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摘要：用70%乙醇对双齿围沙蚕进行热浸提后，得到双齿围沙蚕浸膏。然后对得到的浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇进行萃取，得到3部分萃取物。对双齿围沙蚕浸膏及各有机溶剂萃取部分进行抑菌试验和血管紧张肽I转化酶（ACE）抑制测试。结果表明，双齿围沙蚕浸膏及各有机溶剂萃取部分均具有抑制ACE作用，且具有剂量依赖性。双齿围沙蚕石油醚萃取部分对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌有抑菌活性，乙酸乙酯萃取部分对枯草芽孢杆菌、希瓦氏菌以及金黄色葡萄球菌具有抑菌活性，正丁醇萃取部分对希瓦氏菌具有抑菌活性。
关键词：双齿围沙蚕；浸膏；抑菌作用；血管紧张肽I转化酶
双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis），又名沙虫、海虫、海蜈蚣等，分类学上属于环节动物门、多毛纲、沙蚕科、围沙蚕属[1]。双齿围沙蚕广泛分布于我国渤海、黄海、东海。南海沿海滩涂[2]。双齿围沙蚕具有很高的营养价值，含有丰富的粗脂肪、粗蛋白、不饱和脂肪酸，人体必需的八种氨基酸以及多种矿物质和维生素，享有海中“冬虫夏草”的美称[3-4]。因为沙蚕养殖成本低，经济价值高，被广泛用于鱼、虾、蟹人工育苗和养殖。
海洋无脊椎动物因其特殊的生活环境，代谢产物具有结构新颖独特、生物活性较强的特点。本研究中，制备双齿围沙蚕浸膏并对其抗菌活性及ACE酶抑制活性进行研究，旨在为双齿围沙蚕的开发利用提供基础数据。
1材料和方法
1.1材料
双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）于2013年在辽宁省大连市长兴市场购买；抑菌试验菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、产气杆菌（Aerobacter aerogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、希瓦氏菌（Shewanella sp.）5种细菌由大连海洋大学食品科学与工程学院微生物实验室提供。
马尿酸、血管紧张肽I转化酶（ACE）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu）购于美国Sigma公司；甲醇，色谱纯；冰乙酸、三氟乙酸为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1双齿围沙蚕浸膏的制备1 354 g新鲜双齿围沙蚕，匀浆粉碎后置于圆底烧瓶中，加入4倍体积（V/W）70%乙醇热浸提2 h，滤出提取液，残渣中继续加4倍体积（V/W）70%乙醇提取，重复3次。合并浸提液，离心取上清液进行减压浓缩，将浓缩液冻干后得双齿围沙蚕总浸膏。
将上述得到的总浸膏依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取3次。将萃取液减压浓缩，自然风干，得到石油醚层浸膏（7.06 g），乙酸乙酯层浸膏（3.77 g），正丁醇层浸膏（11.44 g）。
1.2.2ACE抑制活性测试ACE抑制活性的测定参照朱晓杰的方法[5]。用含有6.8 mmol·L-1 NaCl的0.2 mol·L-1硼酸盐缓冲液（pH=8.3），将Hip-His-Leu配成7.6 mmol·L-1的溶液。ACE配置成60 mu/L后冷冻保藏备用。
将5 μL样品加入到15 μm/L的ACE中37 ℃预热5 min，之后加入25 mL HHL，37 ℃下反应30 min，后加入5 μL 10%的三氟乙酸终止反应，将反应液加入到高效液相中进行检测分析，定量测定马尿酸的峰面积。将得到的峰面积与空白试验的马尿酸峰面积进行比较。（空白试验只将样品换做蒸馏水，其他操作均相同）
