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摘 要 植物Ran蛋白与核质运输、微管形成等过程密切相关。通过Tail-RCR结合接头连接介导PCR法克隆了龙眼胚性愈伤组织（Embryogenic callus，EC）Ran家族DlRan3A和DlRan3B基因的5′调控序列，长度分别为1 276和714 bp。结合生物信息学法，分析启动子的转录起始位点和顺式作用元件。结果表明：龙眼EC DlRan3A和DlRan3B基因启动子分别存在1处和3处转录起始位点，且除了含有TATA box和CAAT box等基本顺式作用元件外，还含有多个光响应元件、激素应答元件、防御与逆境胁迫响应元件等。龙眼EC DlRan3A和DlRan3B启动子转录活性可能受到光、激素信号及逆境胁迫因素的诱导，在龙眼体胚发生过程中的信号转导应答过程中发挥重要作用。此外，在DlRan3A启动子区预测到1个长度为214 bp的CpG岛，为后续研究该基因启动子甲基化水平及分子调控机制提供了线索。龙眼EC Ran基因启动子的克隆与生物信息学分析有助于揭示Ran在体胚发生过程中的作用。
关键词 龙眼；体胚发生；Ran基因；启动子；生物信息学分析
中图分类号 S667.2 文献标识码 A
Cloning and Bioinformatic Analysis of the Promoters of DlRan3A and DlRan3B from Embryogenic Callus in Dimocarpus longan
TIAN Qilin， LIN Yuling， LAI Zhongxiong*， WANG Tianchi
Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract Ran proteins in plants are closely involved in nucleocytoplasmic transportion and the formation of microtubules. The 5′nontranscribed regions of DlRan3A and DlRan3B from embryogenic callus in Dimocarpus longan were cloned by using Tail-RCR and ligation-mediated PCR. DlRan3A and DlRan3B are the Ran gene family members， and the cloned 5′nontranscribed regions were of 1 276 bp and 714 bp length. Transcription start sites（TSSs） and cis-acting elements were analysed by using bioinformatical methods. The result indicated that the promoters of DlRan3A and DlRan3B had one and three TSSs respectively， including not only the ordinary cis-acting elements of TATA and CAAT box， but also such many cis-acting elements responsive to light， phytohormones and environmental stresses. The transcriptional activity of the promoters of DlRan3A and DlRan3B from embryogenic callus in Dimocarpus longan could be induced by the signals of light， phytohormones and environmental stresses， and it played an key role in the signal transduction in somatic embryogenesis. In addition， a 214 bp length of CpG island was predicted in the promoter of DlRan3A， which provided clues for further research on its methylation level and regulatory mechanisms. Cloning and bioinformatic analysis of the promoters of DlRan3A and DlRan3B from embryogenic callus in Dimocarpus longan would help to reveal the functions of Ran during somatic embryogenesis.
Key words Dimocarpus longan；Somatic embryogenesis；Ran；Promoter；Bioinformatic analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.014
小G蛋白是真核生物中广泛存在的一类单体蛋白，其分子量约20～40 ku，属于超家族蛋白。小G蛋白在真核生物进化过程中相当保守，主要作为分子开关，在有活性的GTP和GTP水解成的GDP之间进行转换，进而在细胞信号转导过程中发挥重要作用[1]。根据小G蛋白的结构和功能至少可将其分为5个亚家族：Ras、Rho、Rab、Arf和Ran。Ran（Ras-related nuclear protein）是Ras超基因家族的多功能小G蛋白，在核质运输、微管形成、有丝分裂纺锤体、细胞周期调控和核膜形成等方面都具有重要作用[2]。目前对于植物Ran功能的研究较少。拟南芥中包括4个RAN成员：AtRAN1、AtRAN2、AtRAN3和AtRAN4，其中AtRAN3在分生组织和发育的胚胎中表达水平较高，AtRAN4与盐胁迫诱导有关，与其它AtRAN只有65%的相似性[3]。近年来，关于植物中Ran基因的克隆和功能研究陆续增多[4-5]，然而关于该基因启动子的克隆甚至表达调控方面的研究较少。方智振等[5]的研究结果表明，龙眼体胚Ran3的31个转录本的表达量呈现一定的规律，在胚性愈伤组织和心形胚表达量高，而在球形胚表达量低，表现出与体胚发生过程中细胞分裂速率变化模式相似的特点，11个龙眼体胚Ran 3′UTR在体胚发生过程中的差异表达也呈现出基本一致的总体变化趋势。由此可见，龙眼Ran3不同成员可能与龙眼体胚发生过程的细胞增殖有密切的联系。本研究以方智振[5]克隆得到的带有完整ORF的2条龙眼Ran基因DNA序列（DlRan3A和DlRan3B）为基础，以对Ran基因的调控作用进行初步研究。 植物启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子结合的DNA序列，起到决定基因转录起始的作用。植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基因的表达。在本实验室方智振[5]的研究基础上，探索龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子在龙眼体胚发生过程的调控作用，包括其上游调控序列的顺势作用元件、反式作用因子及它们在一些生物、非生物胁迫过程中的应答机制等。本研究拟采用Tail-RCR结合接头连接介导PCR法分离DlRan3A和DlRan3B的5′调控序列，再利用生物信息学法，预测了启动子的顺式作用元件和CpG岛分布，推测其潜在功能，有助于揭示Ran在体胚发生过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 以本实验室保存的龙眼胚性愈伤组织为材料，用于DNA的提取。龙眼胚性愈伤组织DlRan3A和DlRan3B基因DNA序列参见方智振[5]的论文。
