论文部分内容阅读
摘要： 以包头当地菊芋根际土为材料，筛选到10株产菊粉酶细菌，其中芽孢杆菌的产酶活性相对较高。对部分菌株的鉴定结果表明，产菊粉酶细菌分属于厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），它们分别是短杆菌（Brevibacterium sp ）（A1）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia） （A3）、多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa） （A6、A8）、杆菌属（Bacillus sp ）（A7）。目前关于短杆菌属、多黏类芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌具有产菊粉酶能力的报道较少见。
关键词： 菊粉酶；细菌；筛选；鉴定
中图分类号： Q939 9 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0360-03
菊粉酶（inulinase）是糖基水解酶 32 家族（glycosyl hydrolases family 32）的一员，又称β-2，1-D-果聚糖酶，它能特异地作用于β-2，1-D-果聚糖果糖苷键 [1-4]。根据其作用于底物的方式不同，又可分为内切菊粉酶（endoinulinase，EC 3 2 1 7） 和外切菊粉酶（exoinulinase，EC 3 2 1 80），目前该酶被广泛用于菊芋制备低聚果糖的工业生产，这主要是因为菊芋富含菊糖，而菊糖是由D-呋喃果糖分子经β-2，1糖苷键聚合而成的聚合度较高的直链多糖，在菊粉酶的作用下，它可以从内部和末端水解自身的β-2，1糖苷键，从而降解为低聚果糖 [5-8]。而微生物由于来源广泛，种类多，它已经成为菊粉酶筛选的良好来源，但是迄今为止，在工业上还是很缺乏具有高产酶活性的功能菌株。因此，如何筛选获得具有高产菊粉酶活性的目的菌株已经成为众多研究者的关注焦点 [9-15]。这其中又以产菊粉酶真菌的研究居多，而对于细菌的研究较少。因此，本研究以内蒙古包头当地菊芋种植的根际土壤为材料，定向筛选产菊粉酶细菌，以期为菊芋制备低聚果糖提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1 1 材料与试剂
菊芋根部土壤来源于包头市东河区沙尔沁镇。菊粉、琼脂、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨，购自上海蓝季科技发展有限公司。3，5-二硝基水杨酸，购自上海远帆助剂厂。冰醋酸、酒石酸钾钠、KCl、NaNO3、K2HPO4、（NH4）H2PO、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O，购自天津市风船化学试剂有限公司。上述药品均为分析纯。
DNS 试剂：取3，5-二硝基水杨酸3 15 g，加水500 mL，水浴至45 ℃，逐步加入100 mL 0 2 g/mL氢氧化钠，然后加入酒石酸钾钠91 g、苯酚2 5 g、无水亚硝酸钠 2 5 g，搅拌使之溶解，冷却后定容至1 000 mL，贮存于棕色瓶中，放置 1 周后使用。
醋酸缓冲液（0 1 mol/L，pH值4 6）：准确称取醋酸钠 0 803 6 g，加少量蒸馏水溶解，再加入冰醋酸 0 59 mL，调节pH 值至4 6，加蒸馏水定容至200 mL。
1 2 培养基配制
富集培养基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水 1 000 mL。初筛培养基：菊粉30 g，KCl 0 5 g，NaNO3 3 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，FeSO4 0 01 g，K2HPO4 1 g，蒸馏水 1 000 mL，琼脂15 g。复筛培养基（同发酵培养基）：菊粉20 g，蛋白胨10 g，（NH4）2HPO4 0 5 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，NaNO3 5 g，蒸馏水1000 mL，琼脂15 g（发酵培养基无）。 斜面保藏培养基：马铃薯 20 g，蔗糖（葡萄糖）20 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂15～20 g，pH值自然。
1 3 菌株筛选
富集培养：取菊芋根际土5 g，放入100 mL无菌水中，170 r/min振荡1 h得悬浮液，将1 mL摇匀的悬浮液加入含有50 mL富集培养液的三角瓶中，37 ℃下170 r/min 振荡培养48 h。
