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摘 要：目的： 探讨自身抗体检测在自身免疫性肝病 （AILD）诊断的临床意义。方法： 选择102例病人，其中自身免疫性肝炎（AIH）17例，原发性胆汁性肝硬化（PBC）80例，原发性硬化性胆管炎（PSC）5例，不明原因肝损伤40例。采用间接免疫荧光法和免疫印迹法分别检测抗核抗体（ANA）、抗线粒体抗体（AMA）、抗平滑肌抗体（SMA）、抗线粒体Ⅱ型抗体（AMA-M2）、抗肝肾微粒体抗体Ⅰ型（LKM-1）、抗可溶性肝抗原 （SLA）、抗可溶性酸性核蛋白抗体（Sp100）和抗肝胞浆I型抗体（LC-1）等。结果： ANA在AIH、PBC、PSC、肝损伤及正常对照组中的阳性率分别是： 76.4%、95.0%、40.0%、10.0%、0%， AMA在AIH、PBC、PSC、肝损伤中的阳性率分别是5.9%、100.0%、0%、0%，与正常对照组之间阳性率差别有统计学意义（P<0.05）。AIH组的LKM-1、SLA和LC-1抗体阳性检出率分别为23.5%、5.9%和17.6%，PBC组AMA-M2、SLA、SP100抗体阳性的检出率为90.0%、2.5%和23.8%，与肝损伤组比较差别有统计学意义（P<0.05）。肝损伤组2例LKM-2抗体阳性，阳性率为5%，PSC组和正常对照组未检出阳性。结论：自身免疫性肝病相关自身抗体的联合检测对此病的诊断和治疗有重要临床价值。
关键词： 自身免疫性肝病 ； 抗核抗体 ；抗平滑肌抗体 ； 抗线粒体抗体
自身免疫性肝病（autoimmune liver diseases，AILD）是一类自身免疫反应，以肝脏为特异性免疫病理损伤的疾病，主要包括三类 ： 自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis， AIH），原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis， PBC），原发性硬化性胆管炎（primary- sclerosing cholagitis， PSC） [1]。此病无特征性病症，缺乏明确的诊断标准。血清中通常伴有自身特异性抗体或非特异性自身抗体表达，这些自身抗体的致病机制并不完全明确，但对疾病的诊断具有非常重要的意义。近几年肝病相关自身抗体检测已逐步成为自身免疫性肝病实验室诊断的常用指标[2]。本文选择102例自身免疫性肝病患者并对其自身抗体进行检测，探讨自身抗体检测对自身免疫性肝病诊断的临床意义。
1 材料与方法
者17例、原发性胆汁性肝硬化 （PBC）患者80例，不明原因肝损伤组（长期肝功能异常，肝炎病毒感染指标为阴性，排除SLE、RA等自身免疫性疾病史）40例，男19例，女21例，年龄24～69岁。正常对照组（随机选健康体检人员）40例。所有入选者均签署知情同意书。
1.2 诊断依据 按 2010 年美国肝病学会（AASLD）对自身免疫性肝病的诊断和治疗指南进行诊断[3]。按 2008 年中华人民共和国卫生行业标准（WS）之传染病诊断标准对病毒性肝炎进行诊断[4]。
1.3血清样品 采集各组患者空腹全血3 ml于试管中，放入37℃水浴箱中30 min，以3000 r/min离心10 min，分离血清，将血清分装于0.5 ml离心管中，-20℃保存。
1.4 检测方法
1.4.1 间接免疫荧光法检测 抗核抗体（AntinuclearAntibod-ies ANA），抗线粒体抗体（Anti -mitochrndral Antibodies，AMA），抗平滑肌抗体（SmoothMuscle Antibodies， SMA）。由德国IMTEC公司提供间接免疫荧光试剂，分别以HEP-2/猴肝、鼠肾、鼠胃为抗原基质，按试剂盒要求操作。待测血清用PBS缓冲液稀释，取25μL稀释后的血清滴在抗原基质片上，室温孵育30 min， 冲洗，滴加异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗体室温避光孵育30 min，冲洗，封片镜检。荧光显微镜观察细胞或组织内出现特异性荧光判为阳性。