1.1.2 试剂 染色体步移试剂盒（TaKaRa Genome Walking Kit）、pMD18-T载体（TaKaRa）、胶回收试剂盒（BIOMIGA）；限制性内切酶：DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ、StuⅠ（TaKaRa）；T4 DNA ligase、10×Ligation Buffer、Restriction enzyme buffer（10×）（Thermo）等；其它各种引物及接头序列合成委托北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 龙眼胚性愈伤组织DNA的提取 采用经本实验室改良的CTAB法[6]提取龙眼胚性愈伤组织DNA。
1.2.2 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子克隆与测序 为尽可能获取龙眼DlRan3A和DlRan3B基因的启动子序列，本研究分别采用各有优势的交错式热不对称PCR染色体步移（Tail-PCR）和接头连接介导染色体步移法，对DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列进行PCR扩增。
Tail-PCR扩增：根据TaKaRa Genome Walking Kit引物设计原则，在已知的龙眼DlRan3A和DlRan3B基因（GenBank收录号分别为JQ775539和JQ279697）的已知序列区（最好不少于500 bp）分别设计3条反向且退火温度较高的特异性引物SP1、SP2和SP3，再与试剂盒中提供的4种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4进行热不对称PCR反应，通过3次巢式PCR反应获得已知序列的侧翼序列。用于扩增DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列的特异性引物情况详见表1。以提取的龙眼胚性愈伤组织DNA为模板，按照TaKaRa Genome Walking Kit说明和林玉玲等[7]的方法进行DlRan3A和DlRan3B基因启动子的克隆。
接头连接介导PCR扩增：在利用Tail-RCR法进一步扩增DlRan3A基因启动子序列屡试未果的前提下，改用接头连接介导PCR法（利用接头的PCR法不需要DNA环化，通常适用于寻找已知DNA序列周围未知启动子或其它调控区域），以期进一步得到该基因的5′调控序列。根据已采用Tail-RCR扩增得到的DlRan3A基因5′侧翼序列（373 bp），在靠近5端约200 bp的位置设计2条下游反向引物DlRan3A-SP2和DlRan3A-SP3，接头序列设计按照Universal Genome Walker kit（Clontech）说明书，并根据接头序列设计上游引物AP1和AP2进行巢式PCR扩增。以提取的龙眼胚性愈伤组织DNA为模板，参考Universal Genome Walker kit（Clontech）说明书和李先昆等[8]的方法进行DlRan3A基因启动子的进一步克隆。上游引物和接头序列如下：
接头序列1：GTAATACGACTCACTATAGGGCA
CGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT
接头序列2：PO4-ACCAGCCC-NH2
AP1：GTAATACGACTCACTATAGGGC
AP2：ACTATAGGGCACGCGTGGT。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带克隆至pMD18-T载体，插入目的片段测序委托上海博尚生物技术有限公司完成。
1.2.3 生物信息学分析 利用DNAMAN6软件进行测序结果和已知DNA序列的拼接，并进行多重比对分析。通过在线软件BDGP（http：//www.fruitfly.
org/seq_tools/promoter.html）预测转录起始位点及可能的核心启动子区域。利用在线软件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.Ugent.be/webtools/ plantcare
/html/）对DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中潜在的顺式作用元件的种类和分布情况进行分析。此外，还利用在线软件CpG Island Searcher（http：// www.cpgislands.com/）对启动子序列的CpG岛进行初步预测。
2 结果与分析
2.1 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因5′调控序列的获得
采用Tail-RCR法获得了DlRan3A和DlRan3B基因5′调控序列的2条带。测序结果表明，这2条目的条带的大小分别为373和811 bp。序列分析结果发现，2条序列的3′端分别与其已知序列重叠176和290 bp，证实所克隆获得的片段为DlRan3A和DlRan3B基因翻译起始密码子ATG上游序列。将获得的序列分别与该基因已知5′端调控序列进行拼接，分别得到261 bp的DlRan3A基因5′端调控序列和714 bp的DlRan3B基因5′端调控序列。 根据已获得的373 bp DlRan3A基因5′端序列，对DlRan3A基因的5′端调控序列进行进一步Tail-PCR扩增，但屡试未果，可能是DlRan3A在基因组中存在较复杂的序列或是Tail-RCR法的PCR反应体系需要进一步优化，从而导致无法继续获得它的5′端调控序列。因此，本研究拟改用接头连接介导PCR法对DlRan3A基因的启动子序列进行进一步克隆，结果在限制性内切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ酶切的DNA文库经过第2轮PCR扩增，结果获得了长度分别约为500、1 200和500 bp的特异性扩增片段，测序获得片段实际长度分别为491、1 182和491 bp，三者之间长度虽然存在差别，但具有相同的核苷酸序列，说明接头连接介导法扩增效率较高，本研究选择长度为1 182 bp的序列为DlRan3A基因的5′调控序列。序列分析结果发现，DlRan3A基因的3′端与经Tail-RCR法初步获得5′端调控序列重叠167 bp，经过验证证实本研究又成功向DlRan3A基因启动子上游序列步移了1 015 bp，将2种方法获得的序列结合DlRan3A基因已知的5′端调控序列进行拼接，最终获得1 276 bp的DlRan3A基因5′端调控序列。
2.2 龙眼Ran家族启动子转录起始位点的预测
经过启动子转录起始位点在线预测，DlRan3A基因1 276 bp的5′端调控序列可能存在3处核心启动子区域，位于-675～-626、-253～-204和-88～-39 bp，分值分别为0.94、0.99和0.94，可能的转录起始位点分别为A、A和C。此结果可推测位于-253～-204 bp的序列很可能就是该基因真正的核心启动子区域，转录起始位点为位于第-213 bp的A（图1）。
采用在线预测软件BDGP对DlRan3B基因进行分析预测，DlRan3A基因714 bp的5′端调控序列可能存在1处核心启动子区域，分别位于-79～-30 bp范围内，分值为0.97，可能的转录起始位点为C。此结果可推测位于-79～-30 bp的序列很可能就是该基因真正的核心启动子区域，转录起始位点为位于-39 bp的C（图2）。
2.3 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子顺式元件的功能预测
启动子生物学功能的在线预测结果表明，DlRan3A和DlRan3B基因启动子区域中，除了含有大量的核心启动子元件如TATA-box和CAAT-box之外，还存在多种顺式元件如与光响应、激素应答、厌氧反应、高转录水平等有关的调控元件及一些未知功能的元件（图1、2）。DlRan3A基因启动子中具有80个TATA box、23个CAAT box、多个激素应答元件和光响应元件等（图1）。DlRan3B基因启动子中具有26个TATA box、17个CAAT box、多个激素应答元件、防御与逆境胁迫响应元件和光响应元件等（图2）。DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列具有共同的顺式元件，也有存在各自特异的顺式元件。此外，本研究还从TAIR数据库中下载AtRan3的序列（TAIR收录号为AT5G55190），并将其5′端调控序列（2 082 bp）的PlantCARE预测结果与DlRan3A和DlRan3B已获得的5′端调控序列预测结果进行比较分析。
