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【摘要】 目的 探讨生长激素(growth hormone,GH)对离体培养的大鼠胫骨生长板的软骨细胞Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ,ColⅡ)表达的影响。方法 采用两步酶消化法分离培养5~8只三周龄大鼠生长板的软骨细胞,用RTPCR和免疫组化的方法分别检测不同浓度GH对软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达。结果 GH能促进软骨细胞ColⅡ的表达并呈浓度依赖性,GH在10~500 ng/ml之间能促进ColⅡ的表达,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),并且以100 ng/ml时表达最强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡ表达的效应逐渐减弱,1000 ng/ml与对照组比较无差异(P>0.05)。结论 GH通过促进软骨细胞ColⅡ的表达能维持软骨细胞的表型,GH在使用过程中不会导致骨龄的增加。
【关键词】
软骨细胞;生长板;生长激素;Ⅱ型胶原
Effect of growth hormone on the expression of collagen Ⅱ of cultured growth plate chondrocytes of rats
PAN Sinian,ZHANG Chengxi.Department of Pediatrics,The Third Hospital Affiliated to Zhongshan University,Guangzhou 510630,China
【Abstract】 Objective To observe the effect of growth hormone on the expression of collagen Ⅱ of cultured growth plate chondrocytes of rats.Methods Primary chondrocytes from tibial growth plate of 5~8rats by trypsincollagenase digestion were cultured in monolayer.RTPCR and immunocytochemistry were performed to investigate the expression of collagen Ⅱ at the mRNAand protein level,respectively with different concentrations of GH.Results GHenhances the expression of collagen Ⅱ of chondrocytes in vitro in a concentrationdependent fashion.The expression of collagen Ⅱwas obviously between the GH concentration of 10 ng/ml and 500 ng/ml(P<0.05),maximally at the concentration of 100 ng/ml,and decreased again after higher concentration of GH.There was no significant difference between 1000 ng/ml group and control group(P>0.05).Conclusion GH can maintain the phenotype of chondrocytes by enhancing the expression of collagen Ⅱand it will not increase the bone age during clinical practice.
【Key words】
Chondrocyte;Epiphyseal growth plate;Growth hormone;Collagen Ⅱ
生長激素(growth hormone,GH)被广泛用于儿童生长障碍性疾病,它能改善这些患儿的成年身高。然而,GH对生长板软骨细胞的作用机制目前尚未阐明,目前国内外有关GH对离体培养软骨细胞作用的报道均较少。本文拟通过体外培养大鼠胫骨生长板的软骨细胞来探讨GH对软骨细胞胶原Ⅱ表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 正常三周龄SpragueDawley(SD)大鼠,清洁级,雌雄不限,体质量40~50 g之间由中山大学实验动物中心提供。
1.2 主要试剂 重组人生长激素(rhGH,为CYTOLAB/PEPROTECH ASIA 产品,Israel)、DMEM/F12(1:1)培养基(Sigma)、胎牛血清(FBS,Gibco)、胰蛋白酶(1:250,AMREsCo)、Ⅱ型胶原酶、琼脂糖(Invitrogen)、SP和DAB显色试剂盒(福州迈新)、兔抗大鼠Ⅱ型胶原一抗(Neomarker)、Trizol Reagent、逆转录试剂盒和Taq酶(Toyobo)。
1.3 大鼠胫骨生长板软骨细胞的培养 将5~8只大鼠处死后在超净工作台上无菌取出胫骨近段,从骨软骨连接处分离出生长板软骨,仔细去除胫骨外的肌肉和骨膜,将软骨块剪成1 mm3大小,采用两步酶消化法(0.25%胰蛋白酶EDTA消化30 min、0.2%Ⅱ型胶原酶消化3 h)消化后,收集细胞并记数,台盼蓝试验测定细胞活性后,将软骨细胞按5×105个细胞/瓶的密度将上述细胞悬液接种于25 cm2的培养瓶中,在37℃、5%CO2、饱和湿度95%的培养箱中培养。
