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摘 要：目的：建立鸡蛋中氟虫腈及代谢物残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。方法：在QuEChERS方法基础上，对提取溶液、盐析剂和净化剂等参数进行了优化。最终，样品以乙腈水提取，C18净化，UPLC-MS/MS测定。结果：氟虫腈及其代谢物在10～100 ng/mL范围内线性关系较好，相关系数r≥0.995，以3倍和10倍信噪比计算氟虫腈及其代谢物的检出限和定量限分别为0.162～0.685 ?g/kg和0.541～2.285 ?g/kg。在鸡蛋空白样品添加浓度为0.02 mg/kg水平下，氟虫腈、氟虫腈砜、氟甲腈、氟虫腈硫醚回收率范围为78.0%～107.4%，相对标准偏差（RSD）为3.93%～5.66%。结论：本方法快速、简便、准确，可用于鸡蛋中的氟虫腈及其代谢物残留的测定。
关键词：基质固相分散;超高效液相色谱-串联质谱;氟虫腈;鸡蛋
鸡蛋蛋黄中的卵磷脂、甘油三酯、胆固醇和卵黄素对神经系统和身体发育有益，还能改善记忆力，鸡蛋中的蛋白质能够修复肝脏组织损伤[1]。在养殖过程中，兽药能预防和治疗疾病，这些药物在使用过程中会直接或间接地进入鸡体内，对人体健康产生影响。氟虫腈主要用于防治多种害虫[2]，但是氟虫腈会对生态环境和人体健康造成影响，所以我国规定2009年10月1日起禁用氟虫腈[3]。
QuEChERS法具有快速、简便、廉价、有效、耐用、安全，是近年来应用日趋广泛的萃取技术，已被逐步用于兽药残留检测领域[4-5]。氟虫腈类药物的测定方法主要包括气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法等。UPLC-MS/MS在兽药残留检测方面具有强的定性和定量分析能力，广泛应用于农药和兽药残留的检测[6-8]。本研究通过试验探究QuEChERS方法结合UPLC-MS/MS检测鸡蛋中氟虫腈类抗菌药物残留的试验条件，建立了一种快速、有效、简便的测定鸡蛋中氟虫腈类药物的方法。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
试剂：乙腈、甲酸、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）;实验室用水为Milli-Q超纯水;无水硫酸镁、氯化钠（徐州淞誉化工科技有限公司）;C18购买于美国Waters公司;氟虫腈、氟虫腈砜、氟甲腈和氟虫腈硫醚标准品溶液（100 ?g/mL）（北京坛墨质检科技有限公司）。
仪器：Waters TQ MS超高效液相串联质谱仪（美国Waters公司）;HC-3515高速离心机（日本日立公司）;Milli-Q超纯水净仪（美国密理博公司）;KQ-500V数控超声波清洗器;数显涡旋振荡器（美国赛默飞公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液配制
（1）混合标准储备液。分别吸取标准品溶液氟虫腈、氟虫腈砜、氟甲腈、氟虫腈硫醚1 mL至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配成浓度为10 ?g/mL的标准储备液。
（2）混合标准中间液。准确吸取混合标准储备液，用甲醇定容配成浓度为1.0 ?g/mL的混合标准中间液。
（3）溶剂和基质标准溶液的配制。准确吸取适量混合标准中间液，浓度为1.0 ?g/mL，用流动相初始比例逐级稀释成质量浓度为10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL和100 ng/mL的溶剂混合标准溶液，基质标准溶液按照相同系列浓度配制。
1.2.2 样品前处理
称取鸡蛋样品2.00 g置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈/水（9∶1，V/V）（含0.5%甲酸）作为提取溶剂，旋涡振荡均匀，加入1 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，剧烈振荡3 min，超声提取10 min，4 ℃条件下，10 000 r/min离心5 min，吸取上清液加入含有10 mg C18净化管中，手动剧烈振荡3 min，4 ℃条件下，10 000 r/min离心5 min，0.22 ?m滤膜过滤后，UPLC-MS/MS检测。
1.2.3 仪器条件
（1）色谱条件。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC CSH C18（1.7 ?m，100 mm×2.1 mm）;柱温：30 ℃;进样量：10 ?L;流速：0.2 mL/min;流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0～6 min，10%～30% A;6～9 min，30%～50% A;9～9.5 min，50%～100% A;9.5～12.5 min，100% A;12.5～15 min，100%～10% A。