HPLC流动相为含有0.1%TFA和0.05%乙酸的30%的甲醇溶液。流速为1 mL/min。
1.2.3抑菌活性测试抑菌试验采用滤纸片法，结果以抑菌圈直径的大小来鉴定。固体培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基，每1 000 mL培养基内分别加入NaCl 5.0 g、牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g。并且以每200 mL加入4 g的比例加入琼脂粉，配制好以后将pH调至7.2～7.4之间。放入到高压灭菌锅内120 ℃灭菌20 min，并趁热在无菌操作台中倒入平板培养皿中备用。液体培养基同固体培养基相比除不加琼脂粉以外，其他成分相同。
将双齿围沙蚕石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分溶于生理盐水中，空白对照组则为生理盐水。阳性对照样品为青霉素。
菌液的配制：分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、产气杆菌、希瓦氏菌，各自取一接菌环，放入到液体培养基中，放入后在摇床中37 ℃摇床培养2 h。在无菌操作台中，将事先配置好的菌液每个吸取80 μL均匀涂布在培养皿中，并做3个平行对照，然后将滤纸片分别蘸取事先配制好的样品放置于涂布好菌液的平板培养皿中，放入培养箱中，36 ℃培养24 h。
2结果与讨论
2.1双齿围沙蚕浸膏的ACE抑制活性
双齿围沙蚕浸膏对ACE酶具有抑制作用。总浸膏以及正丁醇层浸膏表现出了随浓度增加而抑制率升高的规律，而石油醚和乙酸乙酯萃取部分没有明显的剂量依赖性。由图1可知，100 mg/mL的沙蚕总浸膏提取物对ACE酶抑制率最高，高达84.07%。10 mg/mL的石油醚层提取物抑制率最低，为44.72%。石油醚层萃取部分的抑制率最高体现在50 mg/mL剂量组，抑制率为53.26%。乙酸乙酯萃取部分的最高抑制率在20 mg/mL，抑制率为62.72%。正丁醇萃取部分的最高抑制率在50 mg/mL，抑制率为61.79%。
ACE抑制剂不仅仅具有降低血压，扩张血管的作用，还能增加机体对胰岛素的敏感性，对人体具有改善糖代谢紊乱的作用[6]。海洋无脊椎动物的提取物很多都具有降血压以及治疗和预防心脑血管疾病的的作用，例如从海星体壁中提取出来的一种酸性粘多糖，可以显著降低血清中胆固醇的含量，改善微循环，而且还可以抑制红细胞的聚集从而防止血栓形成，对治疗冠心病，脑血栓等心脑血管疾病很有帮助[7]。从海洋无脊椎动物海燕中提取法得到的海燕皂苷样品也具有一定的抑制ACE的活性[8]。因此从双齿围沙蚕中分离安全而有效的降血压活性成分，具有潜在的进一步研究价值。 2.2双齿围沙蚕浸膏的抑菌活性
由表1可知，双齿围沙蚕的乙醇萃取部分对产气杆菌没有抑制活性，对大肠杆菌具有抑制作用的只有石油醚萃取部分；对金黄色葡萄球菌只有乙酸乙酯萃取部分有一定抑制活性；枯草芽孢杆菌则是石油醚层与乙酸乙酯萃取部分有抑制活性，且石油醚萃取部分抑制活性程度高于乙酸乙酯萃取部分和总浸膏；希瓦氏菌则是乙酸乙酯与正丁醇萃取部分有一定抑菌活性。不同有机溶剂提取的浸膏具有不同的抑菌活性，表明它们含有的化学成分不同。
很多海洋无脊椎动物提取物都具有抑制微生物的生物活性。从海参中分离的皂苷Holotoxin A和B表现出了对多种病原微生物的生长抑制活性[9]。从玉足海参中分离得到的玉足海参素也具有抗菌作用[10]。海参皂苷Scabraside A、B对7种真菌都有较强的抑制活性[11]。从罗氏海盘车中分离得到的SF-3、SF-4对白色念珠球菌和裂殖酵母菌都有较强的抑制作用[12]。因此，海洋无脊椎动物是抑菌活性物质的重要来源。