1.4 实验分组 实验设8组,对照组和浓度分别为10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml、1000 ng/ml的GH组,每组设3个重复。
1.5 RTPCR测软骨细胞Ⅱ型胶原的表达 常规培养48 h后,换含0.02%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行细胞饥饿24 h后,加入不同浓度的GH,作用24 h后采用Trizol裂解软骨细胞,提取总RNA,使用Toyobo公司的两步法进行RTPCR反应,ColⅡ引物序列为:上游引物5’GAAGCACATCTGGTTTGGAG3’,下游引物5’TTGGGGTTGAGGGTTTTACA3’,扩增片段长度为448 bp;内参照βactin引物序为:上游引物5’AGCCATGTACGTAGCCATCC3’,下游引物5’GTGGTGGTGAAGCTGTAGC3’,扩增片段长度为219 bp。反转录反应条件:42℃60 min,99℃5 min,4℃5 min,PCR反应条件:94℃5 min,94℃45 s,60℃30 s,72℃45 s,循环30次,72℃延伸10 min,4℃结束。将PCR扩增产物进行电泳。采用GENE GENIUS凝胶成像分析系统及配套软件对电泳条带灰度值进行分析,通过Ⅱ型胶原与βactin的比值,得出各浓度组软骨细胞Ⅱ型胶原的相对表达量。
1.6 免疫组化检测Ⅱ型胶原(ColⅡ)的表达 各组细胞GH作用4 d后以4%多聚甲醛固定20 min,3%过氧化氢室温下孵育10 min;PBS冲洗3次,每次5 min;滴加正常非免疫动物血清室温下孵育10 min;除去血清,滴加1:100兔抗胶原Ⅱ一抗,4℃过夜。PBS冲洗3次,每次5 min,滴加生物素标记的二抗,室温下孵育10 min;PBS冲洗3次,每次5 min,滴加链霉素抗生物素过氧化物酶,室温下孵育10 min;PBS冲洗3次,每次5 min,DAB显色,苏木素复染,脱水,封片。结果判定:Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性为胞浆为棕黄色,采用IPP(Image Pro Plus 6.0)软件进行累积光密度IOD(integrated optical density)的测定。在200倍高倍镜下随机选取5个视野进行拍照,分析过程中所有切片的放大倍数,光源强度均相同。通过软件测定IOD值,取平均值后代表该细胞爬片的Ⅱ型胶原表达半定量值。
1.7 统计学方法 实验数据用均数±标准差表示。采用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原代培养大鼠胫骨生长板软骨细胞的形态学观察 原代培养的软骨细胞接种后呈小圆球形,折光性强,悬浮于培养液中,细胞的大小基本一致。培养24~36 h后原代细胞贴壁完成,呈扁平状,多角形,胞浆丰富,胞核清晰,可见1~2个核仁。培养7~8 d后,原代细胞90%融合,细胞形态不规则,呈多边形、星形等,紧密排列成“铺路石”状外观。见图1。
A.原代培养3 d的软骨细胞Primary chondrocyte cultivated for 3 days(×200)
B.原代培养7 d的软骨细胞Primary chondrocyte cultivated for 7 days(×200)
图1 大鼠胫骨生长板软骨细胞的形态学变化
2.2 Ⅱ型胶原(ColⅡ)mRNA表达 GH能促进ColⅡmRNA的表达并呈浓度依赖性,GH在10~500 ng/ml之间能促进ColⅡmRNA的表达,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),并且以100 ng/ml时表达最强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡmRNA表达的效应逐渐减弱,1000 ng/ml与对照组比较无差异(P>0.05)。见图2。
图2 生长激素对ColⅡmRNA表达的影响
A.对照组;B.10 ng/ml;C.20 ng/ml;D.50 ng/ml;E.100 ng/ml;F.200 ng/ml;G.500 ng/ml;H.1000 ng/ml
图3 不同浓度的GH对软骨细胞ColⅡ表达的影响
2.3 Ⅱ型胶原(ColⅡ)免疫组化染色结果 GH能促进ColⅡ的表达并呈浓度依赖性,GH在10~500 ng/ml之间能促进ColⅡ的表达,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),并且以100 ng/ml时表达最强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡ表达的效应逐渐减弱,1000 ng/ml与对照组比较无差异(P>0.05)。见图3。
3 讨论
近年研究发现,大鼠的基因序列相对于鸡、猪和兔等动物而言与人类有更大的同源性[1],青春期发育过程与人类近似,且生命周期短(2~3年),性成熟期短(2~3个月),因此较为适合作为研究生长发育的动物模型。身高主要由脊柱和下肢的长度组成。身高的基础是骨骼生长,骨骼发育状况最终决定着身高。骨骼生长是以生长板为中心环节的骨合成与骨吸收的动态过程,因此胫骨的生长板最能反映身高的状况。三周龄的大鼠正处于青春发育的早期,此年龄段的大鼠最适合用于模拟人的青春早期生长。此外,软骨细胞分离的数量是与供体的年龄成反比[2],软骨取材标本的供体年龄越轻,组织越新鲜,越易培养成功。因此,采用三周龄大鼠胫骨生长板分离的软骨细胞适合于儿童生长发育障碍疾病的研究。
