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摘 要：目的：探讨低氧、运动对骨骼肌蛋白质合成的作用及其机理。方法：雄性SD大鼠随机分为对照组、低氧组、运动组、低氧运动组，每组各20只。实验第1、28d分别取材，放免法测试骨骼肌睾酮含量，荧光定量PCR测试ARmRNA表达，western blot检测AR蛋白表达，EMSA测试AR与DNA结合能力，BCA法测试骨骼肌总蛋白质含量。结果：1)28d运动组比对照骨骼肌睾酮含量下降，ARmRNA和AR蛋白表达升高，AR与DNA结合能力明显升高，有非常显著性差异，骨骼肌总蛋白质含量升高，有显著性差异。2)28d低氧组比对照组骨骼肌睾酮含量下降，有显著性差异，ARmRNA升高，AR蛋白表达降低，AR活性升高，骨骼肌蛋白质含量升高。3)28d低氧运动组比运动组骨骼肌睾酮含量明显降低，ARmRNA、AR蛋白表达、AR活性和骨骼肌总蛋白含量下降，均有显著性差异。结论：1)运动后进行低氧暴露比单纯运动可能通过睾酮-AR含量-AR活性各水平抑制蛋白质合成。2)单纯低氧暴露、运动或运动后进行低氧暴露通过睾酮水平调节AR，最终影响骨骼肌蛋白含量。
关键词：低氧；运动；睾酮；AR表达；AR与DNA结合能力
中图分类号：G804.2 文献标识码：A 文章编号：1007－3612(2010)04－0039－05
高住低训(Living high-training low HiLo)是美国学者莱文在高原训练基础上提出的一种低氧训练模式，主要用于耐力项目运动员提高有氧运动能力。高住低训期间运动员白天进行耐力训练，肌肉蛋白质分解增加，合成减少，存在蛋白质净降解现象，耐力运动后蛋白质以合成代谢为主，蛋白质合成增强的趋势一直持续到第二天训练之前。高住低训是否可以避免低氧对骨骼肌的负面作用?运动员白天进行耐力训练后，晚上在低氧环境中休息是否抑制骨骼肌蛋白质合成?这些都直接关系到运动员训练后的恢复、运动员力量、速度素质的保持或提高，所以为了全面完整地把握高住低训对机体作用的规律，高住低训，尤其是高住低氧对蛋白质合成的影响是一个亟待探讨的问题。因对运动员实施肌肉活检很困难，所以本研究以大鼠为研究对象，利用一个促进骨骼肌蛋白质合成的耐力运动训练模型，模拟高住低训，观察低氧、低氧运动是否影响雄激素受体(Androgen Receotor AR)含量及其活性，最终影响耐力运动后骨骼肌蛋白质的合成。为了进一步证实低氧、低氧运动对骨骼肌收缩功能的影响本研究还测试了骨骼肌中肌球蛋白重链(Myosin heavy chainMHC)的含量，试图为高住低训期间运动员运动能力和肌肉力量保持和提高提供理论依据。国内外未见高住低训从AR表达和AR转录激活活性等方面对骨骼肌蛋白质合成作用及其机理的研究报道。
1 研究方法
1.1 实验对象与分组 健康雄性、2月龄SD大鼠80只，体重180～200g，随机分为8组：对照组(2组)、低氧组(2组)、运动组(2组)、低氧运动组(2组)，每组各l(只。北京大学医学部实验动物科学部SPF级动物房中饲养，温度22～26℃，湿度30％～58％，自由进食及饮水。
运动组和低氧运动组先进行适应性跑台训练1周，然后进行正式实验4周，各组的生活、运动和低氧暴露方式具体见表1。
1.2 测试样本采集与处理 在实验第1d、第28d各组动物出低氧帐篷后分别用25％乌拉坦麻醉后腹主动脉取血处死，快速取出腿部的腓肠肌，剔除脂肪和筋膜，用预冷的生理盐水洗净，滤纸吸干后称重，投入液氮中保存。
1.3 指标测试方法
1.3.1 骨骼肌睾酮含量 称取40mg的腓肠肌，用眼科小剪迅速剪碎，按1:4的比例加入组织匀浆介质，匀浆20s×3次，匀浆速度为13000转/min，然后40℃，20000转/min离心20min，取上清于-80℃储存待测。
采用北京华英HY-020睾酮放免试剂盒，取标准品和待测样品按照试剂盒的操作步骤进行加样，利用GC-911-r计数仪直接读出样品浓度。
1.3.2 骨骼肌 ARmRNA表达 首先以TrizolTM提取总RNA，M-MLV逆转录酶反转录为cDNA。以genebank上提供的AR mRNA基因序列(序列号：NM-012502)及?-actin mRNA序列(序列号：NM-031144)为模板，以primerpremier5.0软件设计引物，采用TaKaRa Ex Taa(R)R-PCR Version 2.1，在ABI Prism@7300型荧光定量PCR仪上进行扩增。以ABI7300 system software软件对数据进行分析，计算方法使用比较CT法相对定量，目的基因表达量=2。
1.3.3 骨骼肌AR蛋白表达 取40mg骨骼肌组织，以1：4的比例加入细胞裂解缓冲液，冰浴匀浆，测定蛋白浓度。上样鲢40ug/well，浓缩胶60V，1.5h，分离胶90v，2.5h，电冰。JANSSEN LIFE SCIENCES PRODUCTS半干式电转印仪350mA转膜1.5 h。封闭过夜后，与稀释1：500的抗体(AR(N-20)sc-816：Santa Cruz Biotechnology)4mL结合，4℃过夜。与稀释1:3000的二抗(Anti-RabbitIgG/HRP：Dakoeytomation)4mL结合，室温震荡孵育1h。利用ECL显色试剂盒和ImageQuant ECL凝胶成像仪曝光，采集并分析图像。