3结论
70%乙醇浸提所获得的双齿围沙蚕浸膏以及石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取部分均有抑制血管紧张肽I转化酶（ACE）活性。石油醚萃取部分对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌有抑菌活性，乙酸乙酯萃取部分对枯草芽孢杆菌、希瓦氏菌以及金黄色葡萄球菌具有抑菌活性，正丁醇萃取部分对希瓦氏菌具有抑菌活性。不同有机溶剂萃取部分具有不同的抑菌活性，表明它们含有的化学成分不同。
参考文献：
[1] 蒋霞敏，柳敏海.沙蚕科的研究进展[J].海洋科学，2008，32（4）： 82-86
[2]吴宝玲，孙瑞平，杨德渐.中国近海沙蚕科研究[M].北京：海洋出版社，1981：13-19，171-172
[3] 杨士平，刘慧玲，邱德全.天然和养殖沙蚕营养成分分析[J].饲料工业，2013，34（10）：53-55
[4] 朱国萍，陈子腾，叶宁.湛江养殖双齿围沙蚕营养成分的测定[J].当代水产，2014（8）：76-77
[5] 朱晓杰，曾名湧，赵元晖，等.海地瓜蛋白酶解物类蛋白反应修饰及其对ACE活性的影响[J].中国海洋药物，2011，30（6）：6-12
[6] 郭承华，董新伟，贺君，等.海燕皂苷的抗炎活性的初步研究[J].中国生化药物杂志，2010，31（4）：259-260
[7] 郭承华.海星资源的开发利用[J].生物学通报，1989（1）：7
[8] 李敏晶，韩艳玲，谭成玉，等.海燕皂苷抑制ACE活性的研究[J].广东化工，2011，10（38）：9-10
[9] 刘雪莉，钱伯初.日本海洋天然活性物质研究简况[J].中国海洋药物，1997（1）：46-49
[10] 周清凯，杨惠英，蔡云见，等.玉足海参素的抗真菌作用及其临床应用[J].海洋药物，1985，41（2）：37-39
[11] 韩华，易杨华，喇明平，等.糙海参皂苷Seabraside A、B的抗真菌和抗肿瘤活性[J].中国药理学通报，2008，24（8）：1111-1112
[12] 周燕霞，赵丽华，邢翔，等.多棘海盘车多糖的提取及体外抑菌活性初探[J].中国海洋药物，2009，28（3）：58-60
关键词：双齿围沙蚕；浸膏；抑菌作用；血管紧张肽I转化酶
双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis），又名沙虫、海虫、海蜈蚣等，分类学上属于环节动物门、多毛纲、沙蚕科、围沙蚕属[1]。双齿围沙蚕广泛分布于我国渤海、黄海、东海。南海沿海滩涂[2]。双齿围沙蚕具有很高的营养价值，含有丰富的粗脂肪、粗蛋白、不饱和脂肪酸，人体必需的八种氨基酸以及多种矿物质和维生素，享有海中“冬虫夏草”的美称[3-4]。因为沙蚕养殖成本低，经济价值高，被广泛用于鱼、虾、蟹人工育苗和养殖。
海洋无脊椎动物因其特殊的生活环境，代谢产物具有结构新颖独特、生物活性较强的特点。本研究中，制备双齿围沙蚕浸膏并对其抗菌活性及ACE酶抑制活性进行研究，旨在为双齿围沙蚕的开发利用提供基础数据。
1材料和方法
1.1材料
双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）于2013年在辽宁省大连市长兴市场购买；抑菌试验菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、产气杆菌（Aerobacter aerogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、希瓦氏菌（Shewanella sp.）5种细菌由大连海洋大学食品科学与工程学院微生物实验室提供。