生长激素是垂体前叶嗜酸细胞分泌的一种多肽激素,能刺激骨、软骨细胞的生长和分化。Ⅱ型胶原是软骨细胞分化的早期标志物,是软骨基质中最主要的胶原类型和发挥软骨正常生理功能的基础[3],主要见于增殖期的软骨细胞。本实验的结果显示,GH在生理浓度10 ng/ml[4]时即能促进ColⅡ的表达,并呈浓度依赖性,以100 ng/ml时表达最强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡ表达的效应逐渐减弱,1000 ng/ml与对照组比较无差异。Lindahl等报道GH对软骨细胞的促增殖的最低有效剂量为10 ng/ml,40 ng/ml时促增殖效应最大[5],这说明GH在促进软骨细胞增殖的同时可促进ColⅡ的表达,而其促增殖的浓度与笔者观察到的促ColⅡ表达的浓度略有不同,可能与所用的培养体系与所用动物的年龄不同有关。Ⅱ型胶原对维持软骨细胞的表型,防止其去分化起着重要的作用。已有研究报道证实,GH能抑制体外培养的生长板软骨细胞的分化[6],这与在临床应用GH治疗生长发育障碍的患儿并未发现其会导致骨龄的增加及生长板老化相一致。
参考文献
[1] Thomas W,Touchman JW,Blakesley RW,et al.Comparative analyses of multispecies sequences from targeted genomic regions.Nature 2003,424:78893.
[2] Carossino AM,Recenti R,Carossino R,et al.Methodological models for in vitro amplification and maintenance of human articular chondrocytes from elderly patients.Biogerontology,2007,8(5):483498.
[3] Archer CW,FrancisWest P.The chondrocyte.Int J Biochem Cell Biol,2003,35:401404.
[4] 楊钢,万瑜.垂体前叶激素分泌的节律性.天津科技出版社,1996:115.
[5] Lindahl A,Isqaard J,Nilsson A,et al.Growth hormone potentiates colony formation of epiphyseal chondrocytes in suspension culture.Endocrinology,1986,118(5):18431848.
[6] Monsoneqo E,Halevy O,Gertler A,et al.Growth hormone inhibits differentiation of avian epiphyseal growthplate chondrocytes.Mol Cell Endocrinol,1995,114:3542.
【关键词】
软骨细胞;生长板;生长激素;Ⅱ型胶原
Effect of growth hormone on the expression of collagen Ⅱ of cultured growth plate chondrocytes of rats
PAN Sinian,ZHANG Chengxi.Department of Pediatrics,The Third Hospital Affiliated to Zhongshan University,Guangzhou 510630,China
【Abstract】 Objective To observe the effect of growth hormone on the expression of collagen Ⅱ of cultured growth plate chondrocytes of rats.Methods Primary chondrocytes from tibial growth plate of 5~8rats by trypsincollagenase digestion were cultured in monolayer.RTPCR and immunocytochemistry were performed to investigate the expression of collagen Ⅱ at the mRNAand protein level,respectively with different concentrations of GH.Results GHenhances the expression of collagen Ⅱ of chondrocytes in vitro in a concentrationdependent fashion.The expression of collagen Ⅱwas obviously between the GH concentration of 10 ng/ml and 500 ng/ml(P<0.05),maximally at the concentration of 100 ng/ml,and decreased again after higher concentration of GH.There was no significant difference between 1000 ng/ml group and control group(P>0.05).Conclusion GH can maintain the phenotype of chondrocytes by enhancing the expression of collagen Ⅱand it will not increase the bone age during clinical practice.
