。用核酸仪测定DNA浓度，并稀释到50～60 ng/μL用于PCR扩增。
1.2.3引物合成根据文献报道的小麦抗病基因引物序列（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成。
1.2.4PCR扩增PCR反应体系：总体积20.0 μL，其中含有2×PCR Mix（百泰克）10.0 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。
PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1.0 min，退火0.5 min（退火温度根据各引物退火温度而定），72℃延伸0.5～1.0 min（根据各引物扩增片段长度而定），共35个循环；72℃终延伸10 min。扩增产物用相应浓度聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，紫外凝胶成像仪观察、拍照。
2结果与分析
2.1抗白粉病分子标记检测结果
利用13对抗白粉病分子标记对354个小麦品种进行检测，结果如表2所示。其中引物Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR（图1A）、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、LAG95+1F/LAG95+2R、Xgwm337F/Xgwm337R检测的小麦品种较多，其检出数量分别占所检品种总数的51.1%、50.3%、40.7%、40.7%。并且这些标记之间具有一定的关联，83个小麦品种均同时含有这四个标记；142个品种同时含有标记Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、Xgwm337F/Xgwm337R；99个品种同时含有标记Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、LAG95+1F/LAG95+2R；177个品种同时含有标记Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR和Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR。
Pm4bF/Pm4bR能够在38个小麦品种中扩增出目的条带（475 bp）（图1B），占所有检查品种的10.7%。C1F/R1R能够在44个小麦品种中检测出目的条带（470 bp）（图1C），占所有检查品种的 12.4%。BCD135-1F/BCD135-1R、BCD135-2F/BCD135-2R二对引物未在任何品种中检测出目的条带。
3讨论与结论
随着分子生物学的发展，利用MAS将是未来抗性小麦品种培育的方向。因此全面了解各个小麦品种至少是小麦核心种质分子水平的遗传背景是必不可少的，因为只有这样才能做到有的放矢地配制多种杂交组合，将多个抗性基因聚合到一起，培育多抗小麦品种。但是目前国内有关这方面的研究报道还不多。本研究用13对抗白粉病分子标记、7对抗叶锈病分子标记、2对抗条锈病分子标记、4对抗赤霉病分子标记、2对抗纹枯病分子标记、1对抗黄矮病分子标记对354个小麦品种的抗性背景在分子层面进行检测，检测到多个小麦品种同时含有多个标记，如黑麦AR132同时含有抗白粉病、叶锈病、纹枯病基因；淮麦0607、SN086218、石新733、徐30、潍74987、周麦28、中麦1219、连05167、淮05155、Jagger、CP02-62-1-2-2-2-1、中育01089同时含有抗白粉病、叶锈病、赤霉病基因。 孙果忠[43]用Pm4a/bF/Pm4a/bR检测了75个小麦品种，其中4个品种含有此标记，占5%。本试验检出4%的小麦品种含有此标记，二者基本相符。胡娜[44]用Pm2、Pm4、Pm13、Pm21、Pm30、Pm34分子标记对260份小麦育种亲本材料进行多态性检测，其中149份材料含有Pm2单基因（占57.31%），这与本研究结论相符（51.1%），可见Pm2标记在小麦中广泛存在。魏新燕等[36]对150个小麦品种的抗叶锈基因Lr35进行分子检测，检测出 8 个小麦品种（6068、白蚰包、中麦9、早洋、碧玛1号、小偃7631、东方红3号和 Madsen）含有Lr35标记，检出率较低，本研究在354个小麦品种中仅检出周麦20含有该标记，检出率也相当低。
利用分子标记选育小麦新品种具有诸多优势，但是随着时间的推移，一些生理小种出现了变异导致部分标记失效。孙果忠[43]对101个分子标记的实用性进行了评价，发现可用于MAS的标记有51个，占供试标记的50.5%，此类标记可直接用于MAS育种；28个标记丧失了有效性，不能再用于MAS育种。雷秀玉[45]对145个主推小麦品种进行了苗期白粉病抗性鉴定以及小麦抗白粉病基因分子标记的实用性评价，结果表明，Pm8基因在145个供试品种（系）中的分布频率为52.4%，但对白粉病菌群体已丧失抗性；Pm2、Pm4、Pm6、Pm12、Pm13、Pm16、Pm17、Pm21和Pm24基因对白粉病菌群体抗性好，但在145個供试品种中的分布频率较低，介于0～9.7%。研究表明，将多个抗病基因聚合在一起可以显著提高品种抗病性。董建力等[9]通过复合杂交将抗小麦白粉病基因Pm4b、Pm13、Pm21聚合到推广品种。王心宇发现聚合Pm2+Pm4a、Pm4a+Pm21、Pm8+Pm21的后代植株抗性增强[10]。全面系统地调查不同小麦品种中含有的抗病分子标记，对于小麦聚合育种具有重大意义。
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