马尿酸、血管紧张肽I转化酶（ACE）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu）购于美国Sigma公司；甲醇，色谱纯；冰乙酸、三氟乙酸为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1双齿围沙蚕浸膏的制备1 354 g新鲜双齿围沙蚕，匀浆粉碎后置于圆底烧瓶中，加入4倍体积（V/W）70%乙醇热浸提2 h，滤出提取液，残渣中继续加4倍体积（V/W）70%乙醇提取，重复3次。合并浸提液，离心取上清液进行减压浓缩，将浓缩液冻干后得双齿围沙蚕总浸膏。
将上述得到的总浸膏依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取3次。将萃取液减压浓缩，自然风干，得到石油醚层浸膏（7.06 g），乙酸乙酯层浸膏（3.77 g），正丁醇层浸膏（11.44 g）。
1.2.2ACE抑制活性测试ACE抑制活性的测定参照朱晓杰的方法[5]。用含有6.8 mmol·L-1 NaCl的0.2 mol·L-1硼酸盐缓冲液（pH=8.3），将Hip-His-Leu配成7.6 mmol·L-1的溶液。ACE配置成60 mu/L后冷冻保藏备用。
将5 μL样品加入到15 μm/L的ACE中37 ℃预热5 min，之后加入25 mL HHL，37 ℃下反应30 min，后加入5 μL 10%的三氟乙酸终止反应，将反应液加入到高效液相中进行检测分析，定量测定马尿酸的峰面积。将得到的峰面积与空白试验的马尿酸峰面积进行比较。（空白试验只将样品换做蒸馏水，其他操作均相同）
HPLC流动相为含有0.1%TFA和0.05%乙酸的30%的甲醇溶液。流速为1 mL/min。
1.2.3抑菌活性测试抑菌试验采用滤纸片法，结果以抑菌圈直径的大小来鉴定。固体培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基，每1 000 mL培养基内分别加入NaCl 5.0 g、牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g。并且以每200 mL加入4 g的比例加入琼脂粉，配制好以后将pH调至7.2～7.4之间。放入到高压灭菌锅内120 ℃灭菌20 min，并趁热在无菌操作台中倒入平板培养皿中备用。液体培养基同固体培养基相比除不加琼脂粉以外，其他成分相同。
将双齿围沙蚕石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分溶于生理盐水中，空白对照组则为生理盐水。阳性对照样品为青霉素。
菌液的配制：分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、产气杆菌、希瓦氏菌，各自取一接菌环，放入到液体培养基中，放入后在摇床中37 ℃摇床培养2 h。在无菌操作台中，将事先配置好的菌液每个吸取80 μL均匀涂布在培养皿中，并做3个平行对照，然后将滤纸片分别蘸取事先配制好的样品放置于涂布好菌液的平板培养皿中，放入培养箱中，36 ℃培养24 h。
2结果与讨论
2.1双齿围沙蚕浸膏的ACE抑制活性
双齿围沙蚕浸膏对ACE酶具有抑制作用。总浸膏以及正丁醇层浸膏表现出了随浓度增加而抑制率升高的规律，而石油醚和乙酸乙酯萃取部分没有明显的剂量依赖性。由图1可知，100 mg/mL的沙蚕总浸膏提取物对ACE酶抑制率最高，高达84.07%。10 mg/mL的石油醚层提取物抑制率最低，为44.72%。石油醚层萃取部分的抑制率最高体现在50 mg/mL剂量组，抑制率为53.26%。乙酸乙酯萃取部分的最高抑制率在20 mg/mL，抑制率为62.72%。正丁醇萃取部分的最高抑制率在50 mg/mL，抑制率为61.79%。
