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摘 要：利用小麦成熟胚脱分化基因芯片对脱分化过程中MADS-box家族基因的表达变化进行研究，检测到MADS-box家族转录因子基因及其靶基因共19个，上调表达基因3个，下调表达基因12个，混合表达基因4个，其中，CA730918、CK213813、BE417035、BJ276784、CA726603可能在小麦脱分化过程中意义重大。利用半定量RT-PCR技术对CA670406、CK213813、CA679889、AB107992和BJ228622基因的表达变化进行验证，结果与基因芯片检测结果相似。
关键词：MADS-box家族；转录因子基因；脱分化；基因芯片
MADS-box名称来源于4种MADS-box基因的首字母[1]，这4种基因分别为酵母的MCM1[2]，拟南芥的AG[3]，金鱼草中的DEFICIENS[4]和人类的SRF[5]。MADS盒与识别特异的DNA序列有关，编码该区域的基因被统称为MADS-box基因[6，7]。MADS-box基因是一类序列特异的调节基因家族，它编码的MADS-box蛋白为转录因子，主要功能是激活或抑制基因的转录反应。近年来，人们对小麦MADS-box基因功能的研究逐渐增多。研究发现，TaVRT-1具有调节小麦营养生长向生殖生长转变的功能，该基因Vrn-1区域与春化处理和耐冬性有关，在春化诱导的植物中表达[8]。WAG是小麦中分离出的一个与AG同源异型的基因，该基因在幼穗中表达水平低，随着穗的发育逐步增加，在孕穗期到抽穗期表达水平最高[9]。随着研究的深入，部分基因已被克隆出来。人们从小麦中分离出两个与心皮化有关的基因WPI1和WPI2，这两个基因在小花的浆片原基和雄蕊原基中表达[10]。Yan等克隆了两个与开花结实相关的基因VRN1和VRN2[11，12]，其功能分别类似于拟南芥分生组织基因AP1和AGL2。尽管对小麦MADS-box基因的研究逐渐增多，但其在成熟胚脱分化过程中的研究尚未见报道。
本试验对小麦成熟胚进行脱分化处理，利用基因芯片技术检测了脱分化期间部分MADS-box转录因子基因及其调控基因的表达状况，并对基因芯片的可靠性进行验证，为探索MADS-box基因在小麦成熟胚脱分化过程中的作用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料处理
在超净工作台上，剥取普通小麦品种豫麦18成熟胚，置于MS+2，4-D（2 mg/L）培养基上培养[13]，根据小麦成熟胚脱分化过程中外部形态和内部结构的变化，分别于脱分化0、2、6、12、24、72 h时取样，液氮处理后-80℃保存备用。
1.2 总RNA提取与纯化
按Invitrogen公司的Trizol试剂盒使用说明提取总RNA，并用QIAGEN公司的RNeasy mini试剂盒纯化，1%琼脂糖凝胶电泳（180 V，0.5 h）检测总RNA的28S和18S比例（亮度约为2∶1时提取效果最好），260/280 nm波长下测定总RNA的吸光值，计算其浓度和纯度。
1.3 基因芯片检测
1.3.1 cDNA和cRNA的合成及纯化 合成cDNA时，总RNA模板量为1～8 μg；合成生物素标记的cRNA时，取12 μl上述cDNA溶液为模板。cDNA、cRNA的纯化按基因芯片分析样品纯化操作程序进行[14]。两者的浓度、纯度和质量检测方法同上。
1.3.2 cRNA片段化和杂交 取15 μl浓度为1 μg/μl的cRNA，加6 μl 5×片段化Buffer和9 μl RNase-free水混匀，94℃温浴35 min，得到长度为35～200 bp的cRNA片段。按Affymetrix公司提供的配方配制杂交液，将杂交液加至经预杂交处理的Affymetrix Wheat Gene Chip中，45℃、60 r/min杂交16 h，吸去杂交液，用Gene Chip全自动洗涤工作站450（Affymetrix 公司，USA）对芯片进行洗涤和染色芯片。
1.3.3 芯片检测参数的获取 高分辨芯片扫描仪3000（Affymetrix公司，USA）扫描芯片，获得基因表达信号值[15]。用GCOS1.2软件读取、处理信号值数据，获得归一化后的信号值、信号检出（P， A， M）以及试验组和对照组的比值。
1.3.4 MADS-box家族基因的确认 利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、DATF（http：//datf.cbi.pku.edu.cn/）和DRTF（http：//drtf.cbi.pku.edu.cn/）等网站拟南芥和水稻等植物数据库查找MADS-box家族基因名称，然后在小麦基因芯片上查找对应的名称，并获取各点的荧光信号值。以不同时间点的表达信号值除以0 h表达信号值（对照）并取以 2 为底的对数，对数值≤-1或≥1 为有意义下调或上调差异表达。根据基因的序列同源性，利用 NCBI 网站在线 BLAST 分析工具对本试验所获得的基因进行分类。
1.4 半定量 RT-PCR验证