初筛：将经过富集培养的菌液用无菌水稀释为10 -1、10 -2、10 -3、10 -4等4个不同的浓度，分别吸取0 5 mL不同浓度土壤悬液于初筛培养基上，涂布均匀后，把培养皿倒置放入恒温培养箱中，28 ℃培养2～3 d，并观察菌种的生长情况，利用“透明圈法”对目的菌落进行分离纯化，最后对所得的菌株进行斜面培养保藏。
复筛：利用纯化与酶活性测定相结合的方法复筛产菊粉酶细菌，先将纯化的目的菌株接种于复筛培养基上，28 ℃恒温培养2～3 d；然后选取生长较快的菌株接入含有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、170 r/min恒温水浴摇床培养72 h；发酵液3 500 r/min离心15 min，得到的上清液即为粗酶液；最后用DNS法测定粗酶液酶活性，从中获得产酶活性较高的菌株。
1 4 酶活性的测定
1 4 1 果糖标准曲线的绘制 试验方案见表1，将各试管沸水浴7 min，显色后快速冷却，之后用蒸馏水定容至10 mL，充分混匀后在550 nm下测吸光度，以果糖浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制果糖标准曲线，结果如图1所示。
1 4 2 酶活性的测定 菊粉酶活性单位定义 [16]：反应体系中1 min转化底物产生 1 μmol 还原糖所需的酶量即为1个活性单位（U/mL）。酶活性测定参照文献[17]，略有改动。向0 5 mL粗酶液中加入2 5 mL 1%菊糖（醋酸缓冲液配制），37 ℃ 反应20 min，沸水灭活10 min，加入DNS 2 mL，沸水浴中7 min显色，快速冷却后加5 mL蒸馏水定容到10 mL，以去离子水为空白对照，用可见分光光度计测吸光度。设3次重复，取平均值。 1 4 3 酶活性的计算 按下面的公示来计算单位酶活性 [15]：酶活性=D·n·1 000/（k·t）。式中：n为稀释倍数；k为曲线斜率；t为反应时间（s）。
1 5 产菊粉酶细菌的16S rRNA分子鉴定和系统发育分析
利用菌落PCR技术扩增所得目的菌株的16S rRNA序列，引物选用27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）， 具体方法参考文献[18]。然后利用Blast程序寻找GenBank中与各目的序列同源性最高的序列作为参考，最后用ClustalX 1 81软件进行序列多重比对，利用MEGA 4软件以Neighbor-Joining法进行系统发育分析 （采样量1 000次），构建系统发育树 [18]。
2 结果与分析
2 1 产菊粉酶菌株产酶活性测定
由图2可见，10株产菊粉酶细菌的产酶活性随时间的延长呈规律性变化，除菌株A1、A4外，其他菌株的产酶活性都是第1天最高，此后呈下降趋势；而菌株A1、A4的产酶活性以第2天最高，此后开始下降。
酶活性的产菊粉酶细菌，并对其中部分菌株加以鉴定。测序结果表明，产菊粉酶细菌多为厚壁菌门，此外也包含放线菌门和变形菌门，且来自厚壁菌门和放线菌门的细菌可能具有较好的产菊粉酶活性，如彼尔姆短杆菌（A1）和芽孢杆菌（A7）要高于多黏类芽孢杆菌（A6、A8），而变形菌门的细菌产菊粉酶活性则较差。
张扬等曾筛选到一株巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），而且该菌的产酶活性在培养2天后达到最高 [4]，这与本研究中的菌株A4产酶性能一致，因此A4也可能是巨大芽孢杆菌。Pandey等发现产菊粉酶的细菌包括假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、黄杆菌属 （Staphylococcus）和埃希菌属（Escherichia）等许多类型 [19]，而本研究则发现，除上述细菌外，短杆菌属（Brevibacterium sp ）、多黏类芽孢杆菌（P polymyxa）和嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）也具有产菊粉酶能力，只不过这3类细菌产菊粉酶能力较弱。因此，本研究后续将关注利用紫外诱变、化学突变技术以及重离子诱变技术来获取高产菊粉酶活性菌。
参考文献：
[1] Pons T，Olmea O，Chinea G，et al Structural model for family 32 of glycosyl-hydrolase enzymes[J] Proteins，1998，33（3）：383-395
[2]宫 颖，于基成，刘 秋，等 微生物源菊粉酶的研究进展[J] 食品安全质量检测学报，2014，5（7）：2146-2150
[3]冯 珊，朱宏阳，黄声岚 菊粉酶及其应用研究进展[J] 海峡药学，2013，25（12）：8-10
[4]顾夕梅，陈晓佩，奚晓桐，等 菊粉酶及其制备低聚果糖研究进展[J] 广东化工，2014，41（7）：95-96