1.3.4 骨骼肌组织中AR与DNA结合能力 称取肌肉组织40mg，利用美国Pierce公司NE－PER核蛋白抽提试剂盒制备核蛋白抽提物。考马斯亮蓝法进行核蛋白定量。采用特异性的竞争结合实验来证实探针的特异性，探针序列(5’－atagtccatgatgttctcaagat－3’，5’-atcttgagaacatcatggactat-3’)，利用AR(N－20)sc－816(santa Cruz Bioteehnology)进行超级凝胶电泳实验确定结合复合物中AR蛋白的特异性。凝胶电泳迁移率改变分析实验(EMSA)：采用美国Pierce公司LightShift Chemiluminescent EMSA试剂盒和TL-2000紫外交联仪进行核蛋白与探针结合，电泳，显影。利用LAS-3000化学发光及成像系统成像，采集信号。用Molecular Imager FX System软件系统对条带进行灰度分析。
1.3.5 骨骼肌总蛋白质含量 采用PIERCE公司BCA蛋白测试试剂盒，按试剂盒说明进行测试。
1.4 数据统计方法 所有数据均以“平均数±标准差”表示，用spss13.0统计软件进行数据处理，各组之间均数比较用单因素方差分析。P<0.05，显著性差异；P<0.01，非 常显著性差异。
2 结果与分析
2.1 急性和慢性低氧、运动对骨骼肌睾酮浓度和骨骼肌蛋白质总量的影响如表2所示，1d各组大鼠腓肠肌匀浆睾酮浓度之间比较均无显著性差异。如表3所示，28d低氧组腓肠肌睾酮浓度比对照组降低，有显著性差异。
如表2所示，1d各组大鼠骨骼肌总蛋白质含量比较均无显著性差异。如表3所示，28d运动组大鼠的骨骼肌总蛋白质含量比对照组明显升高，有显著性差异，比低氧运动组也明显提高，有显著性差异。
运动组骨骼肌总蛋白质含量的变化反映了机体对28d耐力运动的良好适应，说明本实验所采用的运动模型有效促进肌肉蛋白质的合成代谢，在此模型基础上进行低氧暴露模拟高住低训是可行的。
1d低氧组、运动组、低氧运动组大鼠的骨骼肌总蛋白质含量比对照组均降低，反映了一次低氧应激和一次耐力运动后蛋白质含量有减少的趋势，而低氧运动组是运动后进行低氧暴露，推测运动后低氧进一步抑制蛋白质合成，最终导致蛋白质含量最低。经过28d的慢性适应后，低氧组比对照组略高，说明与一天急性低氧应激相比，28d单纯的间断性低氧暴露对蛋白质含量的影响不大。但与1d低氧运动组类似，28d低氧运动组的骨骼肌总蛋白质含量最低，与运动组相比，说明每天运动后进行低氧暴露还是在一定程度上抑制了蛋白质的合成。
运动后进行低氧暴露降低骨骼肌总蛋白质含量的原因可能是：低氧抑制蛋白质合成、加快蛋白质分解，其中主要是抑制蛋白质合成，可能主要是由于促合成激素的变化或缺氧直接抑制了蛋白质的合成。
低氧暴露可能抑制睾酮合成：长期低氧暴露抑制下丘脑一垂体一性腺轴，抑制睾丸间质细胞内睾酮合成酶的活性，促进糖皮质激素分泌，糖皮质激素在下丘脑一垂体一睾丸三个环节影响睾酮的分泌。有学者报道了2km和5km的慢性连续低氧激活SS，显著抑制GH-IGF-1轴，这种抑制作用一直持续整个低氧过程。
Sandrine等人报道了低氧直接抑制蛋白质合成：大鼠肝细胞在5％氧浓度的低氧环境中孵育120min后，细胞内ATP、RNA和蛋白质合成分别明显降低了62％、82％和93％。Victor R等人测试了大鼠体内心肌、骨骼肌、肝脏、胫骨、皮肤、大脑、肾、肺等各种组织在10％氧浓度中低氧暴露6h后，蛋白质合成速率降低了15％～35％。近几年关于低氧直接抑制蛋白质合成的机理主要集中在蛋白质的翻译环节：低氧通过抑制mRNA翻译的起始步骤而快速抑制蛋白质的合成，低氧抑制翻译是通过两个不同的机理介导的：第一个是通过磷酸化并抑制真核起始因子eIF2a，PERK激酶可磷酸化这个因子；低氧抑制翻译的第二个机理是使第二个真核起始复合物eIF4F失活。低氧使蛋白质合成减少是通过氧传感途径直接抑制mRNA翻译的起始步骤，低氧通过抑制mTOR途径的4E-BPl和eEF2降低蛋白质合成。
2.2 急性和慢性低氧、运动对骨骼肌ARmRNA和AR蛋白表达的影响由表2、3所示，1d和28d各组大鼠骨骼肌ARmRNA水平比较无显著性差异。
由表2所示，1d运动组AR蛋白表达比低氧运动组明显升高，有显著性差异，1d低氧运动组AR蛋白表达的变化和ARmRNA表达的变化一致。由表3所示，28d低氧组AR蛋白表达比运动组明显降低，有非常显著性差异，28d低氧运动组AR蛋白水平明显低于运动组，有显著性差异。
1d运动组AR蛋白表达升高，与1d运动组睾酮的变化一致。有研究报道一次一般力量训练后，大鼠血睾酮出现短暂升高，Ⅱ型肌中AR含量也明显升高17。本研究也证实一次运动可提高AR蛋白水平，可能与一次运动后骨骼肌睾酮含量明显提高有关。28d运动组AR蛋白表达增加，结合28d运动组睾酮和骨骼肌蛋白质含量的变化，分析虽然睾酮没有明显变化，但运动可能是通过AR表达来调节骨骼肌的蛋白质合成，运动组AR蛋白表达升高是骨骼肌蛋白质含量增加的可能作用机制。1d和28d运动均提高AR含量，进一步说明本实验采用的运动模型是促进肌肉蛋白质合成的。