2.3.1 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子中含有多个光反应元件 DlRan3A和DlRan3B总共含有9个不同类型的光反应元件，不同成员之间所含的元件种类和数量有所不同，DlRan3A基因5′端调控序列所含的光反应元件较多（7个：Box 4、Box I、GAG-motif、GT1-motif、TCCC-motif、AE-box和TCT-motif），而DlRan3B仅5个（Box I、 GAG-motif、 I-box、 Sp1和TCCC-motif）。 AtRan3启动子区含有9种光反应元件（Box 4、 Box I、 G-box、 GA-motif、 GAG-motif、 GT1-motif、 GTGGC-motif、 I-box、 chs-Unit 1 m1）。
DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中，Box I、GAG-motif和TCCC-motif是2条序列共有的，说明这几个元件在龙眼Ran家族部分成员中具有保守性，有利于维持其功能。I-box、Sp1是DlRan3B基因启动子区特有的，而AE-box、Box 4、GT1-motif和TCT-motif是DlRan3A基因启动子区特有的，说明龙眼Ran家族部分不同成员在特定条件下具有不同的功能。DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列与AtRan3共有的光反应顺式元件有Box 4、Box I、GAG-motif、GT1-motif和I-box，这几个元件在进化上高度保守，而AtRan3含有的元件G-box、GA-motif、GTCCC-motif和chs-Unit 1 m1等是龙眼Ran家族启动子序列中未预测到的，可能是不同物种在不同阶段的基因功能特异性导致的。
2.3.2 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子中含有多个激素应答元件 DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列除了含有多个光反应元件之外，还含有5个参与生长素、赤霉素、水杨酸和茉莉酸甲酯等激素应答的顺式元件，说明它们在相应的激素信号转导过程中可能具有重要的作用。其中不同成员之间所含的元件种类和数量有所不同，DlRan3A基因5′端调控序列含有参与茉莉酸甲酯、生长素和水杨酸激素应答的4种元件， DlRan3B含有参与茉莉酸甲酯、赤霉素和水杨酸激素应答的4种元件，而AtRan3则含有参与茉莉酸甲酯、赤霉素和乙烯应答的4种元件。导致不同成员所含的顺式元件种类和数量的不同以及和拟南芥同源基因的差异，其原因可能是克隆得到的调控序列长度不同，不同成员基因具有功能特异性及不同物种进化的特异性等。 DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中，TCA-element、CGTCA-motif和TGACG-motif是2条序列共有的，分别参与水杨酸和茉莉酸甲酯激素应答反应，说明DlRan3A和DlRan3B基因在水杨酸和茉莉酸甲酯激素信号转导过程中均发挥作用。而TGA-box生长素应答元件是DlRan3A基因启动子区特有的，GARE-motif赤霉素应答元件是DlRan3B基因启动子区特有的，说明DlRan3A和DlRan3B基因又各自参与不同激素的信号转导途径。DlRan3A和DlRan3B基因5端调控序列与AtRan3共有的激素应答顺式元件是分别参与赤霉素和茉莉酸甲酯应答的顺式元件GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif， 然而AtRan3所含的ERE乙烯应答元件在DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中没有预测到，可能在龙眼体胚发生过程中，这2个成员并不参与乙烯信号转导过程。
2.3.3 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子中含有多个逆境响应元件 在DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中也预测到多个参与逆境响应的顺式元件，包括厌氧诱导响应元件、低温响应元件、防御与逆境响应元件和病原体诱导响应元件等。DlRan3A和DlRan3B共含有4个不同类型的逆境响应元件，AtRan3的5′端调控序列含有6种逆境响应元件，三者均含有ARE厌氧诱导响应元件和TC-rich repeats防御与逆境响应元件，说明这2个元件在龙眼Ran家族这2个成员间甚至物种之间保守性高。此外DlRan3A的5′端调控序列还含有参与伤害和病原体诱导响应的box S元件，DlRan3B还含有LTR低温响应元件，AtRan3启动子区含有Box-W1、ELI-box3、HSE和AT-rich sequence，分别参与真菌诱导、诱导子、热击胁迫和极大诱导子介导激活等过程；这些在DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中未预测到，可能与获得的序列长度有限有关。
2.3.4 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子中含有胚乳表达响应元件 在DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中还预测到可能参与胚乳表达的相关元件。DlRan3A基因含有AACA_motif，此元件负调控胚乳表达，DlRan3B基因含有Skn-1_motif胚乳表达正调控元件，可见DlRan3A和DlRan3B基因启动子在调控胚乳表达过程中可能存在复杂的相互作用机制，而Skn-1_motif也存在于AtRan3基因启动子区，说明Skn-1_motif元件在不同植物Ran基因在胚乳中的表达可能均起着重要调控作用。
2.3.5 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子中序列中含有大量功能未知或特异性相关的顺式元件 除了含有以上顺式元件以外，DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中还含有一系列未命名的、功能未知的顺式元件。Unnamed_1、Unnamed_3和Unnamed_4是DlRan3B和DlRan3A及AtRan3基因启动子中共同存在的，说明这3个元件在Ran基因表达调控中可能具有重要作用。此外，DlRan3A中还存在Unnamed_8、Unnamed_12和Unnamed_2等功能未知元件。
DlRan3A和DlRan3B基因及AtRan3基因启动子区还含有提高转录效率的5UTR Py-rich stretch序列。DlRan3A还含有可能参与玉米醇溶蛋白代谢相关的顺式作用元件O2-site、有关分生组织特异激活表达的CCGTCC-box元件、A-box和ATGCAAAT motif元件，DlRan3B含有α淀粉酶启动子的保守序列。AtRan3基因启动子区含有可能参与细胞周期响应的circadian元件，而龙眼Ran家族成员中没有预测到相关元件。
2.4 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子CpG岛的预测
本研究利用在线软件CpG Island Searcher[9]对DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列进行CpG岛的预测，根据Gardiner-Garden等[10]对CpG岛的定义，设定预测条件为：CpG岛长度至少200 bp的区域，间隔至少100 bp，其中GC所占比例超过50%，且CpG的实际值/期望值比例高于0.6。结果在DlRan3B基因启动子区没有预测到符合限定条件的CpG岛，可能与获得序列长度不同有关，在DlRan3A基因启动子区预测到1个CpG岛分布区，位于第995～1 168 bp范围内，GC含量为50%，CpG的实际值/期望值比例为1.143，CpG岛长度为214 bp（图2、3）。
3 讨论与结论