为了验证基因芯片数据的可靠性，将1.2中提取的RNA反转录成cDNA，以β-actin为内参对CA670406等5个基因进行半定量 RT-PCR验证。PCR条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55～57℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。引物设计及产物长度如下：
2 结果与分析
2.1 MADS-box转录因子基因及其靶基因的表达变化
2.1.1 PI转录因子基因及其靶基因 在小麦成熟胚脱分化过程中，检测到编码花器官相关转录因子PI （PISTILLATA protein）的基因及其2个编码小麦心皮蛋白（PISTILLATA-like protein）的靶基因WPI1 （AB107991）和WPI2 （AB107992）。如图1，PI转录因子基因在2、12～24 h有意义下调表达；AB107992在2 h时下调幅度最大，为对照的6.49倍。推测在小麦成熟胚脱分化过程中PI转录因子基因及其靶基因起抑制作用。 2.1.2 AGL9转录因子基因及其靶基因 在小麦成熟胚脱分化过程中（图1），发现编码调节外界信号反应蛋白（MADS-box protein） AGL9的3个基因，1个（BJ276784）上调表达，1个（CA726603）下调表达，1个（CD374109）先上调后下调，其中，CA726603下调幅度最大值为对照的21.11倍。靶基因AG（CA658343）的表达趋势与CD374109相反，在12 h下调为对照的4.59倍，在72 h转成上调，调节倍数为对照的4.20倍。靶基因FBP2编码果糖-1，6-二磷酸酶（Fructose-1，6-bisphosphatase），有CA686703和CD894372两个成员，其中，CA686703在2～12 h下调，在24～72 h转成上调。由此推测，转录因子基因CD374109对其靶基因CA658343和CA686703可能有抑制作用。
2.1.3 CO转录因子基因及其靶基因 在小麦成熟胚脱分化过程中，发现编码开花时空相关转录因子CO（Putative zinc-finger protein）的4个基因（图1），3个（CA730918、CA670406、BG906984）在2～72 h下调，其中，CA730918在各个时期下调幅度最大，最大值是对照的84.45倍，推测CA730918在脱分化过程中抑制作用最强。靶基因LFY（CD911368）在6～12 h有意义下调。推测，在小麦脱分化过程中CA730918对其靶基因CD911368可能具有一定的促进作用。
2.1.4 AG转录因子基因及其靶基因 在小麦成熟胚脱分化过程中（图1），1个编码调控雄蕊和心皮、花分生组织发育的转录因子AG（Floral homeotic protein）的基因CA658343在2～24 h下调，在72 h上调。靶基因SPT具有独立促进心皮分化的功能，其中2个（CK213813、BE417035）在2～72 h上调表达趋势呈抛物线状，在12 h达到最大值，为对照的16倍；2个（BJ272559、CA608865）下调表达，下调幅度小。
2.2 半定量RT-PCR检测
为了对基因芯片数据的可靠性进行验证，按照芯片数据信号值高低从MADS-box家族基因中选取CA670406、CK213813、CA679889、AB107992和BJ228622 5个基因进行半定量RT-PCR检测，结果见图2。将检测结果与基因芯片结果比较可知，Affymetrix小麦基因芯片数据相对可靠。
3 讨论
已有的研究结果显示，MADS-box家族基因生物学功能非常丰富，按调节部位不同可分为花分生组织分化基因、花器官基因、成花计时基因、外界信号传导基因以及根、叶调控等基因，这些基因仅在植物发育过程中的分化部位进行调控。本文利用Affymetrix小麦基因芯片首次研究了小麦成熟胚脱分化过程中19个MADS-box家族基因的表达变化，其中，3个基因上调表达，12个基因下调表达，4个基因混合表达，一方面表明MADS-box家族基因的生物学功能具有双重性，可在与分化过程相反的脱分化过程中进行调控；另一方面表明脱分化过程是一个众多基因参与的复杂的调控过程。本研究发现，CA730918、CK213813、BE417035、BJ276784、CA726603等基因在小麦成熟胚脱分化过程中表达强度变化较大，上调值最大达到对照的16倍，下调值最大达到对照的84.45倍，推测这些基因在小麦的脱分化过程中意义重大，这为进一步揭示小麦成熟胚脱分化过程的调控机理提供依据。
参 考 文 献：
[1] 胡丽芳， 金志强， 徐碧玉. MADS-box基因对花的发育及开花早晚的影响[J]. 生命科学研究， 2004， 8：7-12.
[2] Messenguy F， Dubois E. Role of MADS-box proteins and their cofactors in combinatorial control of gene expression and cell development [J]. Gene， 2003， 316：1-21.
