【摘 要】
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目的:明确肺炎链球菌糖酵解关键酶烯醇化酶(enolase,Eno)和热休克蛋白DnaJ是否有直接结合及结合位点。方法:原核表达并纯化Eno全长蛋白,鉴定其酶活性,利用重组Eno蛋白皮下免
【机 构】
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重庆医科大学检验医学院、临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆医科大学第一临床学院
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目的:明确肺炎链球菌糖酵解关键酶烯醇化酶(enolase,Eno)和热休克蛋白DnaJ是否有直接结合及结合位点。方法:原核表达并纯化Eno全长蛋白,鉴定其酶活性,利用重组Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠制备特异性抗血清,分析其胞外分泌情况;采用生物膜层干涉(biolayer interferometrvy,BLI)技术和直接结合实验鉴定Eno和DnaJ两者之间是否存在直接相互作用;在前者结果阳性的基础上,截短表达Eno蛋白,通过直接结合实验鉴定Eno蛋白结合DnaJ的位点。结果:成功表达重组Eno蛋白,纯度达90%,该蛋白具有酶活性;重组Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠后,获得效价达1∶7.68×106的特异性抗血清;Western blot分析显示,7种不同血清型肺炎链球菌培养上清中均在分子量约47 k D处出现特异性反应带;直接结合试验显示,随着Eno蛋白浓度增加,Eno与DnaJ的结合量也相应增加(r=0.920,P=0.000),其吸光度值从0.222±0.042(12.5μg/ml)增加到0.569±0.099(200.0μg/ml);BLI技术测定两者结合的亲和常数为926 nmol/L;截短的Eno(aa1~aa100)与DnaJ的结合量2.25±0.38高于其他截短序列的结合量0.94±0.25、1.08±0.09、0.75±0.12,差异具有统计学意义(P=0.000,P=0.001,P=0.000)。结论:肺炎链球菌Eno蛋白与DnaJ蛋白存在直接结合作用,结合位点主要位于其N端的1~100个氨基酸序列。
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