3.1 龙眼Ran家族启动子克隆方法的选择
植物基因启动子的克隆及功能研究对于了解植物基因表达调控机制奠定了基础。近年来，启动子克隆的方法主要是在PCR基础上发展而来，包括常规PCR、环状PCR（I-PCR、P-PCR）、锚定PCR、接头连接介导的PCR和热不对称交错式PCR技术（Tail-PCR）等[11]。Tail-PCR法具有简单、快速、高特异性和高效等优点，避免了酶切和连接，成为广泛应用的的扩增基因侧翼序列的方法。本研究中利用Tail-PCR法可以一次性获得5′端侧翼序列，但未能进一步扩增特异条带，可能是由于要扩增的5′端侧翼序列结构比较复杂，含有特殊的碱基序列，或者引物的退火温度和PCR模板稀释倍数等因素仍需要进一步优化，而Tail-PCR法的随机简并引物的结合位点有限，所以即使利用不同的简并引物也难以扩增到特异性结果。其他方法如反向PCR（IPCR）法虽然在低拷贝侧翼序列的扩增中有较好的特异性和灵敏度，但DNA环化过程中常产生多联体，或者DNA自连，从而导致非特异性扩增较多。为了提高扩增特异性，本研究拟采用接头连接介导PCR法进一步扩增DlRan3A的5′端侧翼序列，得到较理想的结果。接头连接介导PCR法是通过在未知序列上连接特异性接头，利用与这对接头序列互补的引物专一性地扩增目的DNA片段的方法。在酶切文库的构建和加接头等步骤准确无误的前提下，此方法能够准确地锚定模板，提高扩增特异性。 3.2 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子的潜在功能
光或激素可以刺激植物细胞促进其转运信号调节蛋白、转录因子甚至是光感受器和激素受体等，促进核质运输，这些过程还受到Ran蛋白的调控[12]。DlRan3A基因启动子区含有生长素响应元件，说明植物Ran可能在生长素调节的信号转导途径中甚至核质运输过程中发挥重要作用。Ran结合蛋白和Ran-GDP/Ran-GTP梯度对生长素诱导的有丝分裂进程也具有重要影响[13]。在DlRan3B基因启动子区预测到赤霉素响应元件，而赤霉素不仅影响体胚发生到种子萌发的转变[14]；还正调控体胚发生相关转录因子表达[15]。已有研究表明，赤霉素在促进体胚发生过程中还伴随着提高α淀粉酶的活性促进淀粉水解的过程[16]；而在DlRan3B基因启动子区预测到的α淀粉酶启动子保守序列可以说明DlRan3B可能参与调节α淀粉酶活性结合赤霉素信号调节从而影响龙眼体胚发生过程。此外，DlRan3A和DlRan3B基因启动子均含有的参与茉莉酸甲酯响应和水杨酸响应的顺式元件，可能影响植物抗病和体胚发生过程。
植物Ran蛋白如何应对外界环境的变化及其反应机制的研究具有重要意义。水稻OsRAN2过表达不仅可提高水稻的抗寒性，还可提高耐盐和渗透胁迫的能力[17-18]。DlRan3A和DlRan3B基因启动子区均含有厌氧诱导和防御与胁迫响应元件；DlRan3A基因启动子还含有参与伤害和病原体诱导的响应元件， DlRan3B含有低温响应元件。龙眼Ran家族很可能响应厌氧、低温、伤害和病原体等的诱导，通过不同成员及与环境因素的相互作用，提高自身活性，从而增强抵抗逆境胁迫的能力。
DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中分别存在可能参与胚乳特异表达响应的元件AACA_motif和Skn-1_motif，Skn-1_motif是胚乳中特异表达所必需的正调控元件，而AACA_motif负调控胚乳特异表达，DlRan3A基因启动子区还含有参与分生组织特异表达应答的顺式元件CCGTCC-box，可以预见转录因子可能通过结合龙眼Ran家族不同成员启动子的顺式元件，调控它们在胚乳或者分生组织中的转录水平，通过影响特异组织的发育，调控龙眼体胚发生的过程。
龙眼Ran家族在机理上如何参与影响植物激素水平，不同成员如何同植物激素相互作用等问题还需要更多的实验研究来支持推测；且龙眼Ran家族不同成员可能在特定逆境条件下各自发挥重要的作用，在某些逆境条件下可能共同发挥调控作用。综上所述，究竟Ran在龙眼体胚发生过程中如何调节植物细胞以应对胁迫，如何应答逆境信号转导等一系列问题还需进一步研究。
3.3 龙眼DlRan3A基因启动子序列“CpG岛”的潜在功能
CpG岛中5-甲基胞嘧啶的DNA甲基化是表观遗传最主要的方式之一，具有重要的生物学功能。在哺乳动物基因组中，除了少数胚胎干细胞之外，DNA甲基化大多发生在CpG二核苷酸富集序列，而近年来的研究结果证明，高等植物基因组中同样存在丰富的CpG二核苷酸甲基化修饰位点[19]。CpG结合蛋白（MBD）是一类能与甲基化CpG岛特异结合并相互作用的蛋白质，它们具有共同的由60～80个氨基酸组成的甲基化CpG结合域，能够在甲基化的启动子区募集组蛋白去乙酰化酶、组蛋白乙酰化酶、组蛋白甲基化酶和DNA甲基转移酶，使得该区的染色质结构改变，从而导致基因沉默。已有研究表明，拟南芥AtMBD5在AtRan3作用下定位于染色体周围，在植物细胞分裂过程中，通过结合和脱离5-甲基胞嘧啶，调控维持染色质结构[20]。研究结果显示Ran蛋白在植物细胞的染色体运动中可能具有关键作用。
本研究在DlRan3A基因启动子区预测到1个CpG岛，在DlRan3B启动子区则未预测到，可能与获得的启动子序列较短有关，说明高等植物基因组中CpG岛不一定富集分布于启动子区或者分布于5′端侧翼序列的位置存在差异[21]。通过检测这段序列在龙眼体胚发生不同阶段的甲基化水平，有助于深入研究在不同阶段DlRan3A基因所起的调控作用，尤其在染色体运动方面。染色体运动依赖于纺锤体微管的组装和去组装，而Ran参与控制微管的形成[22]，说明DlRan3A可能参与调控龙眼体胚发生的细胞分裂过程，研究DlRan3A基因启动子区的甲基化水平可为后续工作提供重要线索。
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责任编辑：黄东杰
关键词 龙眼；体胚发生；Ran基因；启动子；生物信息学分析
中图分类号 S667.2 文献标识码 A
Cloning and Bioinformatic Analysis of the Promoters of DlRan3A and DlRan3B from Embryogenic Callus in Dimocarpus longan
TIAN Qilin， LIN Yuling， LAI Zhongxiong*， WANG Tianchi
Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract Ran proteins in plants are closely involved in nucleocytoplasmic transportion and the formation of microtubules. The 5′nontranscribed regions of DlRan3A and DlRan3B from embryogenic callus in Dimocarpus longan were cloned by using Tail-RCR and ligation-mediated PCR. DlRan3A and DlRan3B are the Ran gene family members， and the cloned 5′nontranscribed regions were of 1 276 bp and 714 bp length. Transcription start sites（TSSs） and cis-acting elements were analysed by using bioinformatical methods. The result indicated that the promoters of DlRan3A and DlRan3B had one and three TSSs respectively， including not only the ordinary cis-acting elements of TATA and CAAT box， but also such many cis-acting elements responsive to light， phytohormones and environmental stresses. The transcriptional activity of the promoters of DlRan3A