（2）质谱条件。电离方式：电喷雾电离源，负离子模式扫描，多反应监测（MRM）;用MassLynx 4.1软件进行数据分析，毛细管电压为3.0 kV，去溶剂温度和离子源温度分别为400 ℃和150 ℃，碰撞气体（氩气）和去溶剂气体（氮气）流量分别为0.14 L/min和800 L/h。质谱多反应监测（MRM）参数见表1。
2 結果与分析
2.1 色谱和质谱条件优化
本文考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液共4种流动相在相同梯度洗脱条件，对氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜化合物的分离度、灵敏度和峰型的影响。结果表明，4种化合物在不同体系中相应值比较为：甲醇-水<甲醇-0.1%甲酸溶液<乙腈-水=乙腈-0.1%甲酸溶液，故选择含有乙腈体系的流动相;试验对4种化合物在不同体系中的峰形进行比较，发现含有甲酸组的对称性优于不含甲酸组的。因此，本研究选择乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相。
用甲醇分别配制氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜化合物的浓度为200 ng/mL，通过质谱注射泵直接进入质谱进行MS扫描，优化毛细管电压和碰撞能量，选择响应丰度较高、干扰较少的作为定量离子对。质谱参数见表1;氟虫腈药物的MRM色谱图见图1。 2.2 提取溶剂的優化
选择鸡蛋为试验样品，考察了甲醇/水（9∶1）、乙腈/水（9∶1）、乙腈/水（9∶1）（含0.1%甲酸）、乙腈/水（9∶1）（含0.5%甲酸）和乙腈/水（9∶1）（含1%甲酸）5种提取溶剂对氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜化合物的提取效果。结果表明，含有乙腈组分的提取剂对组织渗透力强，对目标物提取效果好，且沉淀蛋白质及脂肪能力强，因此本试验选取乙腈作为提取溶剂。随着甲酸含量的加入，有利于目标物提取，当加入量超过0.5%时，提取效率明显降低。因此，选择乙腈/水（9∶1）（含0.5%甲酸）为本试验的提取溶剂，提取回收率在78%～107.4%。
2.3 盐析剂的优化
加入无水MgSO4可促使蛋白质变性分散，防止样品形成块状影响提取回收，同时能吸取提取溶剂中的水分，促进目标化合物溶解在乙腈层;加入氯化钠有利于水相和有机相分离，降低目标物在水层中的溶解度，更加有利于药物的提取。本文考察了9组盐析剂无水硫酸镁和氯化钠的组合，分别为2 g和3 g、2 g和2 g、2 g和1 g、1 g和3 g、1 g和2 g、1 g和1 g、0.5 g和3 g、0.5 g和2 g及0.5 g和1 g。在鸡蛋空白样品浓度为0.02 mg/kg添加水平下，随着无水硫酸镁含量增加，氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜回收率逐渐变大，当无水硫酸镁含量为1.0 g时，4种目标物的回收率为78%～107.4%，再次增加无水硫酸镁质量时，4种目标物的回收率出现明显下降;而在试验中选取的氯化钠的添加质量在1 g时，4种目标化合物的回收率最高。可能由于无水硫酸镁和氯化钠含量增加，造成失水严重而目标物被包裹在盐析剂空隙中。因此，选择1 g无水硫酸镁和1 g氯化钠为盐析剂。
2.4 净化剂含量的优化
C18作为净化剂，可以去除鸡蛋样品中脂肪、维生素和甾醇等非极性物质，降低杂质的影响，减小基质效应，保证试验结果的准确性。试验考察了加入量分别为5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的净化剂C18对氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜的影响。研究证明C18为10 mg时，添加浓度为0.02 mg/kg，兽药的回收率范围在78%～107.4%。
2.5 基质效应、检出限和定量限
按如下公式计算评价基质对各化合物的基质效应：
ME（%）=（B-A）/A×100
式中：ME为基质效应;A为初始流动相溶液标准曲线的斜率;B为基质配制标准曲线的斜率。若20%>ME>-20%，则为基质效应可以接受，否则存在较强的基质抑制或增强效应[9]。根据表2可知，4种药物在鸡蛋中的基质效应均在可接受范围内（20%>ME>-20%），为了定量准确，选择基质加标标准曲线法定量。
由表2可知，氟虫腈及其代谢物在10～100 ng/mL范围内线性关系较好，相关系数r≥0.995。以S/N=3和S/N=10计算检出限（LOD）和定量限（LOQ），4种目标化合物的LOD和LOQ分别为0.162～0.685 ?g/kg和0.541～2.285 ?g/kg，满足鸡蛋中多种兽药残留的测定需求。
2.6 准确度和精密度
