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背景:内皮祖细胞移植在缺血性心脑血管疾病、创伤愈合等血管类疾病的治疗中展现出广泛的应用前景,目前内皮祖细胞在肺部疾病的研究还比较少。目的:分离和诱导培养骨髓来源的内皮祖细胞,并进行鉴定;经气管移植,观察内皮祖细胞的定位。设计、时间及地点:细胞体外培养和体内移植实验,于2008-05/2009-04在中南大学湘雅二医院中心实验室完成。材料:6周龄C57BL/6J小鼠17只,随机数字表法分为5只供体,10只受体,2只供细胞双荧光染色、免疫细胞化学实验。方法:冲洗小鼠长骨骨髓,用密度梯度离心法收集单个核细胞层,内皮细胞培养液EGM-2MV培养,观察细胞形态,将培养第7天内皮祖细胞与DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白37℃孵育4h,以检测内皮祖细胞对DiI-乙酰化低密度脂蛋白的摄取,再用20g/L多聚甲醛固定细胞10min,固定后用PBS浸洗,将FITC标记的凝集素Ⅰ加入上述标本,37℃孵育1h,PBS浸洗,通过激光共聚焦显微镜鉴定FITC-凝集素Ⅰ和DiI-乙酰化低密度脂蛋白。主要观察指标:将标记CM-DiI的内皮祖细胞经气管注入小鼠体内,10d后观察其在体内的定位。免疫组织化学方法检测细胞血管性血友病因子阳性率。移植后内皮祖细胞在体内的定位。结果:贴壁细胞呈现类圆形、纺锤形或多边形,7～14d可见部分贴壁细胞生长呈"铺路石"样外观。胞浆摄取DiI-乙酰化低密度脂蛋白,显示红色,胞膜结合FITC-凝集素Ⅰ,显示绿色,双染色阳性细胞为黄色,为正在分化的内皮祖细胞,双阳性细胞达90%以上,血管性血友病因子阳性率90%以上。经气管移植后标记CM-DiI的内皮祖细胞可定位至肺内气管、血管及肾、脾血管。结论:用密度梯度离心法在EGM-2MV培养体系下可以获得较高纯度的内皮祖细胞,该细胞气管移植后可定位至肺内气管、血管及肾、脾血管。