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[摘要] 目的 本研究分析甲状腺乳头状癌中促甲状腺素受体与钠碘转运体基因启动子区甲基化状况，探讨甲状腺功能基因甲基化与甲状腺乳头状癌病理侵袭性之间相关性。 方法 采用甲基化荧光实时特异聚合酶链反应甲状腺乳头状癌中TSHR与NIS基因启动区异常甲基化情况，探讨该区甲基化与病理参数之间的关系，以及两基因甲基化之间相关情况。 结果 甲状腺癌中NIS与TSHR基因甲基化均高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.01）。TSHR启动区域5’-CpG岛甲基化分别与病灶多少、颈淋巴结转移及局部侵犯有关（P<0.05），NIS基因启动子区域5’-CpG岛甲基化分别与患者年龄、多病灶、颈淋巴结转移及病理分期有关（P<0.05），两基因甲基化相关性分析：①TSHR启动子甲基化发生显著高于NIS；②TSHR与NIS基因的启动子区甲基化有关系。 结论 乳头状甲状腺癌的功能基因TSHR与NIS基因启动区甲基化是常见现象，可能在甲状腺癌的发生发展过程中发挥重要作用，可能与肿瘤侵袭性相关。两组基因甲基化具一定相关性，联合两个基因启动子区域甲基化检测可能更有意义。
[关键词] 甲状腺乳头状癌（PTC）；钠/碘协同转运体（NIS）；促甲状腺素受体（TSHR）；甲基化；实时荧光定量甲基化-PCR
[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）21-0001-05
[Abstract] Objective To investigate the methylation status of the promoter region of NIS and TSHR gene promoter region in papillary thyroid carcinomas（PTC），and relation between Methylation of TSHR and NIS gene promoter region correlated and aggressiveness. Methods The promoter region of TSHR and NIS 5’-CpG island methylation of tumor tissue and corresponding adjacent thyroid tissues were detected by real time methylation- specific PCR（qMSP）. The relationship between methylation status and clinical pathological parameters were analyzed. In addition，the correlation between methylation of two genes was studied. Results The rate of methylation of TSHR and NIS were higher than adjacent tissues（P<0.01）.Significant correlation existed among TSHR gene promoter 5’-CpG island methylation with lesions numbers， local invasion， lymph node metastasis respectively（P<0.05），but not with clinical stage， gender and age.Similarly，Significant correlation existed among NIS methylation with patient age，lesions numbers， lymph node metastasis and clinical stage，respectively（P<0.05）， but not with tumor size， local invasion andgender. Relationship between NIS methylation and TSHR methylation in Papillary Thyroid Carcinomas：（1）The methylation rates of TSHR gene was significantly higher than that of NIS in PTC（P<0.01）；（2）The relationship of methylation status of the promoter region of TSHR and NIS in PTC was positive correlation（P<0.01）. Conclusion Methylations of TSHR and NIS gene in promoter region are common molecular events， which make significant role in the development of PTC，may enhance tumor aggressiveness.
[Key words] Papillary thyroid carcinomas（PTC）； Thyroid stimulating hormone receptor（TSHR）； Na /I- symporter，（NIS）； Methylation； Real time methylation-specific PCR （qMSP）