[3] Yanofsky M F， Ma H， Bowman J L， et al. The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription factors [J]. Nature， 1990， 346（6279）：35-39.
[4] Sommer H， Beltron J P， Huijser P， et al. Deficiens， a homeotic gene involved in the control of flower morphogenesis in Antirrhinum majus： the protein shows homology to transcription factors[J]. EMBO J.， 1990， 9（3）：605-613.
[5] Norman C， Runswick M， Pollock R， et al. Isolation and properties of cDNA clone encoding SRF， a transcription factor that binds to the c-fos serum response element [J]. Cell， 1988， 55（6）：989-1003.
[6] Alvarez-Buylla E R， Liljegren S J， Pelaz S， et al. MADS-box gene evolution beyond flowers： expression in pollen， endosperm， guard cell， and trichomes [J]. Plant J.， 2000， 24（4）：457-466. [7] De Bodt S， Raes J， Florquin K， et al. Genomewide structural annotation and evolutionary analysis of the type I MADS-box genes in plants[J]. J. Mol. Evol.， 2003， 56（5）：573-586.
[8] Danyluk J， Kane N A， Breton G， et al. TaVRT-1， a putative transcription factor associated with egetative to reproductive transition in cereals [J]. Plant Physiol.， 2003， 132（4）： 1849-1860.
[9] Meguro A， Takumi S， Ogihara Y， et al. WAG， a wheat AGAMOUS homolog， is associated with development of pistil-like stamens in alloplasmic wheats[J]. Sexual Plant Reproduction， 2003，15（5）：221-230.
[10]Hama E， Takumi S， Ogihara Y， et al. Pistillody is caused by alterations to the class-B MADS-box gene expression pattern in alloplasmic wheats[J]. Planta， 2004， 218（5）： 712-720.
[11]Yan L L， Loukoianov A， Tranquilli G， et al. Positional cloning of the wheat vernalization gene VRN1[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.， 2003， 100（10）： 6263-6268.
[12]Yan L L， Loukoianov A， Blechl A， et al. The wheat VRN2 gene is a flowering repressor down-regulated by vernalization[J]. Science， 2004， 303（5664）：1640-1644.
[13]Chen J Y， Yue R Q， Xu H X， et al. Study on plant regeneration of wheat mature embryos under endosperm supported culture [J]. Agricultural Sciences in China， 2006， 5（8）： 572-578.
[14]Li L， Roden J， Shapiro B E， et al. Reproducibility， fidelity， and discriminant validity of mRNA amplification for microarray analysis from primary hematopoietic cells[J].Journal of Molecular Diagnostics， 2005， 7（1）： 48-56.
