目的:构建含胰蛋白酶酶切位点的Alloferon-1抗生肽重复串联DNA片段及其原核表达系统,了解有赖氨酸尾重组Alloferon-1(rAlloferon-1)体外抗肿瘤活性。方法:根据Alloferon-1序列不含精氨酸和赖氨酸的特点,构建C端加有含胰蛋白酶酶切位点赖氨酸的14×Alloferon-1抗生肽重复串联DNA片段。采用pET42a表达载体和E.coli BL21DE3表达宿主菌,构建Alloferon-1重复串联DNA片段原核表达系统。SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组产物表达量,Ni-NTA亲和层析、胰蛋白酶酶切和Sephadex G-50层析法提纯14×rAlloferon-1-K及其rAlloferon-1-K单体。BALB/c小鼠脾细胞分别与K562、KB和SGC肿瘤细胞共培养模,采用CCK-8法检测rAlloferon-1-K、化学合成Alloferon-1(cAlloferon-1)及Alloferon-1-K(cAlloferon-1-K)体外抑制肿瘤细胞生长及增殖的活性并进行比较。结果:原核表达系统E.coli BL21DE3pET42a-14×Alloferon-1-K在IPTG诱导下能有效表达14×rAlloferon-1-K蛋白,其产量约为细菌总蛋白的30%。0.1～10 ng/ml的rAlloferon-1-K具有明显提高小鼠脾细胞抑制K562、KB和SGC肿瘤细胞的生长及增殖(P<0.01),rAlloferon-1-K的抗肿瘤活性与cAlloferon-1及cAlloferon-1-K比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:本研究成功构建了Alloferon-1抗生肽重复串联原核表达系统,有效地提高了Alloferon-1产量;而且rAlloferon-1-K仍保持原有的体外抗肿瘤活性。