and DlRan3B from embryogenic callus in Dimocarpus longan could be induced by the signals of light， phytohormones and environmental stresses， and it played an key role in the signal transduction in somatic embryogenesis. In addition， a 214 bp length of CpG island was predicted in the promoter of DlRan3A， which provided clues for further research on its methylation level and regulatory mechanisms. Cloning and bioinformatic analysis of the promoters of DlRan3A and DlRan3B from embryogenic callus in Dimocarpus longan would help to reveal the functions of Ran during somatic embryogenesis.
Key words Dimocarpus longan；Somatic embryogenesis；Ran；Promoter；Bioinformatic analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.014
小G蛋白是真核生物中广泛存在的一类单体蛋白，其分子量约20～40 ku，属于超家族蛋白。小G蛋白在真核生物进化过程中相当保守，主要作为分子开关，在有活性的GTP和GTP水解成的GDP之间进行转换，进而在细胞信号转导过程中发挥重要作用[1]。根据小G蛋白的结构和功能至少可将其分为5个亚家族：Ras、Rho、Rab、Arf和Ran。Ran（Ras-related nuclear protein）是Ras超基因家族的多功能小G蛋白，在核质运输、微管形成、有丝分裂纺锤体、细胞周期调控和核膜形成等方面都具有重要作用[2]。目前对于植物Ran功能的研究较少。拟南芥中包括4个RAN成员：AtRAN1、AtRAN2、AtRAN3和AtRAN4，其中AtRAN3在分生组织和发育的胚胎中表达水平较高，AtRAN4与盐胁迫诱导有关，与其它AtRAN只有65%的相似性[3]。近年来，关于植物中Ran基因的克隆和功能研究陆续增多[4-5]，然而关于该基因启动子的克隆甚至表达调控方面的研究较少。方智振等[5]的研究结果表明，龙眼体胚Ran3的31个转录本的表达量呈现一定的规律，在胚性愈伤组织和心形胚表达量高，而在球形胚表达量低，表现出与体胚发生过程中细胞分裂速率变化模式相似的特点，11个龙眼体胚Ran 3′UTR在体胚发生过程中的差异表达也呈现出基本一致的总体变化趋势。由此可见，龙眼Ran3不同成员可能与龙眼体胚发生过程的细胞增殖有密切的联系。本研究以方智振[5]克隆得到的带有完整ORF的2条龙眼Ran基因DNA序列（DlRan3A和DlRan3B）为基础，以对Ran基因的调控作用进行初步研究。 植物启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子结合的DNA序列，起到决定基因转录起始的作用。植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基因的表达。在本实验室方智振[5]的研究基础上，探索龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子在龙眼体胚发生过程的调控作用，包括其上游调控序列的顺势作用元件、反式作用因子及它们在一些生物、非生物胁迫过程中的应答机制等。本研究拟采用Tail-RCR结合接头连接介导PCR法分离DlRan3A和DlRan3B的5′调控序列，再利用生物信息学法，预测了启动子的顺式作用元件和CpG岛分布，推测其潜在功能，有助于揭示Ran在体胚发生过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 以本实验室保存的龙眼胚性愈伤组织为材料，用于DNA的提取。龙眼胚性愈伤组织DlRan3A和DlRan3B基因DNA序列参见方智振[5]的论文。
1.1.2 试剂 染色体步移试剂盒（TaKaRa Genome Walking Kit）、pMD18-T载体（TaKaRa）、胶回收试剂盒（BIOMIGA）；限制性内切酶：DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ、StuⅠ（TaKaRa）；T4 DNA ligase、10×Ligation Buffer、Restriction enzyme buffer（10×）（Thermo）等；其它各种引物及接头序列合成委托北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 龙眼胚性愈伤组织DNA的提取 采用经本实验室改良的CTAB法[6]提取龙眼胚性愈伤组织DNA。
1.2.2 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子克隆与测序 为尽可能获取龙眼DlRan3A和DlRan3B基因的启动子序列，本研究分别采用各有优势的交错式热不对称PCR染色体步移（Tail-PCR）和接头连接介导染色体步移法，对DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列进行PCR扩增。
Tail-PCR扩增：根据TaKaRa Genome Walking Kit引物设计原则，在已知的龙眼DlRan3A和DlRan3B基因（GenBank收录号分别为JQ775539和JQ279697）的已知序列区（最好不少于500 bp）分别设计3条反向且退火温度较高的特异性引物SP1、SP2和SP3，再与试剂盒中提供的4种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4进行热不对称PCR反应，通过3次巢式PCR反应获得已知序列的侧翼序列。用于扩增DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列的特异性引物情况详见表1。以提取的龙眼胚性愈伤组织DNA为模板，按照TaKaRa Genome Walking Kit说明和林玉玲等[7]的方法进行DlRan3A和DlRan3B基因启动子的克隆。
接头连接介导PCR扩增：在利用Tail-RCR法进一步扩增DlRan3A基因启动子序列屡试未果的前提下，改用接头连接介导PCR法（利用接头的PCR法不需要DNA环化，通常适用于寻找已知DNA序列周围未知启动子或其它调控区域），以期进一步得到该基因的5′调控序列。根据已采用Tail-RCR扩增得到的DlRan3A基因5′侧翼序列（373 bp），在靠近5端约200 bp的位置设计2条下游反向引物DlRan3A-SP2和DlRan3A-SP3，接头序列设计按照Universal Genome Walker kit（Clontech）说明书，并根据接头序列设计上游引物AP1和AP2进行巢式PCR扩增。以提取的龙眼胚性愈伤组织DNA为模板，参考Universal Genome Walker kit（Clontech）说明书和李先昆等[8]的方法进行DlRan3A基因启动子的进一步克隆。上游引物和接头序列如下：
接头序列1：GTAATACGACTCACTATAGGGCA
CGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT
接头序列2：PO4-ACCAGCCC-NH2
AP1：GTAATACGACTCACTATAGGGC
AP2：ACTATAGGGCACGCGTGGT。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带克隆至pMD18-T载体，插入目的片段测序委托上海博尚生物技术有限公司完成。
1.2.3 生物信息学分析 利用DNAMAN6软件进行测序结果和已知DNA序列的拼接，并进行多重比对分析。通过在线软件BDGP（http：//www.fruitfly.