[5]Li Y，Liu G L，Chi Z M Ethanol production from inulin and unsterilized meal of Jerusalem artichoke tubers by Saccharomyces sp W0 expressing the endo-inulinase gene from Arthrobacter sp [J] Bioresource Technology，2013，147（21）： 254-259
[6]李 娟，曹泽虹，李 超，等 响应面法优化黑曲霉深层发酵产内切型菊粉酶工艺[J] 食品科学，2014，35（9）：207-212
[7]熊伍平，王成华，陆 雁，等 一个外切菊粉酶基因的克隆表达及酶学性质[J] 生物加工过程，2013，11（3）：40-45
[8]王 静，金征宇，江 波，等 Aspergillus ficuum内切菊粉酶的酶解条件优化及酶解动力学研究[J] 食品科学，2009，30（21）：161-165 [9]韩 睿 青海产菊粉酶菌株的筛选及分子鉴定[J] 农业科学与技术：英文版，2015，25（2）：224-227
[10] 张 瑞，朱启忠，张 扬 产菊粉酶芽孢杆菌发酵条件优化[J] 资源开发与市场，2013，29（7）：676-678
[11]赵 洁，朱启忠，耿 松，等 产菊粉酶菌株的筛选及发酵条件研究[J] 中国酿造，2012，31（9）：107-110
[12]黄玉玲，王桂峰，隆小华，等 产菊粉酶菌株的筛选及产酶条件优化[J] 食品工业科技，2012，33（21）：160-163
[13]张泽生，王 翠，张荣萍，等 产菊粉酶微生物的筛选及发酵工艺的研究[J] 现代食品科技，2010，26（5）：498-501，497
[14]罗登林，袁海丽，曾小宇，等 响应面法优化Aspergillus niger X-6发酵生产菊粉酶工艺的研究[J] 食品科学，2010，31（23）：138-141[15] 王 翠 产菊粉酶菌株的筛选及菊粉酶性质的研究[D] 天津：天津科技大学，2010：8-10
[16]王建华，刘艳艳，姚 斌，等 高产菊粉酶酵母筛选、发酵和酶学性质研究[J] 生物工程学报，2000，16（1）：60-64
[17]王 琳 产菊粉酶菌株的筛选及其酶学特性的研究[D] 南京：南京农业大学，2007：6-11
[18]宁洎英 两种常用农药对叶际微生物群落结构的影响及叶面农药残留的原位降解研究[D] 北京：中国科学院研究生院，2010：26-28
[19] Pandey A，Soccol C R，Selvakumar P，et al Recent developments in microbial inulinases Its production，properties，and industrial applications[J] Applied Biochemistry and Biotechnology，1999，81（1）： 35-52
关键词： 菊粉酶；细菌；筛选；鉴定
中图分类号： Q939 9 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0360-03
菊粉酶（inulinase）是糖基水解酶 32 家族（glycosyl hydrolases family 32）的一员，又称β-2，1-D-果聚糖酶，它能特异地作用于β-2，1-D-果聚糖果糖苷键 [1-4]。根据其作用于底物的方式不同，又可分为内切菊粉酶（endoinulinase，EC 3 2 1 7） 和外切菊粉酶（exoinulinase，EC 3 2 1 80），目前该酶被广泛用于菊芋制备低聚果糖的工业生产，这主要是因为菊芋富含菊糖，而菊糖是由D-呋喃果糖分子经β-2，1糖苷键聚合而成的聚合度较高的直链多糖，在菊粉酶的作用下，它可以从内部和末端水解自身的β-2，1糖苷键，从而降解为低聚果糖 [5-8]。而微生物由于来源广泛，种类多，它已经成为菊粉酶筛选的良好来源，但是迄今为止，在工业上还是很缺乏具有高产酶活性的功能菌株。因此，如何筛选获得具有高产菊粉酶活性的目的菌株已经成为众多研究者的关注焦点 [9-15]。这其中又以产菊粉酶真菌的研究居多，而对于细菌的研究较少。因此，本研究以内蒙古包头当地菊芋种植的根际土壤为材料，定向筛选产菊粉酶细菌，以期为菊芋制备低聚果糖提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1 1 材料与试剂
菊芋根部土壤来源于包头市东河区沙尔沁镇。菊粉、琼脂、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨，购自上海蓝季科技发展有限公司。3，5-二硝基水杨酸，购自上海远帆助剂厂。冰醋酸、酒石酸钾钠、KCl、NaNO3、K2HPO4、（NH4）H2PO、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O，购自天津市风船化学试剂有限公司。上述药品均为分析纯。