在鸡蛋空白样品添加浓度为0.02 mg/kg水平下，进行8次平行试验。采用基质匹配标准曲线进行定量分析，由表3可知，4种化合物的平均加标回收率在78.0%～107.4%，相对标准偏差在3.93%～5.66%，方法具有较好的准确度和重现性。
2.7 实际样品测定
样品《食品安全国家标准 鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》（GB 23200.115—2018）和本方法同时检测1个阴性样品和2个阳性样品，获得的结果是一致的，同时做加标质量控制样品，4种药物的回收率在75%～112%范围内。样品中检测出氟甲腈，其余药物均未检出。根据结果显示，两种方法检测的结果差异小。
3 结论与讨论
本文建立了基质固相分散-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡蛋中的氟虫腈及其代谢物残留方法。本方法快速、简便、灵敏度高、准确，可用于检测鸡蛋中的氟虫腈及其代谢物残留同时测定。与现行国家标准及农业部公告相比，该方法能实现不同性质的多类兽药残留同时检测，大大缩短了检测周期，节约了检测成本，为相关的检测机构提供了理论依据和技术支持。
参考文献
[1]徐有均.鸡蛋的营养价值[J].畜牧与饲料科学，2012，33（9）：116-117.
[2]黎小鹏，梁雪琪，陈楠，等.超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪检测动物源性食品中氟虫腈及其代谢物[J].安徽农业科学，2019，47（14）：204-206.
[3]郑仙珏.“毒鸡蛋”事件凸显农药滥用危害[J].生态经济，2017，33（10）：2-5.
[4]熊雯，易路遥，晏亮，等.QuEChERS-超高效液相色谱-质谱法测定鲜蛋中氟虫腈及其代谢物[J].分析仪器，2019（3）：41-46.
[5]郝杰，邵瑞婷，姜洁，等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋、鸡肉中氟虫腈及其代谢物残留[J].食品科学，2019，40（2）：318-323.
[6]励炯，郑锌，王红青，等.分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋中氟虫腈及其代谢产物[J].色谱，2017，35（12）：1211-1215.
[7]王爱军.气相色谱法检测鸡蛋中氟虫腈的残留[J].农产品加工，2019（14）：62-64.
[8]冯程程，刘新刚，董丰收，等.5种动物源食品中的氟虫腈及其3个代谢物残留量检测[J].植物保护，2019（5）：207-213.
[9]国家卫生健康委员会，农业农村部，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准-鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定-液相色谱-质谱联用法：GB 23200.115—2018[S].北京：中国标准出版社，2018.
关键词：基质固相分散;超高效液相色谱-串联质谱;氟虫腈;鸡蛋
鸡蛋蛋黄中的卵磷脂、甘油三酯、胆固醇和卵黄素对神经系统和身体发育有益，还能改善记忆力，鸡蛋中的蛋白质能够修复肝脏组织损伤[1]。在养殖过程中，兽药能预防和治疗疾病，这些药物在使用过程中会直接或间接地进入鸡体内，对人体健康产生影响。氟虫腈主要用于防治多种害虫[2]，但是氟虫腈会对生态环境和人体健康造成影响，所以我国规定2009年10月1日起禁用氟虫腈[3]。
QuEChERS法具有快速、简便、廉价、有效、耐用、安全，是近年来应用日趋广泛的萃取技术，已被逐步用于兽药残留检测领域[4-5]。氟虫腈类药物的测定方法主要包括气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法等。UPLC-MS/MS在兽药残留检测方面具有强的定性和定量分析能力，广泛应用于农药和兽药残留的检测[6-8]。本研究通过试验探究QuEChERS方法结合UPLC-MS/MS检测鸡蛋中氟虫腈类抗菌药物残留的试验条件，建立了一种快速、有效、简便的测定鸡蛋中氟虫腈类药物的方法。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
试剂：乙腈、甲酸、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）;实验室用水为Milli-Q超纯水;无水硫酸镁、氯化钠（徐州淞誉化工科技有限公司）;C18购买于美国Waters公司;氟虫腈、氟虫腈砜、氟甲腈和氟虫腈硫醚标准品溶液（100 ?g/mL）（北京坛墨质检科技有限公司）。
仪器：Waters TQ MS超高效液相串联质谱仪（美国Waters公司）;HC-3515高速离心机（日本日立公司）;Milli-Q超纯水净仪（美国密理博公司）;KQ-500V数控超声波清洗器;数显涡旋振荡器（美国赛默飞公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液配制