1.4.2免疫印迹法检测
自身抗体包括：抗线粒体Ⅱ型抗体（AMA-M2）、抗肝肾微粒体抗体Ⅰ型（LKM-1）、抗可溶性肝抗原 （SLA）、抗可溶性酸性核蛋白抗体（Sp100）和抗肝胞浆I型抗体（LC-1） 由德国IMTEC公司提供。取1.5 ml已稀释血清与膜条反应，震荡温育30 min。洗膜后加入l稀释的酶结合物，震荡温育30 min。洗膜后加入底物，室温摇床上温育10 min， NBT/BCIP显色。蒸馏水洗膜终止反应。用试剂公司提供的阳性条带位置标准图判定膜条上阳性结果。
1.5统计学处理 统计学软件包SPSS 13.0对数据进行分析，数据比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 间接免疫荧光法检测自身抗体阳性检测情况
ANA在AIH、PBC、PSC、肝损伤及正常对照组中的阳性率分别是： 76.4%、95.0%、40.0%、10.0%、0%。经χ2检验，与正常对照组之间阳性率差别有统计学意义（P<0.05）；AMA在AIH、PBC、PSC、肝损伤中的阳性率分别是5.9%、100.0%、0%、0%，与正常对照组之间阳性率差别有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 免疫印记法检测肝抗原自身抗体的检出情况
AIH组的LKM-1、SLA和LC-1抗体阳性检出率分别为23.5%、5.9%和17.6%，与肝损伤组LKM-1、SLA和LC-1抗体阳性的检出率比较，有显著性差异（P<0.05）。PBC组AMA-M2、SLA、SP100抗体阳性的检出率为90.0%、2.5%和23.8%，与肝损伤组AMA-M2、SLA、SP100抗体阳性的检出率比较，有著性差异（P<0.05）。肝损伤组2例LKM-2抗体阳性，阳性率为5%，PSC组和正常对照组未检出阳性，见表2。 3.讨论
自身抗体是不同原因导致机体B细胞产生针对自身器官、组织和细胞成分的抗体，进而诱发生理和病理的改变。我国慢性肝炎患者以病毒性肝炎为主[5]，自身免疫性肝病的发病率呈上升趋势。所以，自身免疫性肝病的发病机制和诊断受到越来越多的关注，自身抗体的检测在肝病诊断中占有越来越重要位置。
近年来AIH是新确定的疾病之一，在发达国家占全部慢性肝炎的20%左右[6]。AIH好发于儿童及各年龄段的成年人，女性较多见[6]，根据自身抗体的不同将AIH分三种类型：Ⅰ型主要以ANA和（或）SMA阳性为主；Ⅱ型是以抗LKM-1抗体和抗LC-1抗体阳性为主；Ⅲ型抗SLA/LP抗体阳性为特征[7]。AIH患者中Ⅰ型多见，在本研究中， 17例的AIH患者，其中13例患者出现ANA和3例SMA抗体与Ⅰ型AIH的诊断符合。2例抗LKM-1抗体阳性和抗3例LC-1抗体阳性属于Ⅱ型。AIH中ANA、LKM-1和LC-1检测出阳性，其阳性率为76.4%、23.5%和17.6%未见于其他肝脏疾病，是可能有价值的AIH诊断标志[8]。
AMA检测成为诊断PBC的重要检测项目。AMA在PBC临床、生化和组织学表现异常之前就可能出现。因为PBC患者主要标志AMA-M2为线粒体M2的抗原成分，本检测中AMA 、AMA-M2和水平SP100阳性率达100%、90.0%和23.8%，显著高于非PBC组。故M2亚型对PBC具有更高的特异性和诊断价值[9]。
PSC以胆管损伤为主的慢性胆汁淤积性疾病，多见于中青年男性[10]。本研究的5例PSC患者ANA阳性检测率40%，其余指标都是阴性。本文结果提示，PSC的免疫学指标不敏感和特异，主要依靠经内镜逆行胰胆管造影来做出正确诊断。
总而言之，自身免疫性肝病患者联合检测血清ANA、SMA、AMA、抗LKM-1、抗LC-1、抗SLA等自身抗体， 对自身免疫性肝病的临床诊断、鉴别诊断和治疗有着十分重要作用。
参考文献：
[1] 谭立明，王园园，李 华，等.161例自身免疫性肝病患者相关自身抗体检测的临床研究[J].免疫学杂志，2012，28（12）：1061-1064.
[2] 杜丽国. 2011 年 1-10 月肝病患者自身免疫性抗体检测结果分析[J]. 中国临床研究， 2012， 25（4）： 392-393.