[15]Collins J F. Gene chip analyses reveal differential genetic responses to iron deficiency in rat duodenum and jejunum [J]. Biological Research， 2006， 39（1）： 25-37.
关键词：MADS-box家族；转录因子基因；脱分化；基因芯片
MADS-box名称来源于4种MADS-box基因的首字母[1]，这4种基因分别为酵母的MCM1[2]，拟南芥的AG[3]，金鱼草中的DEFICIENS[4]和人类的SRF[5]。MADS盒与识别特异的DNA序列有关，编码该区域的基因被统称为MADS-box基因[6，7]。MADS-box基因是一类序列特异的调节基因家族，它编码的MADS-box蛋白为转录因子，主要功能是激活或抑制基因的转录反应。近年来，人们对小麦MADS-box基因功能的研究逐渐增多。研究发现，TaVRT-1具有调节小麦营养生长向生殖生长转变的功能，该基因Vrn-1区域与春化处理和耐冬性有关，在春化诱导的植物中表达[8]。WAG是小麦中分离出的一个与AG同源异型的基因，该基因在幼穗中表达水平低，随着穗的发育逐步增加，在孕穗期到抽穗期表达水平最高[9]。随着研究的深入，部分基因已被克隆出来。人们从小麦中分离出两个与心皮化有关的基因WPI1和WPI2，这两个基因在小花的浆片原基和雄蕊原基中表达[10]。Yan等克隆了两个与开花结实相关的基因VRN1和VRN2[11，12]，其功能分别类似于拟南芥分生组织基因AP1和AGL2。尽管对小麦MADS-box基因的研究逐渐增多，但其在成熟胚脱分化过程中的研究尚未见报道。
本试验对小麦成熟胚进行脱分化处理，利用基因芯片技术检测了脱分化期间部分MADS-box转录因子基因及其调控基因的表达状况，并对基因芯片的可靠性进行验证，为探索MADS-box基因在小麦成熟胚脱分化过程中的作用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料处理
在超净工作台上，剥取普通小麦品种豫麦18成熟胚，置于MS+2，4-D（2 mg/L）培养基上培养[13]，根据小麦成熟胚脱分化过程中外部形态和内部结构的变化，分别于脱分化0、2、6、12、24、72 h时取样，液氮处理后-80℃保存备用。
1.2 总RNA提取与纯化
按Invitrogen公司的Trizol试剂盒使用说明提取总RNA，并用QIAGEN公司的RNeasy mini试剂盒纯化，1%琼脂糖凝胶电泳（180 V，0.5 h）检测总RNA的28S和18S比例（亮度约为2∶1时提取效果最好），260/280 nm波长下测定总RNA的吸光值，计算其浓度和纯度。
1.3 基因芯片检测
1.3.1 cDNA和cRNA的合成及纯化 合成cDNA时，总RNA模板量为1～8 μg；合成生物素标记的cRNA时，取12 μl上述cDNA溶液为模板。cDNA、cRNA的纯化按基因芯片分析样品纯化操作程序进行[14]。两者的浓度、纯度和质量检测方法同上。
1.3.2 cRNA片段化和杂交 取15 μl浓度为1 μg/μl的cRNA，加6 μl 5×片段化Buffer和9 μl RNase-free水混匀，94℃温浴35 min，得到长度为35～200 bp的cRNA片段。按Affymetrix公司提供的配方配制杂交液，将杂交液加至经预杂交处理的Affymetrix Wheat Gene Chip中，45℃、60 r/min杂交16 h，吸去杂交液，用Gene Chip全自动洗涤工作站450（Affymetrix 公司，USA）对芯片进行洗涤和染色芯片。
1.3.3 芯片检测参数的获取 高分辨芯片扫描仪3000（Affymetrix公司，USA）扫描芯片，获得基因表达信号值[15]。用GCOS1.2软件读取、处理信号值数据，获得归一化后的信号值、信号检出（P， A， M）以及试验组和对照组的比值。
1.3.4 MADS-box家族基因的确认 利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、DATF（http：//datf.cbi.pku.edu.cn/）和DRTF（http：//drtf.cbi.pku.edu.cn/）等网站拟南芥和水稻等植物数据库查找MADS-box家族基因名称，然后在小麦基因芯片上查找对应的名称，并获取各点的荧光信号值。以不同时间点的表达信号值除以0 h表达信号值（对照）并取以 2 为底的对数，对数值≤-1或≥1 为有意义下调或上调差异表达。根据基因的序列同源性，利用 NCBI 网站在线 BLAST 分析工具对本试验所获得的基因进行分类。
1.4 半定量 RT-PCR验证