（1）混合标准储备液。分别吸取标准品溶液氟虫腈、氟虫腈砜、氟甲腈、氟虫腈硫醚1 mL至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配成浓度为10 ?g/mL的标准储备液。
（2）混合标准中间液。准确吸取混合标准储备液，用甲醇定容配成浓度为1.0 ?g/mL的混合标准中间液。
（3）溶剂和基质标准溶液的配制。准确吸取适量混合标准中间液，浓度为1.0 ?g/mL，用流动相初始比例逐级稀释成质量浓度为10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL和100 ng/mL的溶剂混合标准溶液，基质标准溶液按照相同系列浓度配制。
1.2.2 样品前处理
称取鸡蛋样品2.00 g置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈/水（9∶1，V/V）（含0.5%甲酸）作为提取溶剂，旋涡振荡均匀，加入1 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，剧烈振荡3 min，超声提取10 min，4 ℃条件下，10 000 r/min离心5 min，吸取上清液加入含有10 mg C18净化管中，手动剧烈振荡3 min，4 ℃条件下，10 000 r/min离心5 min，0.22 ?m滤膜过滤后，UPLC-MS/MS检测。
1.2.3 仪器条件
（1）色谱条件。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC CSH C18（1.7 ?m，100 mm×2.1 mm）;柱温：30 ℃;进样量：10 ?L;流速：0.2 mL/min;流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0～6 min，10%～30% A;6～9 min，30%～50% A;9～9.5 min，50%～100% A;9.5～12.5 min，100% A;12.5～15 min，100%～10% A。
（2）质谱条件。电离方式：电喷雾电离源，负离子模式扫描，多反应监测（MRM）;用MassLynx 4.1软件进行数据分析，毛细管电压为3.0 kV，去溶剂温度和离子源温度分别为400 ℃和150 ℃，碰撞气体（氩气）和去溶剂气体（氮气）流量分别为0.14 L/min和800 L/h。质谱多反应监测（MRM）参数见表1。
2 結果与分析
2.1 色谱和质谱条件优化
本文考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液共4种流动相在相同梯度洗脱条件，对氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜化合物的分离度、灵敏度和峰型的影响。结果表明，4种化合物在不同体系中相应值比较为：甲醇-水<甲醇-0.1%甲酸溶液<乙腈-水=乙腈-0.1%甲酸溶液，故选择含有乙腈体系的流动相;试验对4种化合物在不同体系中的峰形进行比较，发现含有甲酸组的对称性优于不含甲酸组的。因此，本研究选择乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相。
用甲醇分别配制氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜化合物的浓度为200 ng/mL，通过质谱注射泵直接进入质谱进行MS扫描，优化毛细管电压和碰撞能量，选择响应丰度较高、干扰较少的作为定量离子对。质谱参数见表1;氟虫腈药物的MRM色谱图见图1。 2.2 提取溶剂的優化
选择鸡蛋为试验样品，考察了甲醇/水（9∶1）、乙腈/水（9∶1）、乙腈/水（9∶1）（含0.1%甲酸）、乙腈/水（9∶1）（含0.5%甲酸）和乙腈/水（9∶1）（含1%甲酸）5种提取溶剂对氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜化合物的提取效果。结果表明，含有乙腈组分的提取剂对组织渗透力强，对目标物提取效果好，且沉淀蛋白质及脂肪能力强，因此本试验选取乙腈作为提取溶剂。随着甲酸含量的加入，有利于目标物提取，当加入量超过0.5%时，提取效率明显降低。因此，选择乙腈/水（9∶1）（含0.5%甲酸）为本试验的提取溶剂，提取回收率在78%～107.4%。
2.3 盐析剂的优化
