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摘要[目的]测定黄颡鱼/桂花鱼中麻醉剂3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐（MS-222） 的残留量。[方法]采用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）技术，建立了一种优化的QuEChERS方法，快速测定黄颡鱼/桂花鱼中麻醉剂 MS-222的残留。[结果]该方法简单、快速、可靠，线性关系好，检出限低，灵敏度高。在最优的条件下，方法定量线性范围为1～200 ng/mL，方法回收率为77.8%～95.8%，精密度为3.4%～5.2%。[结论]该方法为黄颡鱼/桂花鱼中麻醉剂MS-222残留测定提供了参考依据。
关键词 HPLC-MS/MS；黄颡鱼/桂花鱼；MS-222；残留
中图分类号 S859.84 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）22-0154-03
Abstract[Objective]The research aimed to determine the residues of the anaesthetic tricaine mesilate （MS222） in Pelteobagrus fulvidraco/Mandarin fish.[Methods]The highperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） technology and an optimized QuEChERS method were established for the rapid determination of residues of MS222 in fish.[Results]This method was simple，fast，reliable，good linearity，low detection limit and high sensitivity.Under optimized conditions，the linear quantification range of the LCMS/MS method was 1-200 ng/mL.Average recovery rates were 77.8%-95.8%，RSD was 3.4%-5.2%.[Conclusion]This method could provide a reference for the determination of MS222 in fish.
Key words HPLCMS/MS；Pelteobagrus fulvidraco/Mandarin fish；MS222；Residues
黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）又称黄骨鱼、嘎鱼，为鲿科黄颡鱼属，是肉食性为主的杂食性小型经济鱼类；黄颡鱼营养丰富、肉质鲜嫩，具有良好的药理作用[1]。桂花鱼（Mandarin fish）又称季花鱼、鳜鱼，为鮨科鳜属，是肉食性为主的名优鱼类；桂花鱼肉性味甘、平，无毒，具有补虚劳、益脾胃的功效[2]。近年来，由于它们良好的药理功效，黄颡鱼/桂花鱼的养殖规模在不断的扩大。
鲜活水产品在运输过程中，由于应激反应过强会使其受到损伤甚至死亡。适当使用渔用麻醉剂能够使鲜活水产品保持安静，降低新陈代谢，从而减少损伤，提高成活率[3-4]。3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐（MS-222） 是目前广泛使用的水产品麻醉剂，是美国食品药物管理局批准可用于食用鱼的麻醉剂[5-7]。虽然这种药物对人类具有明显的安全性，但是在许多国家仍没有允许用作兽药[8]，这是因为如果水产品被宰杀之前使用了MS-222，其加工后的产品中可能存有残留，摄入人体后会在人体中蓄积，并造成一定的损害[9-10]。笔者采用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）技术，建立了一种优化的QuEChERS方法，快速测定水产品鱼体中 MS-222 的残留，并将开发的方法用于黄颡鱼/桂花鱼等实际样品中MS-222残留的快速分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。黄颡鱼/桂花鱼购自广东省深圳市布吉水产批发市场。
1.1.2 主要试剂。3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐标准品（购自Sigma-Aldrich公司，纯度>98%）；甲醇（色谱纯）；甲酸（色谱纯）；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 试验仪器。UltiMate3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）；串联质谱联用仪 API 5500 （美国SCIEX公司）；X3R高速冷冻离心机 （美国Thermo公司）；Milli-Q纯水仪（美国Millipore公司）；Multi Reax振荡器 （德国Heidolph公司）。
1.2 方法
1.2.1 对照品溶液的制备。精密称取10.0 mg的MS-222标准品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的对照品储备液，摇匀，即可。
1.2.2 样品前处理。准确称取2.00 g均匀的鱼肉样品于50 mL 离心管中，加入10 mL乙腈+甲醇+水（50∶25∶25，V/V/V），旋涡振荡15 min，5 000 r/min离心10 min，离心后吸取1 mL上層清液于自制的固相萃取柱（填料含有50 mg PSA，20 mg C18，100 mg 无水MgSO4），并通过0.22 μm有机滤膜过滤，上机测试。