org/seq_tools/promoter.html）预测转录起始位点及可能的核心启动子区域。利用在线软件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.Ugent.be/webtools/ plantcare
/html/）对DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中潜在的顺式作用元件的种类和分布情况进行分析。此外，还利用在线软件CpG Island Searcher（http：// www.cpgislands.com/）对启动子序列的CpG岛进行初步预测。
2 结果与分析
2.1 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因5′调控序列的获得
采用Tail-RCR法获得了DlRan3A和DlRan3B基因5′调控序列的2条带。测序结果表明，这2条目的条带的大小分别为373和811 bp。序列分析结果发现，2条序列的3′端分别与其已知序列重叠176和290 bp，证实所克隆获得的片段为DlRan3A和DlRan3B基因翻译起始密码子ATG上游序列。将获得的序列分别与该基因已知5′端调控序列进行拼接，分别得到261 bp的DlRan3A基因5′端调控序列和714 bp的DlRan3B基因5′端调控序列。 根据已获得的373 bp DlRan3A基因5′端序列，对DlRan3A基因的5′端调控序列进行进一步Tail-PCR扩增，但屡试未果，可能是DlRan3A在基因组中存在较复杂的序列或是Tail-RCR法的PCR反应体系需要进一步优化，从而导致无法继续获得它的5′端调控序列。因此，本研究拟改用接头连接介导PCR法对DlRan3A基因的启动子序列进行进一步克隆，结果在限制性内切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ酶切的DNA文库经过第2轮PCR扩增，结果获得了长度分别约为500、1 200和500 bp的特异性扩增片段，测序获得片段实际长度分别为491、1 182和491 bp，三者之间长度虽然存在差别，但具有相同的核苷酸序列，说明接头连接介导法扩增效率较高，本研究选择长度为1 182 bp的序列为DlRan3A基因的5′调控序列。序列分析结果发现，DlRan3A基因的3′端与经Tail-RCR法初步获得5′端调控序列重叠167 bp，经过验证证实本研究又成功向DlRan3A基因启动子上游序列步移了1 015 bp，将2种方法获得的序列结合DlRan3A基因已知的5′端调控序列进行拼接，最终获得1 276 bp的DlRan3A基因5′端调控序列。
2.2 龙眼Ran家族启动子转录起始位点的预测
经过启动子转录起始位点在线预测，DlRan3A基因1 276 bp的5′端调控序列可能存在3处核心启动子区域，位于-675～-626、-253～-204和-88～-39 bp，分值分别为0.94、0.99和0.94，可能的转录起始位点分别为A、A和C。此结果可推测位于-253～-204 bp的序列很可能就是该基因真正的核心启动子区域，转录起始位点为位于第-213 bp的A（图1）。
采用在线预测软件BDGP对DlRan3B基因进行分析预测，DlRan3A基因714 bp的5′端调控序列可能存在1处核心启动子区域，分别位于-79～-30 bp范围内，分值为0.97，可能的转录起始位点为C。此结果可推测位于-79～-30 bp的序列很可能就是该基因真正的核心启动子区域，转录起始位点为位于-39 bp的C（图2）。
2.3 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子顺式元件的功能预测
启动子生物学功能的在线预测结果表明，DlRan3A和DlRan3B基因启动子区域中，除了含有大量的核心启动子元件如TATA-box和CAAT-box之外，还存在多种顺式元件如与光响应、激素应答、厌氧反应、高转录水平等有关的调控元件及一些未知功能的元件（图1、2）。DlRan3A基因启动子中具有80个TATA box、23个CAAT box、多个激素应答元件和光响应元件等（图1）。DlRan3B基因启动子中具有26个TATA box、17个CAAT box、多个激素应答元件、防御与逆境胁迫响应元件和光响应元件等（图2）。DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列具有共同的顺式元件，也有存在各自特异的顺式元件。此外，本研究还从TAIR数据库中下载AtRan3的序列（TAIR收录号为AT5G55190），并将其5′端调控序列（2 082 bp）的PlantCARE预测结果与DlRan3A和DlRan3B已获得的5′端调控序列预测结果进行比较分析。
2.3.1 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子中含有多个光反应元件 DlRan3A和DlRan3B总共含有9个不同类型的光反应元件，不同成员之间所含的元件种类和数量有所不同，DlRan3A基因5′端调控序列所含的光反应元件较多（7个：Box 4、Box I、GAG-motif、GT1-motif、TCCC-motif、AE-box和TCT-motif），而DlRan3B仅5个（Box I、 GAG-motif、 I-box、 Sp1和TCCC-motif）。 AtRan3启动子区含有9种光反应元件（Box 4、 Box I、 G-box、 GA-motif、 GAG-motif、 GT1-motif、 GTGGC-motif、 I-box、 chs-Unit 1 m1）。
DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中，Box I、GAG-motif和TCCC-motif是2条序列共有的，说明这几个元件在龙眼Ran家族部分成员中具有保守性，有利于维持其功能。I-box、Sp1是DlRan3B基因启动子区特有的，而AE-box、Box 4、GT1-motif和TCT-motif是DlRan3A基因启动子区特有的，说明龙眼Ran家族部分不同成员在特定条件下具有不同的功能。DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列与AtRan3共有的光反应顺式元件有Box 4、Box I、GAG-motif、GT1-motif和I-box，这几个元件在进化上高度保守，而AtRan3含有的元件G-box、GA-motif、GTCCC-motif和chs-Unit 1 m1等是龙眼Ran家族启动子序列中未预测到的，可能是不同物种在不同阶段的基因功能特异性导致的。