DNS 试剂：取3，5-二硝基水杨酸3 15 g，加水500 mL，水浴至45 ℃，逐步加入100 mL 0 2 g/mL氢氧化钠，然后加入酒石酸钾钠91 g、苯酚2 5 g、无水亚硝酸钠 2 5 g，搅拌使之溶解，冷却后定容至1 000 mL，贮存于棕色瓶中，放置 1 周后使用。
醋酸缓冲液（0 1 mol/L，pH值4 6）：准确称取醋酸钠 0 803 6 g，加少量蒸馏水溶解，再加入冰醋酸 0 59 mL，调节pH 值至4 6，加蒸馏水定容至200 mL。
1 2 培养基配制
富集培养基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水 1 000 mL。初筛培养基：菊粉30 g，KCl 0 5 g，NaNO3 3 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，FeSO4 0 01 g，K2HPO4 1 g，蒸馏水 1 000 mL，琼脂15 g。复筛培养基（同发酵培养基）：菊粉20 g，蛋白胨10 g，（NH4）2HPO4 0 5 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，NaNO3 5 g，蒸馏水1000 mL，琼脂15 g（发酵培养基无）。 斜面保藏培养基：马铃薯 20 g，蔗糖（葡萄糖）20 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂15～20 g，pH值自然。
1 3 菌株筛选
富集培养：取菊芋根际土5 g，放入100 mL无菌水中，170 r/min振荡1 h得悬浮液，将1 mL摇匀的悬浮液加入含有50 mL富集培养液的三角瓶中，37 ℃下170 r/min 振荡培养48 h。
初筛：将经过富集培养的菌液用无菌水稀释为10 -1、10 -2、10 -3、10 -4等4个不同的浓度，分别吸取0 5 mL不同浓度土壤悬液于初筛培养基上，涂布均匀后，把培养皿倒置放入恒温培养箱中，28 ℃培养2～3 d，并观察菌种的生长情况，利用“透明圈法”对目的菌落进行分离纯化，最后对所得的菌株进行斜面培养保藏。
复筛：利用纯化与酶活性测定相结合的方法复筛产菊粉酶细菌，先将纯化的目的菌株接种于复筛培养基上，28 ℃恒温培养2～3 d；然后选取生长较快的菌株接入含有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、170 r/min恒温水浴摇床培养72 h；发酵液3 500 r/min离心15 min，得到的上清液即为粗酶液；最后用DNS法测定粗酶液酶活性，从中获得产酶活性较高的菌株。
1 4 酶活性的测定
1 4 1 果糖标准曲线的绘制 试验方案见表1，将各试管沸水浴7 min，显色后快速冷却，之后用蒸馏水定容至10 mL，充分混匀后在550 nm下测吸光度，以果糖浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制果糖标准曲线，结果如图1所示。
1 4 2 酶活性的测定 菊粉酶活性单位定义 [16]：反应体系中1 min转化底物产生 1 μmol 还原糖所需的酶量即为1个活性单位（U/mL）。酶活性测定参照文献[17]，略有改动。向0 5 mL粗酶液中加入2 5 mL 1%菊糖（醋酸缓冲液配制），37 ℃ 反应20 min，沸水灭活10 min，加入DNS 2 mL，沸水浴中7 min显色，快速冷却后加5 mL蒸馏水定容到10 mL，以去离子水为空白对照，用可见分光光度计测吸光度。设3次重复，取平均值。 1 4 3 酶活性的计算 按下面的公示来计算单位酶活性 [15]：酶活性=D·n·1 000/（k·t）。式中：n为稀释倍数；k为曲线斜率；t为反应时间（s）。
1 5 产菊粉酶细菌的16S rRNA分子鉴定和系统发育分析
利用菌落PCR技术扩增所得目的菌株的16S rRNA序列，引物选用27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）， 具体方法参考文献[18]。然后利用Blast程序寻找GenBank中与各目的序列同源性最高的序列作为参考，最后用ClustalX 1 81软件进行序列多重比对，利用MEGA 4软件以Neighbor-Joining法进行系统发育分析 （采样量1 000次），构建系统发育树 [18]。
2 结果与分析
2 1 产菊粉酶菌株产酶活性测定
由图2可见，10株产菊粉酶细菌的产酶活性随时间的延长呈规律性变化，除菌株A1、A4外，其他菌株的产酶活性都是第1天最高，此后呈下降趋势；而菌株A1、A4的产酶活性以第2天最高，此后开始下降。