1.2.3 色谱条件。色谱柱为Acquity BEH C18柱（50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm）；进样量为1.0 μL，流速为0.3 mL/min。柱温为35 ℃。流动相为甲醇（A）与0.1%甲酸水（B），采用梯度洗脱（表1）。
1.2.4 质谱条件。电喷雾离子源（ESI+）；质谱扫描方式为多反应监测（MRM）；电喷雾电压5.5 kV； 离子源温度150 ℃，雾化温度550 ℃，碰撞气为高纯氩气； 碰撞气流速9.00 mL/min。MS-222检测离子对、锥孔电压、碰撞能量见表2。 1.2.5 标准曲线绘制。精密量取对照品储备液相应量，然后用甲醇逐级稀释成为10、20、50、100、200 ng/mL的标准系列工作溶液，按照“1.2.3”色谱、“1.2.4”质谱条件测定，分别进样2 μL，记录测定峰面积，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.6 检测限和定量限的考察。将MS-222对照品逐步稀释后进样测定，以色谱图中信噪比（S/N）为3时的进样量为最低检测限（LOD），信噪比（S/N）为10时的进样量为最低定量限（LOQ）。
1.2.7 精密度试验。取按“1.2.1”方法制备的对照品溶液重复进样6次，计算峰面积的RSD值。
1.2.8 加样回收试验。取同一样品6份，精密加入分别与样品中MS-222含量相等的对照品，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”色谱、“1.2.4”质谱条件测定，进样量为2 μL，测定峰面积，计算平均回收率。
1.2.9 实际样品中MS-222的含量测定。随机从水产批发市场买来黄颡鱼、桂花鱼，按照“1.2.2”方法进行处理后，采用“1.2.3”“1.2.4”中HPLC-MS/MS 法进行MS-222 的含量测定，通过标准曲线计算实际中MS-222的含量。
2 结果与分析
2.1 线性关系及检出限 利用空白基质中加入MS-222标准溶液，按照“1.2.2”步骤进行前处理，取上清液上机测试并绘制标准曲线（图1），依据信噪比（S/N）>3得出检出限为1 μg/kg，信噪比（S/N）>10得出定量限为2.5 μg/kg。其线性方程和相关系数为y=7.69×104x （r=0.999 7）。
2.2 有機萃取溶剂的选择对回收率的影响 MS-222属于极性化合物，因此有机萃取溶剂选择极性较强的。在鱼样品中分别添加5、10、50 ng/mL 3个浓度水平的MS-222，分别采用乙腈、甲醇、50%乙腈、50%甲醇、乙腈+甲醇+水（50∶25∶25，V/V/V）作为萃取溶剂提取样品中的MS-222，每个添加浓度做2个平行，计算MS-222的平均回收率。由表3可知，鱼样品由乙腈+甲醇+水（50∶25∶25，V/V/V）提取时回收率最高，提取效果最好。
2.3 净化条件对回收率的影响 PSA和C18是QuEChERS方法中净化过程中最常用的吸附剂。PSA可以除去有机酸、脂肪酸和一些糖类等，而C18则可以吸收弱极性物质。为了获得最佳净化条件，该试验研究了不同的PSA、C18组合及配比，如表4所示。由表4可知，MS-222利用50 mg PSA+20 mg C18+100 mg MgSO4作为净化条件时回收率最高，净化效果最好。
2.4 洗脱溶液的选择 选用乙酸铵缓冲液和甲酸等水相溶液为流动相，有机相选择甲醇及乙腈来试验比较，采用梯度洗脱优化10.0 ng/mL的标准溶液。经过试验比较后，0.1%甲酸水溶液与甲醇的梯度所得灵敏度高、峰形相对较好，基线低，信噪比等都达到要求。如图2所示，目标峰在2.5 min出峰，分离良好，峰形尖锐且对称。
2.5 振荡时间对回收率的影响 在鱼样品中分别添加5.0、10.0、50.0 ng/mL 3个浓度水平的MS-222，分别振荡5、15、30、60 min提取样品中的MS-222，每个添加浓度做2个平行，计算MS-222的平均回收率。由表5可知，鱼样品振荡时间越长，回收率越高，但在振荡15 min后回收率增加不大。考虑到在实际检测过程中的检测效率问题及回收率，试验前处理振荡时间建议15 min较为适宜。
2.6 方法的精密度和回收率 由MS-222的精密度和检出限结果（表6）可知，通过空白鱼样中加入标准溶液，测试其回收率均为77.8%～95.8%，说明此前处理方法回收率良好；精密度为3.4%～5.2%，说明此前处理方法精密度良好。结合二者数据可以看出，此方法能很好地应用于鱼样中MS-222的检测。
2.7 黄颡鱼/桂花鱼实际样品分析 随机从水产批发市场买来黄颡鱼、桂花鱼进行处理后，采用HPLC-MS/MS法进行MS-222的测定，同时进行了加标回收试验，结果见表7。从表7可以看出，这2种水产品加标回收率差别不大。此外，黄颡鱼和桂花鱼都检测出MS-222，黄颡鱼为1.278 μg/kg，桂花鱼为1.769 μg/kg。这可能是由于水产品在上市前未充分进行MS-222的代谢。
3 结论
该试验研究了基于高效液相色谱串联质谱法测定黄颡鱼/桂花鱼中麻醉剂MS-222的方法，经过加标回收等试验证明，优化的QuEChERS前处理过程简便快捷、容易操作，方法灵敏度高，重现性好，能准确的定性和定量，满足水产品中MS-222的检测要求。该方法不仅可以为评估环境对鱼的活力及健康养殖、影响提供依据，同时也可以在该药物销售及使用过程中监控其休药期情况。
参考文献
[1]邵韦涵，樊启学，张诚明，等.黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及“黄优1号”肌肉营养成分比较[J].华中农业大学学报，2018，37（2）：76-82.