加入无水MgSO4可促使蛋白质变性分散，防止样品形成块状影响提取回收，同时能吸取提取溶剂中的水分，促进目标化合物溶解在乙腈层;加入氯化钠有利于水相和有机相分离，降低目标物在水层中的溶解度，更加有利于药物的提取。本文考察了9组盐析剂无水硫酸镁和氯化钠的组合，分别为2 g和3 g、2 g和2 g、2 g和1 g、1 g和3 g、1 g和2 g、1 g和1 g、0.5 g和3 g、0.5 g和2 g及0.5 g和1 g。在鸡蛋空白样品浓度为0.02 mg/kg添加水平下，随着无水硫酸镁含量增加，氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜回收率逐渐变大，当无水硫酸镁含量为1.0 g时，4种目标物的回收率为78%～107.4%，再次增加无水硫酸镁质量时，4种目标物的回收率出现明显下降;而在试验中选取的氯化钠的添加质量在1 g时，4种目标化合物的回收率最高。可能由于无水硫酸镁和氯化钠含量增加，造成失水严重而目标物被包裹在盐析剂空隙中。因此，选择1 g无水硫酸镁和1 g氯化钠为盐析剂。
2.4 净化剂含量的优化
C18作为净化剂，可以去除鸡蛋样品中脂肪、维生素和甾醇等非极性物质，降低杂质的影响，减小基质效应，保证试验结果的准确性。试验考察了加入量分别为5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的净化剂C18对氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈和氟虫腈砜的影响。研究证明C18为10 mg时，添加浓度为0.02 mg/kg，兽药的回收率范围在78%～107.4%。
2.5 基质效应、检出限和定量限
按如下公式计算评价基质对各化合物的基质效应：
ME（%）=（B-A）/A×100
式中：ME为基质效应;A为初始流动相溶液标准曲线的斜率;B为基质配制标准曲线的斜率。若20%>ME>-20%，则为基质效应可以接受，否则存在较强的基质抑制或增强效应[9]。根据表2可知，4种药物在鸡蛋中的基质效应均在可接受范围内（20%>ME>-20%），为了定量准确，选择基质加标标准曲线法定量。
由表2可知，氟虫腈及其代谢物在10～100 ng/mL范围内线性关系较好，相关系数r≥0.995。以S/N=3和S/N=10计算检出限（LOD）和定量限（LOQ），4种目标化合物的LOD和LOQ分别为0.162～0.685 ?g/kg和0.541～2.285 ?g/kg，满足鸡蛋中多种兽药残留的测定需求。
2.6 准确度和精密度
在鸡蛋空白样品添加浓度为0.02 mg/kg水平下，进行8次平行试验。采用基质匹配标准曲线进行定量分析，由表3可知，4种化合物的平均加标回收率在78.0%～107.4%，相对标准偏差在3.93%～5.66%，方法具有较好的准确度和重现性。
2.7 实际样品测定
样品《食品安全国家标准 鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》（GB 23200.115—2018）和本方法同时检测1个阴性样品和2个阳性样品，获得的结果是一致的，同时做加标质量控制样品，4种药物的回收率在75%～112%范围内。样品中检测出氟甲腈，其余药物均未检出。根据结果显示，两种方法检测的结果差异小。
3 结论与讨论
本文建立了基质固相分散-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡蛋中的氟虫腈及其代谢物残留方法。本方法快速、简便、灵敏度高、准确，可用于检测鸡蛋中的氟虫腈及其代谢物残留同时测定。与现行国家标准及农业部公告相比，该方法能实现不同性质的多类兽药残留同时检测，大大缩短了检测周期，节约了检测成本，为相关的检测机构提供了理论依据和技术支持。
参考文献
[1]徐有均.鸡蛋的营养价值[J].畜牧与饲料科学，2012，33（9）：116-117.
[2]黎小鹏，梁雪琪，陈楠，等.超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪检测动物源性食品中氟虫腈及其代谢物[J].安徽农业科学，2019，47（14）：204-206.
[3]郑仙珏.“毒鸡蛋”事件凸显农药滥用危害[J].生态经济，2017，33（10）：2-5.
[4]熊雯，易路遥，晏亮，等.QuEChERS-超高效液相色谱-质谱法测定鲜蛋中氟虫腈及其代谢物[J].分析仪器，2019（3）：41-46.
[5]郝杰，邵瑞婷，姜洁，等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋、鸡肉中氟虫腈及其代谢物残留[J].食品科学，2019，40（2）：318-323.
[6]励炯，郑锌，王红青，等.分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋中氟虫腈及其代谢产物[J].色谱，2017，35（12）：1211-1215.
[7]王爱军.气相色谱法检测鸡蛋中氟虫腈的残留[J].农产品加工，2019（14）：62-64.
[8]冯程程，刘新刚，董丰收，等.5种动物源食品中的氟虫腈及其3个代谢物残留量检测[J].植物保护，2019（5）：207-213.
[9]国家卫生健康委员会，农业农村部，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准-鸡蛋中氟虫腈及其代谢物残留量的测定-液相色谱-质谱联用法：GB 23200.115—2018[S].北京：中国标准出版社，2018.