ACE抑制剂不仅仅具有降低血压，扩张血管的作用，还能增加机体对胰岛素的敏感性，对人体具有改善糖代谢紊乱的作用[6]。海洋无脊椎动物的提取物很多都具有降血压以及治疗和预防心脑血管疾病的的作用，例如从海星体壁中提取出来的一种酸性粘多糖，可以显著降低血清中胆固醇的含量，改善微循环，而且还可以抑制红细胞的聚集从而防止血栓形成，对治疗冠心病，脑血栓等心脑血管疾病很有帮助[7]。从海洋无脊椎动物海燕中提取法得到的海燕皂苷样品也具有一定的抑制ACE的活性[8]。因此从双齿围沙蚕中分离安全而有效的降血压活性成分，具有潜在的进一步研究价值。 2.2双齿围沙蚕浸膏的抑菌活性
由表1可知，双齿围沙蚕的乙醇萃取部分对产气杆菌没有抑制活性，对大肠杆菌具有抑制作用的只有石油醚萃取部分；对金黄色葡萄球菌只有乙酸乙酯萃取部分有一定抑制活性；枯草芽孢杆菌则是石油醚层与乙酸乙酯萃取部分有抑制活性，且石油醚萃取部分抑制活性程度高于乙酸乙酯萃取部分和总浸膏；希瓦氏菌则是乙酸乙酯与正丁醇萃取部分有一定抑菌活性。不同有机溶剂提取的浸膏具有不同的抑菌活性，表明它们含有的化学成分不同。
很多海洋无脊椎动物提取物都具有抑制微生物的生物活性。从海参中分离的皂苷Holotoxin A和B表现出了对多种病原微生物的生长抑制活性[9]。从玉足海参中分离得到的玉足海参素也具有抗菌作用[10]。海参皂苷Scabraside A、B对7种真菌都有较强的抑制活性[11]。从罗氏海盘车中分离得到的SF-3、SF-4对白色念珠球菌和裂殖酵母菌都有较强的抑制作用[12]。因此，海洋无脊椎动物是抑菌活性物质的重要来源。
3结论
70%乙醇浸提所获得的双齿围沙蚕浸膏以及石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取部分均有抑制血管紧张肽I转化酶（ACE）活性。石油醚萃取部分对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌有抑菌活性，乙酸乙酯萃取部分对枯草芽孢杆菌、希瓦氏菌以及金黄色葡萄球菌具有抑菌活性，正丁醇萃取部分对希瓦氏菌具有抑菌活性。不同有机溶剂萃取部分具有不同的抑菌活性，表明它们含有的化学成分不同。
参考文献：
[1] 蒋霞敏，柳敏海.沙蚕科的研究进展[J].海洋科学，2008，32（4）： 82-86
[2]吴宝玲，孙瑞平，杨德渐.中国近海沙蚕科研究[M].北京：海洋出版社，1981：13-19，171-172
[3] 杨士平，刘慧玲，邱德全.天然和养殖沙蚕营养成分分析[J].饲料工业，2013，34（10）：53-55
[4] 朱国萍，陈子腾，叶宁.湛江养殖双齿围沙蚕营养成分的测定[J].当代水产，2014（8）：76-77
[5] 朱晓杰，曾名湧，赵元晖，等.海地瓜蛋白酶解物类蛋白反应修饰及其对ACE活性的影响[J].中国海洋药物，2011，30（6）：6-12
[6] 郭承华，董新伟，贺君，等.海燕皂苷的抗炎活性的初步研究[J].中国生化药物杂志，2010，31（4）：259-260
[7] 郭承华.海星资源的开发利用[J].生物学通报，1989（1）：7
[8] 李敏晶，韩艳玲，谭成玉，等.海燕皂苷抑制ACE活性的研究[J].广东化工，2011，10（38）：9-10
[9] 刘雪莉，钱伯初.日本海洋天然活性物质研究简况[J].中国海洋药物，1997（1）：46-49
[10] 周清凯，杨惠英，蔡云见，等.玉足海参素的抗真菌作用及其临床应用[J].海洋药物，1985，41（2）：37-39
[11] 韩华，易杨华，喇明平，等.糙海参皂苷Seabraside A、B的抗真菌和抗肿瘤活性[J].中国药理学通报，2008，24（8）：1111-1112
[12] 周燕霞，赵丽华，邢翔，等.多棘海盘车多糖的提取及体外抑菌活性初探[J].中国海洋药物，2009，28（3）：58-60