[2]钟小庆，麦良彬，何志超.桂花鱼实用养殖技术[J].当代水产，2012，37（8）：64-65.
[3]朱敏，孙伟红，邢丽红，等.液相色谱-串联质谱法测定水产品中麻醉剂MS-222残留[J].分析试验室，2012，31（6）：59-62.
[4]苏明明，孙兴权，杨春光，等.渔用麻醉剂MS-222、丁香酚在鲜活水产品运输中的应用及检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015，6（1）：25-29.
[5]SINK T D，STRANGE R J，SAWYER R E.Clove oil used at lower concentrations is less effective than MS222 at reducing cortisol stresss responsesin anestheticzed rainbow trout[J].N Am J Fish Manage，2007，27（1）：156-161.
[6]张丽，汪之和.MS-222对大黄鱼成鱼麻醉效果的研究[J].湖南农业科学，2010（18）：38-40.
[7]黎智广，杨宏亮，王旭峰，等.高效液相色谱-串联质谱测定水产品中MS-222残留[J].中国渔业质量与标准，2016，6（1）：53-57.
[8]李晓芹，朱振华，翟纹静，等.渔用麻醉剂使用现状和检测技术研究进展[J].安徽农业科学，2017，45（29）：72-73，170.
[9]VERA L M，MONTOYA A，SNCHEZVZQUEZ F J.Effectiveness of the anaesthetic MS222 in gilthead seabream，Sparus aurata：Effect of feeding time and daynight variations in plasma MS222 concentration and GST activity[J].Physiology & behavior，2013，110/111：51-57.
[10]SCHERPENISSE P，BERGWERFF A A.Determination of residues of tricaine in fish using liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Anal chimica acta，2007，586（1/2）：407-410.
关键词 HPLC-MS/MS；黄颡鱼/桂花鱼；MS-222；残留
中图分类号 S859.84 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）22-0154-03
Abstract[Objective]The research aimed to determine the residues of the anaesthetic tricaine mesilate （MS222） in Pelteobagrus fulvidraco/Mandarin fish.[Methods]The highperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） technology and an optimized QuEChERS method were established for the rapid determination of residues of MS222 in fish.[Results]This method was simple，fast，reliable，good linearity，low detection limit and high sensitivity.Under optimized conditions，the linear quantification range of the LCMS/MS method was 1-200 ng/mL.Average recovery rates were 77.8%-95.8%，RSD was 3.4%-5.2%.[Conclusion]This method could provide a reference for the determination of MS222 in fish.
