【摘 要】
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利用兼并引物从西维因单克隆杂交瘤细胞的cDNA中克隆得到抗体基因的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),长度分别为324bp和360bp,将其分别连接入pGEM-T-Easy载体进行测序;根据测
【机 构】
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食品营养与安全省部共建教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,
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利用兼并引物从西维因单克隆杂交瘤细胞的cDNA中克隆得到抗体基因的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),长度分别为324bp和360bp,将其分别连接入pGEM-T-Easy载体进行测序;根据测序结果设计特异性引物和连接序列(Gly4Ser)3,利用重叠延伸PCR扩增得到长度为729bp的单链抗体基因片段(scFv),亚克隆至原核表达载体pET30a(+),并转化感受态细胞BL21(DE3)进行诱导表达;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,重组表达单链抗体形成包涵体,分子量大小约为33kDa,变性后利用不同条件进行复性,结果显示最佳复性时间为48h,最佳起始蛋白浓度为200μg/mL,含有精氨酸的复性液效果最佳;利用亲和层析纯化scFv,并利用竞争ELISA检测其活性,结果显示该scFv对西维因具有良好的亲和性和特异性。
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