28d低氧组和低氧运动组AR蛋白表达的变化与两组睾酮水平的变化一致。多数研究表明ARmRNA和AR蛋白表达水平主要受睾酮的正向调节，有研究证明去势大鼠或小鼠前列腺ARmRNA和AR蛋白表达减少，DHT治疗去势动物可以恢复AR表达到正常水平。用雄激素处理人体肝癌细胞系和成骨细胞系可升高ARmRNA水平，而去势却降低大鼠海马ARmRNA水平。Doumit等实验证明，T具有明显上调AR的作用，外源性补充睾酮可提高ARm，RNA和AR蛋白表达，DHT处理人造骨细胞系上调ARmRNA表达，明显提高AR数量。在骨骼肌中，由于不同肌肉对雄激素的反应和敏感性不同，在不同肌肉中AR数量有很大差异，但多数研究仍证实在骨骼肌中雄激素正向调节AR的表达：Michel等观察到大鼠去势后，股四头肌AR水平随时间延长显著降低。Lee等研究证明氧雄龙可诱导骨骼肌ARmRNA表达升高。张文栋的研究显示常氧安静组大鼠ARmRNA水平与血清、股四头肌组织睾酮变化趋势一致，提示雄激素正向调节骨骼肌组织中ARmR，NA表达，6周、9周低负荷耐力运动及6周高负荷耐力运动使ARmRNA表达与同期睾酮水平出现一致性升高。作者认为ARmRNA水平升高是运动的作用，还是由于运动引起睾酮水平变化从而上调ARmRNA表达，尚待进一步研究。
结合28d运动组AR表达的变化，低氧组和低氧运动组AR表达明显下降说明低氧抑制AR蛋白水平：Ghafar etal，的研究报道LNCaP细胞在24h持续低氧暴露和24h低氧暴露后复氧均降低AR蛋白水平和AR靶基因PSA水平。但Soo-Yeon的研究发现LNCaP细胞和AU-14细胞在低氧处理4、8、16h后复氧2h均未观察到AR蛋白水平的明显变化。28d低氧组和低氧运动组ARmRNA水平无明显变化，说明低氧明显抑制ARmRNA后的翻译水平或翻泽后修饰等环节，低氧抑制蛋白质翻泽的起始步骤可以用来解释低氧抑制AR蛋白表达水平。低氧组AR蛋白水平最低也说明了28d长期低氧暴露抑制AR蛋白质的合成。28d低氧暴露明显抑制AR蛋白表达的另一个主要原因是睾酮水平下降，睾酮是调节AR水平的一个主要因素，本实验低氧组、低氧运动组睾酮明显降低的同时诱导AR蛋白水平相应降低，说明低氧是通过T-AR途径调节AR表达。
1d低氧运动组AR蛋白表达最低，低于低氧组和对照组，原因可能是一次低氧刺激AR蛋白水平略升高，而运动刺激明显升高AR蛋白水平，当两种刺激相互叠加时，可能由于刺激过度反而明显抑制AR蛋白水平。28 d低氧运动组的AR蛋白表达介于低氧组和运动组之间，说明大鼠对低氧运动在28d中有一个逐渐适应的过程，结合运动组的变化，说明低氧运动组AR蛋白表达明显减低是低氧抑制效应起了 主要作用。
虽然低氧组、低氧运动组睾酮降低正向调节AR蛋白表达，但低氧组、低氧运动组睾酮水平与ARmRNA水平的变化并不一致，类似的研究报道也显示睾酮降低的同时并不影响骨骼肌ARmRNA水平。Marcas观察到人体在一次急性向心或离心运动后，血清睾酮没有升高反而下降，但肌肉中ARmRNA含量却明显升高。Matsakas A等人观察12周跑笼训练对大鼠三种不同骨骼肌(腓肠肌、股外侧肌、比目鱼肌)中ARmRNA表达和血清睾酮的作用，RT-PCR结果显示在任何肌肉中训练组和常氧安静组ARmRNA表达比较均无显著性差异，酶免分析显示与常氧安静组相比，训练组血清睾酮水平显著降低，这些结果显示长期训练使大鼠血清睾酮水平降低，但并不影响骨骼肌中ARmRNA水平。张文栋的研究显示周高负荷耐力常氧运动组股四头肌组织睾酮水平显著降低，而ARmRNA表达仍明显高于常氧安静组，认为9周高负荷常氧运动组强度相对较大，运动时间较长，外周骨骼肌组织摄取和消耗睾酮量增加，引起股四头肌组织睾酮水平降低，为保证骨骼肌组织功能，抑制蛋白降解，ARmRNA表达一定程度代偿性升高，促进AR蛋白合成，是机体一种保护性反应。
虽然Id、28d低氧运动组ARmRNA和AR蛋白表达的变化基本一致，但低氧组、运动组ARmRNA和AR蛋白表达的变化不一致。很多研究也有ARmRNA和AR蛋白水平变化不一致的类似报道。在LNCaP、T47D、MDA453等细胞系中，雄激素下调ARmRNA水平的同时，上调AR蛋白表达水平。Douglas A.在研究中发现2～3月龄SD雄性大鼠肛提肌和趾长仲肌中ARmRNA水平相同，但肛提肌中AR蛋白含量明显高于趾长伸肌，推测两种肌肉AR蛋白水平不同可能是AR蛋白翻译效率和转换不同导致的。另有研究推测AR蛋白降解增加可能是AR蛋白水平降低的机理之一：新生期补充雌激素可降低大鼠腹侧前列腺AR蛋白水平，但并不降低ARmRNA水平，雌激素治疗可增加蛋白体介导的AR蛋白水解作用。还有研究提示即使是相同的ARmRNA水平，也可能因为翻译效率不同导致AR蛋白水平不同。综上所述，推测低氧应激对AR表达的调节更多是在翻译水平，而不足在转录环节，考虑低氧一方面抑制AR蛋白翻译，抑制AR蛋白质合成，一方面降低AR蛋白的稳定性，增加AR蛋白的降解，所以在低氧作用下AR蛋白水平是降低的。而ARmRNA在组织中很不稳定、降解快、采点时间单·可能是导致各组之间ARmRNA水平无显著差异的一个主要原因。