【Key words】
Chondrocyte;Epiphyseal growth plate;Growth hormone;Collagen Ⅱ
生長激素(growth hormone,GH)被广泛用于儿童生长障碍性疾病,它能改善这些患儿的成年身高。然而,GH对生长板软骨细胞的作用机制目前尚未阐明,目前国内外有关GH对离体培养软骨细胞作用的报道均较少。本文拟通过体外培养大鼠胫骨生长板的软骨细胞来探讨GH对软骨细胞胶原Ⅱ表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 正常三周龄SpragueDawley(SD)大鼠,清洁级,雌雄不限,体质量40~50 g之间由中山大学实验动物中心提供。
1.2 主要试剂 重组人生长激素(rhGH,为CYTOLAB/PEPROTECH ASIA 产品,Israel)、DMEM/F12(1:1)培养基(Sigma)、胎牛血清(FBS,Gibco)、胰蛋白酶(1:250,AMREsCo)、Ⅱ型胶原酶、琼脂糖(Invitrogen)、SP和DAB显色试剂盒(福州迈新)、兔抗大鼠Ⅱ型胶原一抗(Neomarker)、Trizol Reagent、逆转录试剂盒和Taq酶(Toyobo)。
1.3 大鼠胫骨生长板软骨细胞的培养 将5~8只大鼠处死后在超净工作台上无菌取出胫骨近段,从骨软骨连接处分离出生长板软骨,仔细去除胫骨外的肌肉和骨膜,将软骨块剪成1 mm3大小,采用两步酶消化法(0.25%胰蛋白酶EDTA消化30 min、0.2%Ⅱ型胶原酶消化3 h)消化后,收集细胞并记数,台盼蓝试验测定细胞活性后,将软骨细胞按5×105个细胞/瓶的密度将上述细胞悬液接种于25 cm2的培养瓶中,在37℃、5%CO2、饱和湿度95%的培养箱中培养。
1.4 实验分组 实验设8组,对照组和浓度分别为10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml、1000 ng/ml的GH组,每组设3个重复。
1.5 RTPCR测软骨细胞Ⅱ型胶原的表达 常规培养48 h后,换含0.02%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行细胞饥饿24 h后,加入不同浓度的GH,作用24 h后采用Trizol裂解软骨细胞,提取总RNA,使用Toyobo公司的两步法进行RTPCR反应,ColⅡ引物序列为:上游引物5’GAAGCACATCTGGTTTGGAG3’,下游引物5’TTGGGGTTGAGGGTTTTACA3’,扩增片段长度为448 bp;内参照βactin引物序为:上游引物5’AGCCATGTACGTAGCCATCC3’,下游引物5’GTGGTGGTGAAGCTGTAGC3’,扩增片段长度为219 bp。反转录反应条件:42℃60 min,99℃5 min,4℃5 min,PCR反应条件:94℃5 min,94℃45 s,60℃30 s,72℃45 s,循环30次,72℃延伸10 min,4℃结束。将PCR扩增产物进行电泳。采用GENE GENIUS凝胶成像分析系统及配套软件对电泳条带灰度值进行分析,通过Ⅱ型胶原与βactin的比值,得出各浓度组软骨细胞Ⅱ型胶原的相对表达量。
1.6 免疫组化检测Ⅱ型胶原(ColⅡ)的表达 各组细胞GH作用4 d后以4%多聚甲醛固定20 min,3%过氧化氢室温下孵育10 min;PBS冲洗3次,每次5 min;滴加正常非免疫动物血清室温下孵育10 min;除去血清,滴加1:100兔抗胶原Ⅱ一抗,4℃过夜。PBS冲洗3次,每次5 min,滴加生物素标记的二抗,室温下孵育10 min;PBS冲洗3次,每次5 min,滴加链霉素抗生物素过氧化物酶,室温下孵育10 min;PBS冲洗3次,每次5 min,DAB显色,苏木素复染,脱水,封片。结果判定:Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性为胞浆为棕黄色,采用IPP(Image Pro Plus 6.0)软件进行累积光密度IOD(integrated optical density)的测定。在200倍高倍镜下随机选取5个视野进行拍照,分析过程中所有切片的放大倍数,光源强度均相同。通过软件测定IOD值,取平均值后代表该细胞爬片的Ⅱ型胶原表达半定量值。
1.7 统计学方法 实验数据用均数±标准差表示。采用SPSS13.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原代培养大鼠胫骨生长板软骨细胞的形态学观察 原代培养的软骨细胞接种后呈小圆球形,折光性强,悬浮于培养液中,细胞的大小基本一致。培养24~36 h后原代细胞贴壁完成,呈扁平状,多角形,胞浆丰富,胞核清晰,可见1~2个核仁。培养7~8 d后,原代细胞90%融合,细胞形态不规则,呈多边形、星形等,紧密排列成“铺路石”状外观。见图1。
A.原代培养3 d的软骨细胞Primary chondrocyte cultivated for 3 days(×200)
B.原代培养7 d的软骨细胞Primary chondrocyte cultivated for 7 days(×200)
图1 大鼠胫骨生长板软骨细胞的形态学变化
