目的建立一种快速、准确测定血清中25-羟基维生素D₂、25-羟基维生素D3和3-epi-25-羟基维生素D3的同位素稀释-超快速液相色谱-串联质谱法。方法血清样品经甲醇-乙腈沉淀蛋白后,采用正己烷萃取,萃取液利用氮气吹扫浓缩并以初始流动相为溶剂进行定容,以含0.1%甲酸的水溶液（V/V）和含0.1%甲酸的甲醇溶液（V/V）为流动相,采用梯度洗脱方式在Phenomenex Kinetex F5色谱柱（2.1 mm×150 mm,1.7μm）上实现快速分离,采用多反应监测正离子模式检测,同位素内标法定量。结果差向异构体25-羟基维生素D₃和3-epi-25-羟基维生素D₃在6 min内可达基线分离,并可准确定量测定25-羟基维生素D₂、25-羟基维生素D₃和3-epi-25-羟基维生素D₃。3种目标物在0.5～50.0μg/L范围内均呈良好线性关系（相关系数r>0.9995）,方法检出限为0.15μg/L,定量限为0.5μg/L。在3个加标水平（1.0、10.0和30.0μg/L）下,回收率为84.3%～109.0%（n=11）,相对标准偏差（RSDs）为0.8%～6.8%。采用美国国家标准与技术研究院（NIST）的有证标准物（SRM 972a）的Level 1、Level 2、Level 3和Level 4进行方法验证,测定结果与标准参考值的相对偏差均小于5%。结论建立的方法具有简便、快速、灵敏和准确的特点,适用于血清中25-羟基维生素D₂、25-羟基维生素D₃和3-epi-25-羟基维生素D₃的同时测定。