28d四组AR蛋白水平的变化趋势与腓肠肌总蛋白含量的变化一致，结合睾酮、ARmRNA、AR蛋白水平、骨骼肌蛋白含量的变化，说明睾酮是通过AR调节骨骼肌蛋白质合成，AR蛋白水平的变化更能反映骨骼肌蛋白质含量的变化。低氧暴露、运动或低氧运动通过改变骨骼肌睾酮水平来调节AR蛋白水平改变，最终影响骨骼肌蛋白质含量。
2.3 急性和慢性低氧、运动对AR与DNA结合能力的影响
如表2所示，1d运动组AR与DNA结合能力明显高于对照组，有显著性差异。如表3所示，28d运动组AR与DNA结合能力明显高于对照组，有非常显著性差异，比低氧组和低氧运动组明显升高，均有显著性差异。1d和28d各组AR与DNA结合能力的变化趋势一致。
1d和28d运动组AR与DNA结合能力明显提高，结合运动组AR蛋白水平升高，说明运动不仅通过改变AR含量，还可通过提高AR活性来调节骨骼肌蛋白质的合成。近年来的研究证明运动可以通过MAPK途径影响AR活性。与运动相关联的生长因子、细胞因子、缺氧、胞内钙离子的变化和机械应力等都可以刺激MAPK信号级联。许多学者的研究从MAPK信号转导途径探讨骨骼肌对运动的适应机制：ERK、JNK和p38MAPK是MAPK途径中三个主要的激酶，有学者的研究显示运动使骨骼肌中D38MAPK和JNK一次性升高，尤其是p38MAPKy的活性明显升高；动物实验和人体实验都表明一过性的耐力和力量训练后，骨骼肌细胞p38MAPK分子被激活；也有研究表明8周的耐力训练使骨骼肌发生适应性改变的同时，骨骼肌中p38MAPK活性明显增高。
有研究指出低氧可激活一些早期反应基因，这些立即的早期反应基因在低氧介导的信号转导中作为第三信使。低氧对这些信号转导途径作用的结果主要是引起酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化水平的改变，从而低氧可引起许多蛋白激酶磷酸化的改变：在大鼠心脏，氧分压降低可激活p38和JNK的活性，在大鼠肝细胞，低氧可激活JNK和ERK的活性。而这些蛋白激酶最终可能通过改变AR共调因子的磷酸化或直接改变AR的磷酸化水平，影响蛋白质的合成。
Soo-Yeon ark等人的研究观察了LNCaP细胞在低氧环境中暴露4h后复氧0、2、6、24h的AR与ARE结合活性的变化。结果显示4h低氧(氧浓度低于0.05％)处理后，LNCaP细胞中AR与ARE结合活性明显提高，在复氧2h时达到最大，然后随时间的推移逐渐下降。细胞被暴露8或16h低氧后复氧2h，观察AR的刺激作用小于低氧处理4h后所看到的最大AR刺激作用。同时还用Western blot和ELISA assav分析观察4h低氧处理后的复氧时间，细胞培养基中PSAmRNA水平、细胞PSA蛋白和PSA分泌明显增加，并且还发现低氧作用于转染了ARE-荧光素酶报告基因的LNCaP细胞后，荧光素酶活性明显提高了。以上两部分研究说明低氧提高了AR的转录激活作用，而且不只限于PSA基因。同时在低氧处理4、8、16h后复氧24h没有观察到AR蛋白水平的任何变化，说明低氧可促进AR的转录激活作用，但并不改变AR的含量。为了进一步证实短暂低氧对AR转录激活作用不仅是在LNCaP细胞，同时又利用人类缺乏AR的DU145前列腺癌细胞，把外源的野生型AR和ARE-荧光素酶一起引入到DU145细胞，进行4h低氧暴露后发现：与LNCaP细胞一致，短暂的低氧暴露激活外源性AR的转录活性，并提高了ARE一荧光素酶的活性，在低氧处理4h后同样观察到低氧对AR的最大刺激作用。总而言之，以上研究结果说明：低氧、复氧的动态变化提高了AR-ARE结合能力和AR靶基因的表达。本实验结果还显示在雄激素衰竭的培养基因中低氧诱导的AR-ARE结合活性完全停止，说明低氧提高AR转录激活是依赖雄激素的，雄激素结合雄激素受体是AR转录激活作用所必需的。低氧可提高AR对低雄激素水平的敏感性，建议在雄激素低于生理水平时，低氧明显刺激AR的转录激活活性。
Ghahr etal 的研究却报道了在进行24h持续低氧暴露后或24h低氧后复氧，LNCaP细胞中PSA和AR蛋白水平均明显降低。作者分析低氧提高AR功能的分子机理在于低氧激活ROS，活化的ROS经由PTK蛋白酪氨酸激酶刺激P13K和MAPK途径，激活的MAPK信号途径可明显提高AR的转录激活活性，低氧产生的ROS可能直接修饰AR的氧化一还原敏感区域，低氧调节共激活因子和抑制因子之间的平衡变化可能也影响AR激活。
本研究中未见28d单纯低氧暴露或运动后低氧暴露比对照组明显提高AR的转录活性，分析原因可能是低氧刺激的浓度较高，机体对低氧逐渐适应的结果。结合28d低氧组和低氧运动组睾酮水平明显降低，但AR蛋白水和AR活性比对照组都没有显著性差异变化，因此可以解释28天低氧组和低氧运动组骨骼肌总蛋白含量相对于对照组没有明显变化。
尽管很多研究建议可能通过不依赖雄激素的途径激活AR促转录活性，但本实验通过观察各组血睾酮、骨骼肌睾酮含量、AR表达和AR活性的变化，证实了AR的转录激活是依赖雄激素的。