为了验证基因芯片数据的可靠性，将1.2中提取的RNA反转录成cDNA，以β-actin为内参对CA670406等5个基因进行半定量 RT-PCR验证。PCR条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55～57℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。引物设计及产物长度如下：
2 结果与分析
2.1 MADS-box转录因子基因及其靶基因的表达变化
2.1.1 PI转录因子基因及其靶基因 在小麦成熟胚脱分化过程中，检测到编码花器官相关转录因子PI （PISTILLATA protein）的基因及其2个编码小麦心皮蛋白（PISTILLATA-like protein）的靶基因WPI1 （AB107991）和WPI2 （AB107992）。如图1，PI转录因子基因在2、12～24 h有意义下调表达；AB107992在2 h时下调幅度最大，为对照的6.49倍。推测在小麦成熟胚脱分化过程中PI转录因子基因及其靶基因起抑制作用。 2.1.2 AGL9转录因子基因及其靶基因 在小麦成熟胚脱分化过程中（图1），发现编码调节外界信号反应蛋白（MADS-box protein） AGL9的3个基因，1个（BJ276784）上调表达，1个（CA726603）下调表达，1个（CD374109）先上调后下调，其中，CA726603下调幅度最大值为对照的21.11倍。靶基因AG（CA658343）的表达趋势与CD374109相反，在12 h下调为对照的4.59倍，在72 h转成上调，调节倍数为对照的4.20倍。靶基因FBP2编码果糖-1，6-二磷酸酶（Fructose-1，6-bisphosphatase），有CA686703和CD894372两个成员，其中，CA686703在2～12 h下调，在24～72 h转成上调。由此推测，转录因子基因CD374109对其靶基因CA658343和CA686703可能有抑制作用。
2.1.3 CO转录因子基因及其靶基因 在小麦成熟胚脱分化过程中，发现编码开花时空相关转录因子CO（Putative zinc-finger protein）的4个基因（图1），3个（CA730918、CA670406、BG906984）在2～72 h下调，其中，CA730918在各个时期下调幅度最大，最大值是对照的84.45倍，推测CA730918在脱分化过程中抑制作用最强。靶基因LFY（CD911368）在6～12 h有意义下调。推测，在小麦脱分化过程中CA730918对其靶基因CD911368可能具有一定的促进作用。
2.1.4 AG转录因子基因及其靶基因 在小麦成熟胚脱分化过程中（图1），1个编码调控雄蕊和心皮、花分生组织发育的转录因子AG（Floral homeotic protein）的基因CA658343在2～24 h下调，在72 h上调。靶基因SPT具有独立促进心皮分化的功能，其中2个（CK213813、BE417035）在2～72 h上调表达趋势呈抛物线状，在12 h达到最大值，为对照的16倍；2个（BJ272559、CA608865）下调表达，下调幅度小。
2.2 半定量RT-PCR检测
为了对基因芯片数据的可靠性进行验证，按照芯片数据信号值高低从MADS-box家族基因中选取CA670406、CK213813、CA679889、AB107992和BJ228622 5个基因进行半定量RT-PCR检测，结果见图2。将检测结果与基因芯片结果比较可知，Affymetrix小麦基因芯片数据相对可靠。
3 讨论
已有的研究结果显示，MADS-box家族基因生物学功能非常丰富，按调节部位不同可分为花分生组织分化基因、花器官基因、成花计时基因、外界信号传导基因以及根、叶调控等基因，这些基因仅在植物发育过程中的分化部位进行调控。本文利用Affymetrix小麦基因芯片首次研究了小麦成熟胚脱分化过程中19个MADS-box家族基因的表达变化，其中，3个基因上调表达，12个基因下调表达，4个基因混合表达，一方面表明MADS-box家族基因的生物学功能具有双重性，可在与分化过程相反的脱分化过程中进行调控；另一方面表明脱分化过程是一个众多基因参与的复杂的调控过程。本研究发现，CA730918、CK213813、BE417035、BJ276784、CA726603等基因在小麦成熟胚脱分化过程中表达强度变化较大，上调值最大达到对照的16倍，下调值最大达到对照的84.45倍，推测这些基因在小麦的脱分化过程中意义重大，这为进一步揭示小麦成熟胚脱分化过程的调控机理提供依据。
参 考 文 献：
[1] 胡丽芳， 金志强， 徐碧玉. MADS-box基因对花的发育及开花早晚的影响[J]. 生命科学研究， 2004， 8：7-12.
