【摘 要】
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[目的]DNA磷硫酰化(phosphorothioation,PT)是由硫原子取代DNA骨架磷原子上的非桥联氧原子形成的一种新型DNA修饰.PT修饰除参与组成限制修饰系统外,其更为广泛的生物学功能仍有待揭示.PT修饰现有的检测方法操作复杂、成本高、耗时长,而具有操作简便、成本低、耗时短等特点的酶联免疫检测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)成为新PT检测方法开发的优选.灭癌素链霉菌(Streptomyces gancidicus)中具有天蓝色链霉菌中PT修饰依
【机 构】
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上海交通大学生命科学技术学院,微生物代谢国家重点实验室,上海200030
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[目的]DNA磷硫酰化(phosphorothioation,PT)是由硫原子取代DNA骨架磷原子上的非桥联氧原子形成的一种新型DNA修饰.PT修饰除参与组成限制修饰系统外,其更为广泛的生物学功能仍有待揭示.PT修饰现有的检测方法操作复杂、成本高、耗时长,而具有操作简便、成本低、耗时短等特点的酶联免疫检测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)成为新PT检测方法开发的优选.灭癌素链霉菌(Streptomyces gancidicus)中具有天蓝色链霉菌中PT修饰依赖的IV型限制酶(ScoMcrA)的同源酶,暗示其同样含有特异性结合PT修饰DNA的硫结合结构域(sulfur binding domain,SBD).本文对灭癌素链霉菌中的SBD(简称为Sg-SBD)与PT修饰DNA的亲和力进行定性检测与定量表征,评估其用于PT修饰ELISA方法开发的潜力.[方法]对ScoMcrA-SBD和Sg-SBD的氨基酸序列进行比对分析,利用ScoMcrA-SBD为模板进行同源建模.在大肠杆菌中异源表达Sg-SBD,利用纯化的Sg-SBD进行凝胶迁移(electrophoresis mobility shift assays,EMSA)检测.利用生物膜层干涉(biolayer interferometry,BLI)技术进行Sg-SBD结合PT修饰DNA的定量表征.[结果]生物信息学分析揭示了Sg-SBD含有结合硫原子的保守的氨基酸残基,同时表明Sg-SBD具有与ScoMcrA-SBD相似的结构.EMSA实验发现Sg-SBD可以结合PT修饰DNA形成明显的迁移带,初步证实Sg-SBD结合PT修饰DNA的活性.BLI数据显示,Sg-SBD具有比ScoMcrA-SBD更强的PT修饰DNA结合能力,其与PT修饰DNA的亲和力常数在nmol/L级别,并且Sg-SBD不结合非PT修饰DNA.[结论]Sg-SBD结合PT修饰DNA活性接近抗原-抗体的反应水平,可用于PT修饰DNA ELISA快速检测方法的开发.
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[目的]研究伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)CTO-S对于病毒复制的影响.[方法]利用3\'RACE和5\'RACE鉴定CTO-S的全长序列.验证CTO-S是否具有编码多肽的能力.Red重组方法构建CTO-S缺失株以及回复突变株.分析野毒株、缺失株和回复突变株复制的差异.利用RNA pull down联合质谱的方法筛选与CTO-S互作的宿主蛋白.利用RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipi
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[背景]诺如病毒(Norovirus,NoV)是引发全球人类急性胃肠炎的主要食源性致病原,具有广泛的遗传多样性,其中GⅡ.17型是亚洲地区的优势流行株,危害最为严重.研究表明,通过基因工程技术制备的诺如病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)具有良好的免疫保护作用,是目前NoV疫苗研发的主要思路.[目的]利用大肠杆菌(Escherichia coli)原核表达系统制备GⅡl.17型诺如病毒的VLP,为GⅡ.17型NoV疫苗的研发奠定基础.[方法]合成GⅡ.17型NoV衣壳蛋白VP1的基
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