3 结论
1)本研究选用的耐力运动模型有效促进骨骼肌蛋白质的合成代谢，在此模型基础上进行低氧暴露模拟高住低训是可行的。2)与运动组相比，28d低氧运动组骨骼睾酮含量、AR含量、AR活性及骨骼肌总蛋白含量均显著降低，说明28d运动后进行低氧暴露比单纯运动通过睾酮-AR含量-AR活性各水平抑制蛋白质合成。3)综合28d四组骨骼肌睾酮含量、AR蛋白水平、AR活性、骨骼肌蛋白含量的变化，说明低氧、运动或低氧运动通过调节睾酮来调节AR，最终影响骨骼肌蛋白含量。
关键词：低氧；运动；睾酮；AR表达；AR与DNA结合能力
中图分类号：G804.2 文献标识码：A 文章编号：1007－3612(2010)04－0039－05
高住低训(Living high-training low HiLo)是美国学者莱文在高原训练基础上提出的一种低氧训练模式，主要用于耐力项目运动员提高有氧运动能力。高住低训期间运动员白天进行耐力训练，肌肉蛋白质分解增加，合成减少，存在蛋白质净降解现象，耐力运动后蛋白质以合成代谢为主，蛋白质合成增强的趋势一直持续到第二天训练之前。高住低训是否可以避免低氧对骨骼肌的负面作用?运动员白天进行耐力训练后，晚上在低氧环境中休息是否抑制骨骼肌蛋白质合成?这些都直接关系到运动员训练后的恢复、运动员力量、速度素质的保持或提高，所以为了全面完整地把握高住低训对机体作用的规律，高住低训，尤其是高住低氧对蛋白质合成的影响是一个亟待探讨的问题。因对运动员实施肌肉活检很困难，所以本研究以大鼠为研究对象，利用一个促进骨骼肌蛋白质合成的耐力运动训练模型，模拟高住低训，观察低氧、低氧运动是否影响雄激素受体(Androgen Receotor AR)含量及其活性，最终影响耐力运动后骨骼肌蛋白质的合成。为了进一步证实低氧、低氧运动对骨骼肌收缩功能的影响本研究还测试了骨骼肌中肌球蛋白重链(Myosin heavy chainMHC)的含量，试图为高住低训期间运动员运动能力和肌肉力量保持和提高提供理论依据。国内外未见高住低训从AR表达和AR转录激活活性等方面对骨骼肌蛋白质合成作用及其机理的研究报道。
1 研究方法
1.1 实验对象与分组 健康雄性、2月龄SD大鼠80只，体重180～200g，随机分为8组：对照组(2组)、低氧组(2组)、运动组(2组)、低氧运动组(2组)，每组各l(只。北京大学医学部实验动物科学部SPF级动物房中饲养，温度22～26℃，湿度30％～58％，自由进食及饮水。
运动组和低氧运动组先进行适应性跑台训练1周，然后进行正式实验4周，各组的生活、运动和低氧暴露方式具体见表1。
1.2 测试样本采集与处理 在实验第1d、第28d各组动物出低氧帐篷后分别用25％乌拉坦麻醉后腹主动脉取血处死，快速取出腿部的腓肠肌，剔除脂肪和筋膜，用预冷的生理盐水洗净，滤纸吸干后称重，投入液氮中保存。
1.3 指标测试方法
1.3.1 骨骼肌睾酮含量 称取40mg的腓肠肌，用眼科小剪迅速剪碎，按1:4的比例加入组织匀浆介质，匀浆20s×3次，匀浆速度为13000转/min，然后40℃，20000转/min离心20min，取上清于-80℃储存待测。
采用北京华英HY-020睾酮放免试剂盒，取标准品和待测样品按照试剂盒的操作步骤进行加样，利用GC-911-r计数仪直接读出样品浓度。
1.3.2 骨骼肌 ARmRNA表达 首先以TrizolTM提取总RNA，M-MLV逆转录酶反转录为cDNA。以genebank上提供的AR mRNA基因序列(序列号：NM-012502)及?-actin mRNA序列(序列号：NM-031144)为模板，以primerpremier5.0软件设计引物，采用TaKaRa Ex Taa(R)R-PCR Version 2.1，在ABI Prism@7300型荧光定量PCR仪上进行扩增。以ABI7300 system software软件对数据进行分析，计算方法使用比较CT法相对定量，目的基因表达量=2。
1.3.3 骨骼肌AR蛋白表达 取40mg骨骼肌组织，以1：4的比例加入细胞裂解缓冲液，冰浴匀浆，测定蛋白浓度。上样鲢40ug/well，浓缩胶60V，1.5h，分离胶90v，2.5h，电冰。JANSSEN LIFE SCIENCES PRODUCTS半干式电转印仪350mA转膜1.5 h。封闭过夜后，与稀释1：500的抗体(AR(N-20)sc-816：Santa Cruz Biotechnology)4mL结合，4℃过夜。与稀释1:3000的二抗(Anti-RabbitIgG/HRP：Dakoeytomation)4mL结合，室温震荡孵育1h。利用ECL显色试剂盒和ImageQuant ECL凝胶成像仪曝光，采集并分析图像。