酶活性的产菊粉酶细菌，并对其中部分菌株加以鉴定。测序结果表明，产菊粉酶细菌多为厚壁菌门，此外也包含放线菌门和变形菌门，且来自厚壁菌门和放线菌门的细菌可能具有较好的产菊粉酶活性，如彼尔姆短杆菌（A1）和芽孢杆菌（A7）要高于多黏类芽孢杆菌（A6、A8），而变形菌门的细菌产菊粉酶活性则较差。
张扬等曾筛选到一株巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），而且该菌的产酶活性在培养2天后达到最高 [4]，这与本研究中的菌株A4产酶性能一致，因此A4也可能是巨大芽孢杆菌。Pandey等发现产菊粉酶的细菌包括假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、黄杆菌属 （Staphylococcus）和埃希菌属（Escherichia）等许多类型 [19]，而本研究则发现，除上述细菌外，短杆菌属（Brevibacterium sp ）、多黏类芽孢杆菌（P polymyxa）和嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）也具有产菊粉酶能力，只不过这3类细菌产菊粉酶能力较弱。因此，本研究后续将关注利用紫外诱变、化学突变技术以及重离子诱变技术来获取高产菊粉酶活性菌。
参考文献：
[1] Pons T，Olmea O，Chinea G，et al Structural model for family 32 of glycosyl-hydrolase enzymes[J] Proteins，1998，33（3）：383-395
[2]宫 颖，于基成，刘 秋，等 微生物源菊粉酶的研究进展[J] 食品安全质量检测学报，2014，5（7）：2146-2150
[3]冯 珊，朱宏阳，黄声岚 菊粉酶及其应用研究进展[J] 海峡药学，2013，25（12）：8-10
[4]顾夕梅，陈晓佩，奚晓桐，等 菊粉酶及其制备低聚果糖研究进展[J] 广东化工，2014，41（7）：95-96
[5]Li Y，Liu G L，Chi Z M Ethanol production from inulin and unsterilized meal of Jerusalem artichoke tubers by Saccharomyces sp W0 expressing the endo-inulinase gene from Arthrobacter sp [J] Bioresource Technology，2013，147（21）： 254-259
[6]李 娟，曹泽虹，李 超，等 响应面法优化黑曲霉深层发酵产内切型菊粉酶工艺[J] 食品科学，2014，35（9）：207-212
[7]熊伍平，王成华，陆 雁，等 一个外切菊粉酶基因的克隆表达及酶学性质[J] 生物加工过程，2013，11（3）：40-45
[8]王 静，金征宇，江 波，等 Aspergillus ficuum内切菊粉酶的酶解条件优化及酶解动力学研究[J] 食品科学，2009，30（21）：161-165 [9]韩 睿 青海产菊粉酶菌株的筛选及分子鉴定[J] 农业科学与技术：英文版，2015，25（2）：224-227
[10] 张 瑞，朱启忠，张 扬 产菊粉酶芽孢杆菌发酵条件优化[J] 资源开发与市场，2013，29（7）：676-678
[11]赵 洁，朱启忠，耿 松，等 产菊粉酶菌株的筛选及发酵条件研究[J] 中国酿造，2012，31（9）：107-110
[12]黄玉玲，王桂峰，隆小华，等 产菊粉酶菌株的筛选及产酶条件优化[J] 食品工业科技，2012，33（21）：160-163
[13]张泽生，王 翠，张荣萍，等 产菊粉酶微生物的筛选及发酵工艺的研究[J] 现代食品科技，2010，26（5）：498-501，497
[14]罗登林，袁海丽，曾小宇，等 响应面法优化Aspergillus niger X-6发酵生产菊粉酶工艺的研究[J] 食品科学，2010，31（23）：138-141[15] 王 翠 产菊粉酶菌株的筛选及菊粉酶性质的研究[D] 天津：天津科技大学，2010：8-10
[16]王建华，刘艳艳，姚 斌，等 高产菊粉酶酵母筛选、发酵和酶学性质研究[J] 生物工程学报，2000，16（1）：60-64
[17]王 琳 产菊粉酶菌株的筛选及其酶学特性的研究[D] 南京：南京农业大学，2007：6-11
[18]宁洎英 两种常用农药对叶际微生物群落结构的影响及叶面农药残留的原位降解研究[D] 北京：中国科学院研究生院，2010：26-28
[19] Pandey A，Soccol C R，Selvakumar P，et al Recent developments in microbial inulinases Its production，properties，and industrial applications[J] Applied Biochemistry and Biotechnology，1999，81（1）： 35-52