2.2 Ⅱ型胶原(ColⅡ)mRNA表达 GH能促进ColⅡmRNA的表达并呈浓度依赖性,GH在10~500 ng/ml之间能促进ColⅡmRNA的表达,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),并且以100 ng/ml时表达最强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡmRNA表达的效应逐渐减弱,1000 ng/ml与对照组比较无差异(P>0.05)。见图2。
图2 生长激素对ColⅡmRNA表达的影响
A.对照组;B.10 ng/ml;C.20 ng/ml;D.50 ng/ml;E.100 ng/ml;F.200 ng/ml;G.500 ng/ml;H.1000 ng/ml
图3 不同浓度的GH对软骨细胞ColⅡ表达的影响
2.3 Ⅱ型胶原(ColⅡ)免疫组化染色结果 GH能促进ColⅡ的表达并呈浓度依赖性,GH在10~500 ng/ml之间能促进ColⅡ的表达,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),并且以100 ng/ml时表达最强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡ表达的效应逐渐减弱,1000 ng/ml与对照组比较无差异(P>0.05)。见图3。
3 讨论
近年研究发现,大鼠的基因序列相对于鸡、猪和兔等动物而言与人类有更大的同源性[1],青春期发育过程与人类近似,且生命周期短(2~3年),性成熟期短(2~3个月),因此较为适合作为研究生长发育的动物模型。身高主要由脊柱和下肢的长度组成。身高的基础是骨骼生长,骨骼发育状况最终决定着身高。骨骼生长是以生长板为中心环节的骨合成与骨吸收的动态过程,因此胫骨的生长板最能反映身高的状况。三周龄的大鼠正处于青春发育的早期,此年龄段的大鼠最适合用于模拟人的青春早期生长。此外,软骨细胞分离的数量是与供体的年龄成反比[2],软骨取材标本的供体年龄越轻,组织越新鲜,越易培养成功。因此,采用三周龄大鼠胫骨生长板分离的软骨细胞适合于儿童生长发育障碍疾病的研究。
生长激素是垂体前叶嗜酸细胞分泌的一种多肽激素,能刺激骨、软骨细胞的生长和分化。Ⅱ型胶原是软骨细胞分化的早期标志物,是软骨基质中最主要的胶原类型和发挥软骨正常生理功能的基础[3],主要见于增殖期的软骨细胞。本实验的结果显示,GH在生理浓度10 ng/ml[4]时即能促进ColⅡ的表达,并呈浓度依赖性,以100 ng/ml时表达最强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡ表达的效应逐渐减弱,1000 ng/ml与对照组比较无差异。Lindahl等报道GH对软骨细胞的促增殖的最低有效剂量为10 ng/ml,40 ng/ml时促增殖效应最大[5],这说明GH在促进软骨细胞增殖的同时可促进ColⅡ的表达,而其促增殖的浓度与笔者观察到的促ColⅡ表达的浓度略有不同,可能与所用的培养体系与所用动物的年龄不同有关。Ⅱ型胶原对维持软骨细胞的表型,防止其去分化起着重要的作用。已有研究报道证实,GH能抑制体外培养的生长板软骨细胞的分化[6],这与在临床应用GH治疗生长发育障碍的患儿并未发现其会导致骨龄的增加及生长板老化相一致。
参考文献
[1] Thomas W,Touchman JW,Blakesley RW,et al.Comparative analyses of multispecies sequences from targeted genomic regions.Nature 2003,424:78893.
[2] Carossino AM,Recenti R,Carossino R,et al.Methodological models for in vitro amplification and maintenance of human articular chondrocytes from elderly patients.Biogerontology,2007,8(5):483498.
[3] Archer CW,FrancisWest P.The chondrocyte.Int J Biochem Cell Biol,2003,35:401404.
[4] 楊钢,万瑜.垂体前叶激素分泌的节律性.天津科技出版社,1996:115.
[5] Lindahl A,Isqaard J,Nilsson A,et al.Growth hormone potentiates colony formation of epiphyseal chondrocytes in suspension culture.Endocrinology,1986,118(5):18431848.
[6] Monsoneqo E,Halevy O,Gertler A,et al.Growth hormone inhibits differentiation of avian epiphyseal growthplate chondrocytes.Mol Cell Endocrinol,1995,114:3542.