1.3.4 骨骼肌组织中AR与DNA结合能力 称取肌肉组织40mg，利用美国Pierce公司NE－PER核蛋白抽提试剂盒制备核蛋白抽提物。考马斯亮蓝法进行核蛋白定量。采用特异性的竞争结合实验来证实探针的特异性，探针序列(5’－atagtccatgatgttctcaagat－3’，5’-atcttgagaacatcatggactat-3’)，利用AR(N－20)sc－816(santa Cruz Bioteehnology)进行超级凝胶电泳实验确定结合复合物中AR蛋白的特异性。凝胶电泳迁移率改变分析实验(EMSA)：采用美国Pierce公司LightShift Chemiluminescent EMSA试剂盒和TL-2000紫外交联仪进行核蛋白与探针结合，电泳，显影。利用LAS-3000化学发光及成像系统成像，采集信号。用Molecular Imager FX System软件系统对条带进行灰度分析。
1.3.5 骨骼肌总蛋白质含量 采用PIERCE公司BCA蛋白测试试剂盒，按试剂盒说明进行测试。
1.4 数据统计方法 所有数据均以“平均数±标准差”表示，用spss13.0统计软件进行数据处理，各组之间均数比较用单因素方差分析。P<0.05，显著性差异；P<0.01，非 常显著性差异。
2 结果与分析
2.1 急性和慢性低氧、运动对骨骼肌睾酮浓度和骨骼肌蛋白质总量的影响如表2所示，1d各组大鼠腓肠肌匀浆睾酮浓度之间比较均无显著性差异。如表3所示，28d低氧组腓肠肌睾酮浓度比对照组降低，有显著性差异。
如表2所示，1d各组大鼠骨骼肌总蛋白质含量比较均无显著性差异。如表3所示，28d运动组大鼠的骨骼肌总蛋白质含量比对照组明显升高，有显著性差异，比低氧运动组也明显提高，有显著性差异。
运动组骨骼肌总蛋白质含量的变化反映了机体对28d耐力运动的良好适应，说明本实验所采用的运动模型有效促进肌肉蛋白质的合成代谢，在此模型基础上进行低氧暴露模拟高住低训是可行的。
1d低氧组、运动组、低氧运动组大鼠的骨骼肌总蛋白质含量比对照组均降低，反映了一次低氧应激和一次耐力运动后蛋白质含量有减少的趋势，而低氧运动组是运动后进行低氧暴露，推测运动后低氧进一步抑制蛋白质合成，最终导致蛋白质含量最低。经过28d的慢性适应后，低氧组比对照组略高，说明与一天急性低氧应激相比，28d单纯的间断性低氧暴露对蛋白质含量的影响不大。但与1d低氧运动组类似，28d低氧运动组的骨骼肌总蛋白质含量最低，与运动组相比，说明每天运动后进行低氧暴露还是在一定程度上抑制了蛋白质的合成。
运动后进行低氧暴露降低骨骼肌总蛋白质含量的原因可能是：低氧抑制蛋白质合成、加快蛋白质分解，其中主要是抑制蛋白质合成，可能主要是由于促合成激素的变化或缺氧直接抑制了蛋白质的合成。
低氧暴露可能抑制睾酮合成：长期低氧暴露抑制下丘脑一垂体一性腺轴，抑制睾丸间质细胞内睾酮合成酶的活性，促进糖皮质激素分泌，糖皮质激素在下丘脑一垂体一睾丸三个环节影响睾酮的分泌。有学者报道了2km和5km的慢性连续低氧激活SS，显著抑制GH-IGF-1轴，这种抑制作用一直持续整个低氧过程。
Sandrine等人报道了低氧直接抑制蛋白质合成：大鼠肝细胞在5％氧浓度的低氧环境中孵育120min后，细胞内ATP、RNA和蛋白质合成分别明显降低了62％、82％和93％。Victor R等人测试了大鼠体内心肌、骨骼肌、肝脏、胫骨、皮肤、大脑、肾、肺等各种组织在10％氧浓度中低氧暴露6h后，蛋白质合成速率降低了15％～35％。近几年关于低氧直接抑制蛋白质合成的机理主要集中在蛋白质的翻译环节：低氧通过抑制mRNA翻译的起始步骤而快速抑制蛋白质的合成，低氧抑制翻译是通过两个不同的机理介导的：第一个是通过磷酸化并抑制真核起始因子eIF2a，PERK激酶可磷酸化这个因子；低氧抑制翻译的第二个机理是使第二个真核起始复合物eIF4F失活。低氧使蛋白质合成减少是通过氧传感途径直接抑制mRNA翻译的起始步骤，低氧通过抑制mTOR途径的4E-BPl和eEF2降低蛋白质合成。
2.2 急性和慢性低氧、运动对骨骼肌ARmRNA和AR蛋白表达的影响由表2、3所示，1d和28d各组大鼠骨骼肌ARmRNA水平比较无显著性差异。
由表2所示，1d运动组AR蛋白表达比低氧运动组明显升高，有显著性差异，1d低氧运动组AR蛋白表达的变化和ARmRNA表达的变化一致。由表3所示，28d低氧组AR蛋白表达比运动组明显降低，有非常显著性差异，28d低氧运动组AR蛋白水平明显低于运动组，有显著性差异。
1d运动组AR蛋白表达升高，与1d运动组睾酮的变化一致。有研究报道一次一般力量训练后，大鼠血睾酮出现短暂升高，Ⅱ型肌中AR含量也明显升高17。本研究也证实一次运动可提高AR蛋白水平，可能与一次运动后骨骼肌睾酮含量明显提高有关。28d运动组AR蛋白表达增加，结合28d运动组睾酮和骨骼肌蛋白质含量的变化，分析虽然睾酮没有明显变化，但运动可能是通过AR表达来调节骨骼肌的蛋白质合成，运动组AR蛋白表达升高是骨骼肌蛋白质含量增加的可能作用机制。1d和28d运动均提高AR含量，进一步说明本实验采用的运动模型是促进肌肉蛋白质合成的。