Key words HPLCMS/MS；Pelteobagrus fulvidraco/Mandarin fish；MS222；Residues
黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）又称黄骨鱼、嘎鱼，为鲿科黄颡鱼属，是肉食性为主的杂食性小型经济鱼类；黄颡鱼营养丰富、肉质鲜嫩，具有良好的药理作用[1]。桂花鱼（Mandarin fish）又称季花鱼、鳜鱼，为鮨科鳜属，是肉食性为主的名优鱼类；桂花鱼肉性味甘、平，无毒，具有补虚劳、益脾胃的功效[2]。近年来，由于它们良好的药理功效，黄颡鱼/桂花鱼的养殖规模在不断的扩大。
鲜活水产品在运输过程中，由于应激反应过强会使其受到损伤甚至死亡。适当使用渔用麻醉剂能够使鲜活水产品保持安静，降低新陈代谢，从而减少损伤，提高成活率[3-4]。3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐（MS-222） 是目前广泛使用的水产品麻醉剂，是美国食品药物管理局批准可用于食用鱼的麻醉剂[5-7]。虽然这种药物对人类具有明显的安全性，但是在许多国家仍没有允许用作兽药[8]，这是因为如果水产品被宰杀之前使用了MS-222，其加工后的产品中可能存有残留，摄入人体后会在人体中蓄积，并造成一定的损害[9-10]。笔者采用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）技术，建立了一种优化的QuEChERS方法，快速测定水产品鱼体中 MS-222 的残留，并将开发的方法用于黄颡鱼/桂花鱼等实际样品中MS-222残留的快速分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。黄颡鱼/桂花鱼购自广东省深圳市布吉水产批发市场。
1.1.2 主要试剂。3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐标准品（购自Sigma-Aldrich公司，纯度>98%）；甲醇（色谱纯）；甲酸（色谱纯）；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 试验仪器。UltiMate3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）；串联质谱联用仪 API 5500 （美国SCIEX公司）；X3R高速冷冻离心机 （美国Thermo公司）；Milli-Q纯水仪（美国Millipore公司）；Multi Reax振荡器 （德国Heidolph公司）。
1.2 方法
1.2.1 对照品溶液的制备。精密称取10.0 mg的MS-222标准品，用甲醇配制成1.0 mg/mL的对照品储备液，摇匀，即可。
1.2.2 样品前处理。准确称取2.00 g均匀的鱼肉样品于50 mL 离心管中，加入10 mL乙腈+甲醇+水（50∶25∶25，V/V/V），旋涡振荡15 min，5 000 r/min离心10 min，离心后吸取1 mL上層清液于自制的固相萃取柱（填料含有50 mg PSA，20 mg C18，100 mg 无水MgSO4），并通过0.22 μm有机滤膜过滤，上机测试。
1.2.3 色谱条件。色谱柱为Acquity BEH C18柱（50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm）；进样量为1.0 μL，流速为0.3 mL/min。柱温为35 ℃。流动相为甲醇（A）与0.1%甲酸水（B），采用梯度洗脱（表1）。
1.2.4 质谱条件。电喷雾离子源（ESI+）；质谱扫描方式为多反应监测（MRM）；电喷雾电压5.5 kV； 离子源温度150 ℃，雾化温度550 ℃，碰撞气为高纯氩气； 碰撞气流速9.00 mL/min。MS-222检测离子对、锥孔电压、碰撞能量见表2。 1.2.5 标准曲线绘制。精密量取对照品储备液相应量，然后用甲醇逐级稀释成为10、20、50、100、200 ng/mL的标准系列工作溶液，按照“1.2.3”色谱、“1.2.4”质谱条件测定，分别进样2 μL，记录测定峰面积，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.6 检测限和定量限的考察。将MS-222对照品逐步稀释后进样测定，以色谱图中信噪比（S/N）为3时的进样量为最低检测限（LOD），信噪比（S/N）为10时的进样量为最低定量限（LOQ）。
1.2.7 精密度试验。取按“1.2.1”方法制备的对照品溶液重复进样6次，计算峰面积的RSD值。
1.2.8 加样回收试验。取同一样品6份，精密加入分别与样品中MS-222含量相等的对照品，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”色谱、“1.2.4”质谱条件测定，进样量为2 μL，测定峰面积，计算平均回收率。
1.2.9 实际样品中MS-222的含量测定。随机从水产批发市场买来黄颡鱼、桂花鱼，按照“1.2.2”方法进行处理后，采用“1.2.3”“1.2.4”中HPLC-MS/MS 法进行MS-222 的含量测定，通过标准曲线计算实际中MS-222的含量。
2 结果与分析
2.1 线性关系及检出限 利用空白基质中加入MS-222标准溶液，按照“1.2.2”步骤进行前处理，取上清液上机测试并绘制标准曲线（图1），依据信噪比（S/N）>3得出检出限为1 μg/kg，信噪比（S/N）>10得出定量限为2.5 μg/kg。其线性方程和相关系数为y=7.69×104x （r=0.999 7）。