[3] Manns MP，Czaja AJ，Gorham JD，et al.Diagnosis and management of autoimmune hepatitis[J].Hepatology，20l0，5l（6）：2193-2213.
[4]中华人民共和国卫生部. WS299-2008 传染病诊断标准[S].北京： 中国标准出版社， 2008： 298-301.
[5]王绮夏，马雄.自身免疫性肝病自身抗体研究进展[J].肝脏，2008，13（6）：507-510.
[6]李 晞， 李永哲. 原发性胆汁性肝硬化自身抗体谱研究新进展[J]. 中国实验诊断， 2011， 15（5）： 945-948.
[7]闫惠平. 自身免疫性肝病的自身抗体检测及报告规范[J].临床肝胆病杂志， 2011， 27（6）： 595-597.
[8]张利方， 郑山根， 周 萍. 自身免疫性肝病患者自身抗体检测及临床意义[J]. 免疫学杂志， 2009， 25（2）： 202-204.
[9]金 燕，刘文恩，郭婧婧.自身免疫性肝病相关抗体检测及其临床意义分析[J].中华检验医学杂志，2005，28（7）：742-744.
[10]张利方，李方，石莉萍，等. 自身免疫性肝炎和乙型肝炎患者自身抗体检测及对比分析[J]. 微循环学杂志，2010，20（5）： 40-41，46.
关键词： 自身免疫性肝病 ； 抗核抗体 ；抗平滑肌抗体 ； 抗线粒体抗体
自身免疫性肝病（autoimmune liver diseases，AILD）是一类自身免疫反应，以肝脏为特异性免疫病理损伤的疾病，主要包括三类 ： 自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis， AIH），原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis， PBC），原发性硬化性胆管炎（primary- sclerosing cholagitis， PSC） [1]。此病无特征性病症，缺乏明确的诊断标准。血清中通常伴有自身特异性抗体或非特异性自身抗体表达，这些自身抗体的致病机制并不完全明确，但对疾病的诊断具有非常重要的意义。近几年肝病相关自身抗体检测已逐步成为自身免疫性肝病实验室诊断的常用指标[2]。本文选择102例自身免疫性肝病患者并对其自身抗体进行检测，探讨自身抗体检测对自身免疫性肝病诊断的临床意义。
1 材料与方法
者17例、原发性胆汁性肝硬化 （PBC）患者80例，不明原因肝损伤组（长期肝功能异常，肝炎病毒感染指标为阴性，排除SLE、RA等自身免疫性疾病史）40例，男19例，女21例，年龄24～69岁。正常对照组（随机选健康体检人员）40例。所有入选者均签署知情同意书。
1.2 诊断依据 按 2010 年美国肝病学会（AASLD）对自身免疫性肝病的诊断和治疗指南进行诊断[3]。按 2008 年中华人民共和国卫生行业标准（WS）之传染病诊断标准对病毒性肝炎进行诊断[4]。
1.3血清样品 采集各组患者空腹全血3 ml于试管中，放入37℃水浴箱中30 min，以3000 r/min离心10 min，分离血清，将血清分装于0.5 ml离心管中，-20℃保存。
1.4 检测方法
1.4.1 间接免疫荧光法检测 抗核抗体（AntinuclearAntibod-ies ANA），抗线粒体抗体（Anti -mitochrndral Antibodies，AMA），抗平滑肌抗体（SmoothMuscle Antibodies， SMA）。由德国IMTEC公司提供间接免疫荧光试剂，分别以HEP-2/猴肝、鼠肾、鼠胃为抗原基质，按试剂盒要求操作。待测血清用PBS缓冲液稀释，取25μL稀释后的血清滴在抗原基质片上，室温孵育30 min， 冲洗，滴加异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗体室温避光孵育30 min，冲洗，封片镜检。荧光显微镜观察细胞或组织内出现特异性荧光判为阳性。
1.4.2免疫印迹法检测