28d低氧组和低氧运动组AR蛋白表达的变化与两组睾酮水平的变化一致。多数研究表明ARmRNA和AR蛋白表达水平主要受睾酮的正向调节，有研究证明去势大鼠或小鼠前列腺ARmRNA和AR蛋白表达减少，DHT治疗去势动物可以恢复AR表达到正常水平。用雄激素处理人体肝癌细胞系和成骨细胞系可升高ARmRNA水平，而去势却降低大鼠海马ARmRNA水平。Doumit等实验证明，T具有明显上调AR的作用，外源性补充睾酮可提高ARm，RNA和AR蛋白表达，DHT处理人造骨细胞系上调ARmRNA表达，明显提高AR数量。在骨骼肌中，由于不同肌肉对雄激素的反应和敏感性不同，在不同肌肉中AR数量有很大差异，但多数研究仍证实在骨骼肌中雄激素正向调节AR的表达：Michel等观察到大鼠去势后，股四头肌AR水平随时间延长显著降低。Lee等研究证明氧雄龙可诱导骨骼肌ARmRNA表达升高。张文栋的研究显示常氧安静组大鼠ARmRNA水平与血清、股四头肌组织睾酮变化趋势一致，提示雄激素正向调节骨骼肌组织中ARmR，NA表达，6周、9周低负荷耐力运动及6周高负荷耐力运动使ARmRNA表达与同期睾酮水平出现一致性升高。作者认为ARmRNA水平升高是运动的作用，还是由于运动引起睾酮水平变化从而上调ARmRNA表达，尚待进一步研究。
结合28d运动组AR表达的变化，低氧组和低氧运动组AR表达明显下降说明低氧抑制AR蛋白水平：Ghafar etal，的研究报道LNCaP细胞在24h持续低氧暴露和24h低氧暴露后复氧均降低AR蛋白水平和AR靶基因PSA水平。但Soo-Yeon的研究发现LNCaP细胞和AU-14细胞在低氧处理4、8、16h后复氧2h均未观察到AR蛋白水平的明显变化。28d低氧组和低氧运动组ARmRNA水平无明显变化，说明低氧明显抑制ARmRNA后的翻译水平或翻泽后修饰等环节，低氧抑制蛋白质翻泽的起始步骤可以用来解释低氧抑制AR蛋白表达水平。低氧组AR蛋白水平最低也说明了28d长期低氧暴露抑制AR蛋白质的合成。28d低氧暴露明显抑制AR蛋白表达的另一个主要原因是睾酮水平下降，睾酮是调节AR水平的一个主要因素，本实验低氧组、低氧运动组睾酮明显降低的同时诱导AR蛋白水平相应降低，说明低氧是通过T-AR途径调节AR表达。
1d低氧运动组AR蛋白表达最低，低于低氧组和对照组，原因可能是一次低氧刺激AR蛋白水平略升高，而运动刺激明显升高AR蛋白水平，当两种刺激相互叠加时，可能由于刺激过度反而明显抑制AR蛋白水平。28 d低氧运动组的AR蛋白表达介于低氧组和运动组之间，说明大鼠对低氧运动在28d中有一个逐渐适应的过程，结合运动组的变化，说明低氧运动组AR蛋白表达明显减低是低氧抑制效应起了 主要作用。
虽然低氧组、低氧运动组睾酮降低正向调节AR蛋白表达，但低氧组、低氧运动组睾酮水平与ARmRNA水平的变化并不一致，类似的研究报道也显示睾酮降低的同时并不影响骨骼肌ARmRNA水平。Marcas观察到人体在一次急性向心或离心运动后，血清睾酮没有升高反而下降，但肌肉中ARmRNA含量却明显升高。Matsakas A等人观察12周跑笼训练对大鼠三种不同骨骼肌(腓肠肌、股外侧肌、比目鱼肌)中ARmRNA表达和血清睾酮的作用，RT-PCR结果显示在任何肌肉中训练组和常氧安静组ARmRNA表达比较均无显著性差异，酶免分析显示与常氧安静组相比，训练组血清睾酮水平显著降低，这些结果显示长期训练使大鼠血清睾酮水平降低，但并不影响骨骼肌中ARmRNA水平。张文栋的研究显示周高负荷耐力常氧运动组股四头肌组织睾酮水平显著降低，而ARmRNA表达仍明显高于常氧安静组，认为9周高负荷常氧运动组强度相对较大，运动时间较长，外周骨骼肌组织摄取和消耗睾酮量增加，引起股四头肌组织睾酮水平降低，为保证骨骼肌组织功能，抑制蛋白降解，ARmRNA表达一定程度代偿性升高，促进AR蛋白合成，是机体一种保护性反应。
虽然Id、28d低氧运动组ARmRNA和AR蛋白表达的变化基本一致，但低氧组、运动组ARmRNA和AR蛋白表达的变化不一致。很多研究也有ARmRNA和AR蛋白水平变化不一致的类似报道。在LNCaP、T47D、MDA453等细胞系中，雄激素下调ARmRNA水平的同时，上调AR蛋白表达水平。Douglas A.在研究中发现2～3月龄SD雄性大鼠肛提肌和趾长仲肌中ARmRNA水平相同，但肛提肌中AR蛋白含量明显高于趾长伸肌，推测两种肌肉AR蛋白水平不同可能是AR蛋白翻译效率和转换不同导致的。另有研究推测AR蛋白降解增加可能是AR蛋白水平降低的机理之一：新生期补充雌激素可降低大鼠腹侧前列腺AR蛋白水平，但并不降低ARmRNA水平，雌激素治疗可增加蛋白体介导的AR蛋白水解作用。还有研究提示即使是相同的ARmRNA水平，也可能因为翻译效率不同导致AR蛋白水平不同。综上所述，推测低氧应激对AR表达的调节更多是在翻译水平，而不足在转录环节，考虑低氧一方面抑制AR蛋白翻译，抑制AR蛋白质合成，一方面降低AR蛋白的稳定性，增加AR蛋白的降解，所以在低氧作用下AR蛋白水平是降低的。而ARmRNA在组织中很不稳定、降解快、采点时间单·可能是导致各组之间ARmRNA水平无显著差异的一个主要原因。
28d四组AR蛋白水平的变化趋势与腓肠肌总蛋白含量的变化一致，结合睾酮、ARmRNA、AR蛋白水平、骨骼肌蛋白含量的变化，说明睾酮是通过AR调节骨骼肌蛋白质合成，AR蛋白水平的变化更能反映骨骼肌蛋白质含量的变化。低氧暴露、运动或低氧运动通过改变骨骼肌睾酮水平来调节AR蛋白水平改变，最终影响骨骼肌蛋白质含量。
2.3 急性和慢性低氧、运动对AR与DNA结合能力的影响