[2] Messenguy F， Dubois E. Role of MADS-box proteins and their cofactors in combinatorial control of gene expression and cell development [J]. Gene， 2003， 316：1-21.
[3] Yanofsky M F， Ma H， Bowman J L， et al. The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription factors [J]. Nature， 1990， 346（6279）：35-39.
[4] Sommer H， Beltron J P， Huijser P， et al. Deficiens， a homeotic gene involved in the control of flower morphogenesis in Antirrhinum majus： the protein shows homology to transcription factors[J]. EMBO J.， 1990， 9（3）：605-613.
[5] Norman C， Runswick M， Pollock R， et al. Isolation and properties of cDNA clone encoding SRF， a transcription factor that binds to the c-fos serum response element [J]. Cell， 1988， 55（6）：989-1003.
[6] Alvarez-Buylla E R， Liljegren S J， Pelaz S， et al. MADS-box gene evolution beyond flowers： expression in pollen， endosperm， guard cell， and trichomes [J]. Plant J.， 2000， 24（4）：457-466. [7] De Bodt S， Raes J， Florquin K， et al. Genomewide structural annotation and evolutionary analysis of the type I MADS-box genes in plants[J]. J. Mol. Evol.， 2003， 56（5）：573-586.
[8] Danyluk J， Kane N A， Breton G， et al. TaVRT-1， a putative transcription factor associated with egetative to reproductive transition in cereals [J]. Plant Physiol.， 2003， 132（4）： 1849-1860.
[9] Meguro A， Takumi S， Ogihara Y， et al. WAG， a wheat AGAMOUS homolog， is associated with development of pistil-like stamens in alloplasmic wheats[J]. Sexual Plant Reproduction， 2003，15（5）：221-230.
[10]Hama E， Takumi S， Ogihara Y， et al. Pistillody is caused by alterations to the class-B MADS-box gene expression pattern in alloplasmic wheats[J]. Planta， 2004， 218（5）： 712-720.
[11]Yan L L， Loukoianov A， Tranquilli G， et al. Positional cloning of the wheat vernalization gene VRN1[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.， 2003， 100（10）： 6263-6268.
[12]Yan L L， Loukoianov A， Blechl A， et al. The wheat VRN2 gene is a flowering repressor down-regulated by vernalization[J]. Science， 2004， 303（5664）：1640-1644.
[13]Chen J Y， Yue R Q， Xu H X， et al. Study on plant regeneration of wheat mature embryos under endosperm supported culture [J]. Agricultural Sciences in China， 2006， 5（8）： 572-578.
[14]Li L， Roden J， Shapiro B E， et al. Reproducibility， fidelity， and discriminant validity of mRNA amplification for microarray analysis from primary hematopoietic cells[J].Journal of Molecular Diagnostics， 2005， 7（1）： 48-56.
[15]Collins J F. Gene chip analyses reveal differential genetic responses to iron deficiency in rat duodenum and jejunum [J]. Biological Research， 2006， 39（1）： 25-37.