自身抗体包括：抗线粒体Ⅱ型抗体（AMA-M2）、抗肝肾微粒体抗体Ⅰ型（LKM-1）、抗可溶性肝抗原 （SLA）、抗可溶性酸性核蛋白抗体（Sp100）和抗肝胞浆I型抗体（LC-1） 由德国IMTEC公司提供。取1.5 ml已稀释血清与膜条反应，震荡温育30 min。洗膜后加入l稀释的酶结合物，震荡温育30 min。洗膜后加入底物，室温摇床上温育10 min， NBT/BCIP显色。蒸馏水洗膜终止反应。用试剂公司提供的阳性条带位置标准图判定膜条上阳性结果。
1.5统计学处理 统计学软件包SPSS 13.0对数据进行分析，数据比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 间接免疫荧光法检测自身抗体阳性检测情况
ANA在AIH、PBC、PSC、肝损伤及正常对照组中的阳性率分别是： 76.4%、95.0%、40.0%、10.0%、0%。经χ2检验，与正常对照组之间阳性率差别有统计学意义（P<0.05）；AMA在AIH、PBC、PSC、肝损伤中的阳性率分别是5.9%、100.0%、0%、0%，与正常对照组之间阳性率差别有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 免疫印记法检测肝抗原自身抗体的检出情况
AIH组的LKM-1、SLA和LC-1抗体阳性检出率分别为23.5%、5.9%和17.6%，与肝损伤组LKM-1、SLA和LC-1抗体阳性的检出率比较，有显著性差异（P<0.05）。PBC组AMA-M2、SLA、SP100抗体阳性的检出率为90.0%、2.5%和23.8%，与肝损伤组AMA-M2、SLA、SP100抗体阳性的检出率比较，有著性差异（P<0.05）。肝损伤组2例LKM-2抗体阳性，阳性率为5%，PSC组和正常对照组未检出阳性，见表2。 3.讨论
自身抗体是不同原因导致机体B细胞产生针对自身器官、组织和细胞成分的抗体，进而诱发生理和病理的改变。我国慢性肝炎患者以病毒性肝炎为主[5]，自身免疫性肝病的发病率呈上升趋势。所以，自身免疫性肝病的发病机制和诊断受到越来越多的关注，自身抗体的检测在肝病诊断中占有越来越重要位置。
近年来AIH是新确定的疾病之一，在发达国家占全部慢性肝炎的20%左右[6]。AIH好发于儿童及各年龄段的成年人，女性较多见[6]，根据自身抗体的不同将AIH分三种类型：Ⅰ型主要以ANA和（或）SMA阳性为主；Ⅱ型是以抗LKM-1抗体和抗LC-1抗体阳性为主；Ⅲ型抗SLA/LP抗体阳性为特征[7]。AIH患者中Ⅰ型多见，在本研究中， 17例的AIH患者，其中13例患者出现ANA和3例SMA抗体与Ⅰ型AIH的诊断符合。2例抗LKM-1抗体阳性和抗3例LC-1抗体阳性属于Ⅱ型。AIH中ANA、LKM-1和LC-1检测出阳性，其阳性率为76.4%、23.5%和17.6%未见于其他肝脏疾病，是可能有价值的AIH诊断标志[8]。
AMA检测成为诊断PBC的重要检测项目。AMA在PBC临床、生化和组织学表现异常之前就可能出现。因为PBC患者主要标志AMA-M2为线粒体M2的抗原成分，本检测中AMA 、AMA-M2和水平SP100阳性率达100%、90.0%和23.8%，显著高于非PBC组。故M2亚型对PBC具有更高的特异性和诊断价值[9]。
PSC以胆管损伤为主的慢性胆汁淤积性疾病，多见于中青年男性[10]。本研究的5例PSC患者ANA阳性检测率40%，其余指标都是阴性。本文结果提示，PSC的免疫学指标不敏感和特异，主要依靠经内镜逆行胰胆管造影来做出正确诊断。
总而言之，自身免疫性肝病患者联合检测血清ANA、SMA、AMA、抗LKM-1、抗LC-1、抗SLA等自身抗体， 对自身免疫性肝病的临床诊断、鉴别诊断和治疗有着十分重要作用。
参考文献：
[1] 谭立明，王园园，李 华，等.161例自身免疫性肝病患者相关自身抗体检测的临床研究[J].免疫学杂志，2012，28（12）：1061-1064.
[2] 杜丽国. 2011 年 1-10 月肝病患者自身免疫性抗体检测结果分析[J]. 中国临床研究， 2012， 25（4）： 392-393.
[3] Manns MP，Czaja AJ，Gorham JD，et al.Diagnosis and management of autoimmune hepatitis[J].Hepatology，20l0，5l（6）：2193-2213.
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