如表2所示，1d运动组AR与DNA结合能力明显高于对照组，有显著性差异。如表3所示，28d运动组AR与DNA结合能力明显高于对照组，有非常显著性差异，比低氧组和低氧运动组明显升高，均有显著性差异。1d和28d各组AR与DNA结合能力的变化趋势一致。
1d和28d运动组AR与DNA结合能力明显提高，结合运动组AR蛋白水平升高，说明运动不仅通过改变AR含量，还可通过提高AR活性来调节骨骼肌蛋白质的合成。近年来的研究证明运动可以通过MAPK途径影响AR活性。与运动相关联的生长因子、细胞因子、缺氧、胞内钙离子的变化和机械应力等都可以刺激MAPK信号级联。许多学者的研究从MAPK信号转导途径探讨骨骼肌对运动的适应机制：ERK、JNK和p38MAPK是MAPK途径中三个主要的激酶，有学者的研究显示运动使骨骼肌中D38MAPK和JNK一次性升高，尤其是p38MAPKy的活性明显升高；动物实验和人体实验都表明一过性的耐力和力量训练后，骨骼肌细胞p38MAPK分子被激活；也有研究表明8周的耐力训练使骨骼肌发生适应性改变的同时，骨骼肌中p38MAPK活性明显增高。
有研究指出低氧可激活一些早期反应基因，这些立即的早期反应基因在低氧介导的信号转导中作为第三信使。低氧对这些信号转导途径作用的结果主要是引起酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化水平的改变，从而低氧可引起许多蛋白激酶磷酸化的改变：在大鼠心脏，氧分压降低可激活p38和JNK的活性，在大鼠肝细胞，低氧可激活JNK和ERK的活性。而这些蛋白激酶最终可能通过改变AR共调因子的磷酸化或直接改变AR的磷酸化水平，影响蛋白质的合成。
Soo-Yeon ark等人的研究观察了LNCaP细胞在低氧环境中暴露4h后复氧0、2、6、24h的AR与ARE结合活性的变化。结果显示4h低氧(氧浓度低于0.05％)处理后，LNCaP细胞中AR与ARE结合活性明显提高，在复氧2h时达到最大，然后随时间的推移逐渐下降。细胞被暴露8或16h低氧后复氧2h，观察AR的刺激作用小于低氧处理4h后所看到的最大AR刺激作用。同时还用Western blot和ELISA assav分析观察4h低氧处理后的复氧时间，细胞培养基中PSAmRNA水平、细胞PSA蛋白和PSA分泌明显增加，并且还发现低氧作用于转染了ARE-荧光素酶报告基因的LNCaP细胞后，荧光素酶活性明显提高了。以上两部分研究说明低氧提高了AR的转录激活作用，而且不只限于PSA基因。同时在低氧处理4、8、16h后复氧24h没有观察到AR蛋白水平的任何变化，说明低氧可促进AR的转录激活作用，但并不改变AR的含量。为了进一步证实短暂低氧对AR转录激活作用不仅是在LNCaP细胞，同时又利用人类缺乏AR的DU145前列腺癌细胞，把外源的野生型AR和ARE-荧光素酶一起引入到DU145细胞，进行4h低氧暴露后发现：与LNCaP细胞一致，短暂的低氧暴露激活外源性AR的转录活性，并提高了ARE一荧光素酶的活性，在低氧处理4h后同样观察到低氧对AR的最大刺激作用。总而言之，以上研究结果说明：低氧、复氧的动态变化提高了AR-ARE结合能力和AR靶基因的表达。本实验结果还显示在雄激素衰竭的培养基因中低氧诱导的AR-ARE结合活性完全停止，说明低氧提高AR转录激活是依赖雄激素的，雄激素结合雄激素受体是AR转录激活作用所必需的。低氧可提高AR对低雄激素水平的敏感性，建议在雄激素低于生理水平时，低氧明显刺激AR的转录激活活性。
Ghahr etal 的研究却报道了在进行24h持续低氧暴露后或24h低氧后复氧，LNCaP细胞中PSA和AR蛋白水平均明显降低。作者分析低氧提高AR功能的分子机理在于低氧激活ROS，活化的ROS经由PTK蛋白酪氨酸激酶刺激P13K和MAPK途径，激活的MAPK信号途径可明显提高AR的转录激活活性，低氧产生的ROS可能直接修饰AR的氧化一还原敏感区域，低氧调节共激活因子和抑制因子之间的平衡变化可能也影响AR激活。
本研究中未见28d单纯低氧暴露或运动后低氧暴露比对照组明显提高AR的转录活性，分析原因可能是低氧刺激的浓度较高，机体对低氧逐渐适应的结果。结合28d低氧组和低氧运动组睾酮水平明显降低，但AR蛋白水和AR活性比对照组都没有显著性差异变化，因此可以解释28天低氧组和低氧运动组骨骼肌总蛋白含量相对于对照组没有明显变化。
尽管很多研究建议可能通过不依赖雄激素的途径激活AR促转录活性，但本实验通过观察各组血睾酮、骨骼肌睾酮含量、AR表达和AR活性的变化，证实了AR的转录激活是依赖雄激素的。
3 结论
1)本研究选用的耐力运动模型有效促进骨骼肌蛋白质的合成代谢，在此模型基础上进行低氧暴露模拟高住低训是可行的。2)与运动组相比，28d低氧运动组骨骼睾酮含量、AR含量、AR活性及骨骼肌总蛋白含量均显著降低，说明28d运动后进行低氧暴露比单纯运动通过睾酮-AR含量-AR活性各水平抑制蛋白质合成。3)综合28d四组骨骼肌睾酮含量、AR蛋白水平、AR活性、骨骼肌蛋白含量的变化，说明低氧、运动或低氧运动通过调节睾酮来调节AR，最终影响骨骼肌蛋白含量。