2.2 有機萃取溶剂的选择对回收率的影响 MS-222属于极性化合物，因此有机萃取溶剂选择极性较强的。在鱼样品中分别添加5、10、50 ng/mL 3个浓度水平的MS-222，分别采用乙腈、甲醇、50%乙腈、50%甲醇、乙腈+甲醇+水（50∶25∶25，V/V/V）作为萃取溶剂提取样品中的MS-222，每个添加浓度做2个平行，计算MS-222的平均回收率。由表3可知，鱼样品由乙腈+甲醇+水（50∶25∶25，V/V/V）提取时回收率最高，提取效果最好。
2.3 净化条件对回收率的影响 PSA和C18是QuEChERS方法中净化过程中最常用的吸附剂。PSA可以除去有机酸、脂肪酸和一些糖类等，而C18则可以吸收弱极性物质。为了获得最佳净化条件，该试验研究了不同的PSA、C18组合及配比，如表4所示。由表4可知，MS-222利用50 mg PSA+20 mg C18+100 mg MgSO4作为净化条件时回收率最高，净化效果最好。
2.4 洗脱溶液的选择 选用乙酸铵缓冲液和甲酸等水相溶液为流动相，有机相选择甲醇及乙腈来试验比较，采用梯度洗脱优化10.0 ng/mL的标准溶液。经过试验比较后，0.1%甲酸水溶液与甲醇的梯度所得灵敏度高、峰形相对较好，基线低，信噪比等都达到要求。如图2所示，目标峰在2.5 min出峰，分离良好，峰形尖锐且对称。
2.5 振荡时间对回收率的影响 在鱼样品中分别添加5.0、10.0、50.0 ng/mL 3个浓度水平的MS-222，分别振荡5、15、30、60 min提取样品中的MS-222，每个添加浓度做2个平行，计算MS-222的平均回收率。由表5可知，鱼样品振荡时间越长，回收率越高，但在振荡15 min后回收率增加不大。考虑到在实际检测过程中的检测效率问题及回收率，试验前处理振荡时间建议15 min较为适宜。
2.6 方法的精密度和回收率 由MS-222的精密度和检出限结果（表6）可知，通过空白鱼样中加入标准溶液，测试其回收率均为77.8%～95.8%，说明此前处理方法回收率良好；精密度为3.4%～5.2%，说明此前处理方法精密度良好。结合二者数据可以看出，此方法能很好地应用于鱼样中MS-222的检测。
2.7 黄颡鱼/桂花鱼实际样品分析 随机从水产批发市场买来黄颡鱼、桂花鱼进行处理后，采用HPLC-MS/MS法进行MS-222的测定，同时进行了加标回收试验，结果见表7。从表7可以看出，这2种水产品加标回收率差别不大。此外，黄颡鱼和桂花鱼都检测出MS-222，黄颡鱼为1.278 μg/kg，桂花鱼为1.769 μg/kg。这可能是由于水产品在上市前未充分进行MS-222的代谢。
3 结论
该试验研究了基于高效液相色谱串联质谱法测定黄颡鱼/桂花鱼中麻醉剂MS-222的方法，经过加标回收等试验证明，优化的QuEChERS前处理过程简便快捷、容易操作，方法灵敏度高，重现性好，能准确的定性和定量，满足水产品中MS-222的检测要求。该方法不仅可以为评估环境对鱼的活力及健康养殖、影响提供依据，同时也可以在该药物销售及使用过程中监控其休药期情况。
参考文献
[1]邵韦涵，樊启学，张诚明，等.黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及“黄优1号”肌肉营养成分比较[J].华中农业大学学报，2018，37（2）：76-82.
[2]钟小庆，麦良彬，何志超.桂花鱼实用养殖技术[J].当代水产，2012，37（8）：64-65.
[3]朱敏，孙伟红，邢丽红，等.液相色谱-串联质谱法测定水产品中麻醉剂MS-222残留[J].分析试验室，2012，31（6）：59-62.
[4]苏明明，孙兴权，杨春光，等.渔用麻醉剂MS-222、丁香酚在鲜活水产品运输中的应用及检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015，6（1）：25-29.
[5]SINK T D，STRANGE R J，SAWYER R E.Clove oil used at lower concentrations is less effective than MS222 at reducing cortisol stresss responsesin anestheticzed rainbow trout[J].N Am J Fish Manage，2007，27（1）：156-161.
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[7]黎智广，杨宏亮，王旭峰，等.高效液相色谱-串联质谱测定水产品中MS-222残留[J].中国渔业质量与标准，2016，6（1）：53-57.
[8]李晓芹，朱振华，翟纹静，等.渔用麻醉剂使用现状和检测技术研究进展[J].安徽农业科学，2017，45（29）：72-73，170.
[9]VERA L M，MONTOYA A，SNCHEZVZQUEZ F J.Effectiveness of the anaesthetic MS222 in gilthead seabream，Sparus aurata：Effect of feeding time and daynight variations in plasma MS222 concentration and GST activity[J].Physiology & behavior，2013，110/111：51-57.
[10]SCHERPENISSE P，BERGWERFF A A.Determination of residues of tricaine in fish using liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Anal chimica acta，2007，586（1/2）：407-410.