2.3.2 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子中含有多个激素应答元件 DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列除了含有多个光反应元件之外，还含有5个参与生长素、赤霉素、水杨酸和茉莉酸甲酯等激素应答的顺式元件，说明它们在相应的激素信号转导过程中可能具有重要的作用。其中不同成员之间所含的元件种类和数量有所不同，DlRan3A基因5′端调控序列含有参与茉莉酸甲酯、生长素和水杨酸激素应答的4种元件， DlRan3B含有参与茉莉酸甲酯、赤霉素和水杨酸激素应答的4种元件，而AtRan3则含有参与茉莉酸甲酯、赤霉素和乙烯应答的4种元件。导致不同成员所含的顺式元件种类和数量的不同以及和拟南芥同源基因的差异，其原因可能是克隆得到的调控序列长度不同，不同成员基因具有功能特异性及不同物种进化的特异性等。 DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中，TCA-element、CGTCA-motif和TGACG-motif是2条序列共有的，分别参与水杨酸和茉莉酸甲酯激素应答反应，说明DlRan3A和DlRan3B基因在水杨酸和茉莉酸甲酯激素信号转导过程中均发挥作用。而TGA-box生长素应答元件是DlRan3A基因启动子区特有的，GARE-motif赤霉素应答元件是DlRan3B基因启动子区特有的，说明DlRan3A和DlRan3B基因又各自参与不同激素的信号转导途径。DlRan3A和DlRan3B基因5端调控序列与AtRan3共有的激素应答顺式元件是分别参与赤霉素和茉莉酸甲酯应答的顺式元件GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif， 然而AtRan3所含的ERE乙烯应答元件在DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中没有预测到，可能在龙眼体胚发生过程中，这2个成员并不参与乙烯信号转导过程。
2.3.3 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子中含有多个逆境响应元件 在DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中也预测到多个参与逆境响应的顺式元件，包括厌氧诱导响应元件、低温响应元件、防御与逆境响应元件和病原体诱导响应元件等。DlRan3A和DlRan3B共含有4个不同类型的逆境响应元件，AtRan3的5′端调控序列含有6种逆境响应元件，三者均含有ARE厌氧诱导响应元件和TC-rich repeats防御与逆境响应元件，说明这2个元件在龙眼Ran家族这2个成员间甚至物种之间保守性高。此外DlRan3A的5′端调控序列还含有参与伤害和病原体诱导响应的box S元件，DlRan3B还含有LTR低温响应元件，AtRan3启动子区含有Box-W1、ELI-box3、HSE和AT-rich sequence，分别参与真菌诱导、诱导子、热击胁迫和极大诱导子介导激活等过程；这些在DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中未预测到，可能与获得的序列长度有限有关。
2.3.4 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子中含有胚乳表达响应元件 在DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中还预测到可能参与胚乳表达的相关元件。DlRan3A基因含有AACA_motif，此元件负调控胚乳表达，DlRan3B基因含有Skn-1_motif胚乳表达正调控元件，可见DlRan3A和DlRan3B基因启动子在调控胚乳表达过程中可能存在复杂的相互作用机制，而Skn-1_motif也存在于AtRan3基因启动子区，说明Skn-1_motif元件在不同植物Ran基因在胚乳中的表达可能均起着重要调控作用。
2.3.5 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子中序列中含有大量功能未知或特异性相关的顺式元件 除了含有以上顺式元件以外，DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中还含有一系列未命名的、功能未知的顺式元件。Unnamed_1、Unnamed_3和Unnamed_4是DlRan3B和DlRan3A及AtRan3基因启动子中共同存在的，说明这3个元件在Ran基因表达调控中可能具有重要作用。此外，DlRan3A中还存在Unnamed_8、Unnamed_12和Unnamed_2等功能未知元件。
DlRan3A和DlRan3B基因及AtRan3基因启动子区还含有提高转录效率的5UTR Py-rich stretch序列。DlRan3A还含有可能参与玉米醇溶蛋白代谢相关的顺式作用元件O2-site、有关分生组织特异激活表达的CCGTCC-box元件、A-box和ATGCAAAT motif元件，DlRan3B含有α淀粉酶启动子的保守序列。AtRan3基因启动子区含有可能参与细胞周期响应的circadian元件，而龙眼Ran家族成员中没有预测到相关元件。
2.4 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子CpG岛的预测
本研究利用在线软件CpG Island Searcher[9]对DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列进行CpG岛的预测，根据Gardiner-Garden等[10]对CpG岛的定义，设定预测条件为：CpG岛长度至少200 bp的区域，间隔至少100 bp，其中GC所占比例超过50%，且CpG的实际值/期望值比例高于0.6。结果在DlRan3B基因启动子区没有预测到符合限定条件的CpG岛，可能与获得序列长度不同有关，在DlRan3A基因启动子区预测到1个CpG岛分布区，位于第995～1 168 bp范围内，GC含量为50%，CpG的实际值/期望值比例为1.143，CpG岛长度为214 bp（图2、3）。
3 讨论与结论
3.1 龙眼Ran家族启动子克隆方法的选择
植物基因启动子的克隆及功能研究对于了解植物基因表达调控机制奠定了基础。近年来，启动子克隆的方法主要是在PCR基础上发展而来，包括常规PCR、环状PCR（I-PCR、P-PCR）、锚定PCR、接头连接介导的PCR和热不对称交错式PCR技术（Tail-PCR）等[11]。Tail-PCR法具有简单、快速、高特异性和高效等优点，避免了酶切和连接，成为广泛应用的的扩增基因侧翼序列的方法。本研究中利用Tail-PCR法可以一次性获得5′端侧翼序列，但未能进一步扩增特异条带，可能是由于要扩增的5′端侧翼序列结构比较复杂，含有特殊的碱基序列，或者引物的退火温度和PCR模板稀释倍数等因素仍需要进一步优化，而Tail-PCR法的随机简并引物的结合位点有限，所以即使利用不同的简并引物也难以扩增到特异性结果。其他方法如反向PCR（IPCR）法虽然在低拷贝侧翼序列的扩增中有较好的特异性和灵敏度，但DNA环化过程中常产生多联体，或者DNA自连，从而导致非特异性扩增较多。为了提高扩增特异性，本研究拟采用接头连接介导PCR法进一步扩增DlRan3A的5′端侧翼序列，得到较理想的结果。接头连接介导PCR法是通过在未知序列上连接特异性接头，利用与这对接头序列互补的引物专一性地扩增目的DNA片段的方法。在酶切文库的构建和加接头等步骤准确无误的前提下，此方法能够准确地锚定模板，提高扩增特异性。 3.2 龙眼DlRan3A和DlRan3B基因启动子的潜在功能
光或激素可以刺激植物细胞促进其转运信号调节蛋白、转录因子甚至是光感受器和激素受体等，促进核质运输，这些过程还受到Ran蛋白的调控[12]。DlRan3A基因启动子区含有生长素响应元件，说明植物Ran可能在生长素调节的信号转导途径中甚至核质运输过程中发挥重要作用。Ran结合蛋白和Ran-GDP/Ran-GTP梯度对生长素诱导的有丝分裂进程也具有重要影响[13]。在DlRan3B基因启动子区预测到赤霉素响应元件，而赤霉素不仅影响体胚发生到种子萌发的转变[14]；还正调控体胚发生相关转录因子表达[15]。已有研究表明，赤霉素在促进体胚发生过程中还伴随着提高α淀粉酶的活性促进淀粉水解的过程[16]；而在DlRan3B基因启动子区预测到的α淀粉酶启动子保守序列可以说明DlRan3B可能参与调节α淀粉酶活性结合赤霉素信号调节从而影响龙眼体胚发生过程。此外，DlRan3A和DlRan3B基因启动子均含有的参与茉莉酸甲酯响应和水杨酸响应的顺式元件，可能影响植物抗病和体胚发生过程。
植物Ran蛋白如何应对外界环境的变化及其反应机制的研究具有重要意义。水稻OsRAN2过表达不仅可提高水稻的抗寒性，还可提高耐盐和渗透胁迫的能力[17-18]。DlRan3A和DlRan3B基因启动子区均含有厌氧诱导和防御与胁迫响应元件；DlRan3A基因启动子还含有参与伤害和病原体诱导的响应元件， DlRan3B含有低温响应元件。龙眼Ran家族很可能响应厌氧、低温、伤害和病原体等的诱导，通过不同成员及与环境因素的相互作用，提高自身活性，从而增强抵抗逆境胁迫的能力。
DlRan3A和DlRan3B基因启动子序列中分别存在可能参与胚乳特异表达响应的元件AACA_motif和Skn-1_motif，Skn-1_motif是胚乳中特异表达所必需的正调控元件，而AACA_motif负调控胚乳特异表达，DlRan3A基因启动子区还含有参与分生组织特异表达应答的顺式元件CCGTCC-box，可以预见转录因子可能通过结合龙眼Ran家族不同成员启动子的顺式元件，调控它们在胚乳或者分生组织中的转录水平，通过影响特异组织的发育，调控龙眼体胚发生的过程。
龙眼Ran家族在机理上如何参与影响植物激素水平，不同成员如何同植物激素相互作用等问题还需要更多的实验研究来支持推测；且龙眼Ran家族不同成员可能在特定逆境条件下各自发挥重要的作用，在某些逆境条件下可能共同发挥调控作用。综上所述，究竟Ran在龙眼体胚发生过程中如何调节植物细胞以应对胁迫，如何应答逆境信号转导等一系列问题还需进一步研究。
3.3 龙眼DlRan3A基因启动子序列“CpG岛”的潜在功能
CpG岛中5-甲基胞嘧啶的DNA甲基化是表观遗传最主要的方式之一，具有重要的生物学功能。在哺乳动物基因组中，除了少数胚胎干细胞之外，DNA甲基化大多发生在CpG二核苷酸富集序列，而近年来的研究结果证明，高等植物基因组中同样存在丰富的CpG二核苷酸甲基化修饰位点[19]。CpG结合蛋白（MBD）是一类能与甲基化CpG岛特异结合并相互作用的蛋白质，它们具有共同的由60～80个氨基酸组成的甲基化CpG结合域，能够在甲基化的启动子区募集组蛋白去乙酰化酶、组蛋白乙酰化酶、组蛋白甲基化酶和DNA甲基转移酶，使得该区的染色质结构改变，从而导致基因沉默。已有研究表明，拟南芥AtMBD5在AtRan3作用下定位于染色体周围，在植物细胞分裂过程中，通过结合和脱离5-甲基胞嘧啶，调控维持染色质结构[20]。研究结果显示Ran蛋白在植物细胞的染色体运动中可能具有关键作用。
本研究在DlRan3A基因启动子区预测到1个CpG岛，在DlRan3B启动子区则未预测到，可能与获得的启动子序列较短有关，说明高等植物基因组中CpG岛不一定富集分布于启动子区或者分布于5′端侧翼序列的位置存在差异[21]。通过检测这段序列在龙眼体胚发生不同阶段的甲基化水平，有助于深入研究在不同阶段DlRan3A基因所起的调控作用，尤其在染色体运动方面。染色体运动依赖于纺锤体微管的组装和去组装，而Ran参与控制微管的形成[22]，说明DlRan3A可能参与调控龙眼体胚发生的细胞分裂过程，研究DlRan3A基因启动子区的甲基化水平可为后续工作提供重要线索。
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责任编辑：黄东杰