近年来甲状腺癌显著增高，已成为发病率增长速度最快的实体恶性肿瘤之一[1]。天津市肿瘤医院头颈肿瘤科的调查资料显示，天津等沿海地区是甲状腺癌的高发地区，发病率明显高于内陆地区，且有继续上升趋势，近20年来由0.8/10万上升至2.5/10万。浙江省甲状腺癌报告平均发病率为8.37/10万，死亡率随年龄增加而上升，2007～2011年甲状腺癌发病率每年以接近30%的速度快速上升，已经成为发病率上升最快的肿瘤之一[2]。美国国立癌症研究院2010年发布数据表明全美的甲状腺癌年发病数已经超过40 000例，累积患病数超过400 000例[3]。 甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinomas，PTC）是甲状腺恶性肿瘤中最常见类型[4]，目前对其发病原因尚有较大争议，认为与辐射以及遗传学改变和外环境变化等多种因素相关，现已经公认促甲状腺激素受体（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）与钠碘转运体（Na /I- symporter， NIS）在甲状腺癌的发生和发展中起着重要作用[5-7]。
促甲状腺素受体（TSHR）是甲状腺特异蛋白，位于细胞膜表面。TSH通过与TSHR结合发挥作用，通过激活细胞内信号传导途径上调钠/碘协同转运体的表达，发挥对碘代谢功能的调节作用。TSH-TSHR信号系统相关蛋白在甲状腺癌的发生和发展中起着重要作用[8，9]。NIS位于甲状腺细胞滤泡上皮基底膜上，主要负责将血中的碘转运到甲状腺细胞内，是维持甲状腺胞内高碘浓度的结构基础。
若上述两种功能蛋白功能异常，将干扰甲状腺滤泡上皮细胞对于碘元素的细胞外摄取、细胞内浓聚和利用[5]。近年来，有研究表明甲状腺乳头状癌中存在着NIS基因表达降低或“沉默”，可能是PTC癌变及导致临床放射性碘治疗失败的直接原因[6]。
我们计划收集128例甲状腺乳头状癌组织及对应癌旁正常组织，采用甲基化特异性聚合链反应（qMSP）检测中NIS和TSHR启动子区甲基化情况，并探讨甲基化与病理侵袭性的相关性。
1 材料与方法
1.1 材料来源
全部研究病例来自浙江省舟山医院甲状腺癌根治术的甲状腺乳头状癌病例128例，年龄16～75岁，平均42.6 岁，其中男21例，女107例。收集甲状腺肿瘤石蜡切片与临床病理学分期等资料，单个病灶70例，多发病灶58例；T1（肿瘤大小≤2 cm）82例，T1以上（肿瘤直径>2 cm）46例；肿瘤局限腺内型68例，腺外侵犯（侵犯包膜）60例；同时伴有颈部淋巴结（含气管前淋巴结）转移61例，无淋巴结转移67例；Ⅰ/Ⅱ期合计83例，Ⅲ/Ⅳ期45例。肿瘤分期参照美国癌症联合委员会（AJCC）标准[10]。标本均经病理组织学HE切片证实为甲状腺乳头状癌，并经两位病理医生审核确证。选取原发性乳头状甲状腺癌病例入组，排除其他类型甲状腺恶性肿瘤及转移性癌。
1.2 DNA提取
在光学显微镜下取得目标肿瘤细胞以及肿瘤边缘旁开3 mm组织（癌旁组织），获取约4000个目标细胞后，蛋白酶消化，将提取纯化的微量DNA放入Ependorf管，恒温孵育3 d后终止反应，收集基因组DNA。
1.3 甲基化测定
采用实时荧光定量甲基化特异性PCR（qMSP）法检测TSHR与NIS启动子区5’-CpG 甲基化状态，亚硫酸氢钠法修饰DNA并纯化回收，按照TSHR与NIS基因序列分别设计TSHR与NIS基因5’-CpG特异甲基化和非甲基化引物成。甲基化判定方法由计算甲基化百分率决定，甲基化百分率（M%）=100×（目标基因甲基化DNA拷贝数/甲基化加非甲基化拷贝数之和）。M% >25.0判定为甲基化。
1.4 统计学分析
采用SPSS 18.0统计软件对NIS及TSHR启动区基因的异常甲基化在甲状腺乳头状癌组织中表达情况，并且从多角度对于上述甲状腺乳头状癌病理侵袭性相关参数与基因启动子区异常甲基化之间的相关性进行学分析。两组间数据采用χ2检验或Fisher’s确切概率法进行分析，相关性分析时使用Spearman秩相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两种基因启动子区域5’-CpG岛甲基化状况
在128例PTC 肿瘤组织标本中，TSHR基因与NIS基因异常甲基化的发生率分别为53.13%（68/128）和34.38%（44/128），癌旁组织中，分别有10例（7.81%）与9例（7.03%）检出甲基化基因。与癌旁对照组织相比，甲状腺乳头状癌组织中，两种基因的甲基化差异均有统计学意义（P<0.01）。
2.2 PTC肿瘤组织中TSHR与NIS基因启动子区5’-CpG岛甲基化与临床病理参数之间的相关性分析
2.2.1 TSHR甲基化与临床病理参数之间的相关性分析 ①TSHR甲基化在不同年龄、性别以及肿块大小之间差异无统计学意义；②多病灶、侵犯腺体外、颈淋巴结转移者TSHR甲基化阳性率高，组间差异均有高度统计学意义（P<0.01）；③Ⅲ/Ⅳ期的TSHR基因甲基化阳性率高于Ⅰ/Ⅱ期组，但两组间差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2.2 NIS甲基化与临床病理参数之间的相关性分析 ①NIS甲基化在不同年龄之间差异有高度统计学意义；②与性别、肿块大小、局部侵犯包膜与否差异无统计学意义；③多病灶、颈淋巴结转移者NIS甲基化阳性率高，组间差异均有高度统计学意义（P<0.01）；Ⅲ/Ⅳ期的TSHR基因甲基化阳性率高于Ⅰ/Ⅱ期组，较早与较晚期两组间差异有高度统计学意义（P<0.01）。见表1。
2.3甲状腺乳头状癌中TSHR基因与NIS基因启动子区5’-CpG岛甲基化的相关性分析
肿瘤组织中TSHR与NIS基因甲基化率比较及二者关联性：128例肿瘤标本中，肿瘤组织中TSHR与NIS基因甲基化的总发生率为60.15%（77/128），与癌旁正常组织比较有显著差异（P<0.01）；TSHR基因甲基化的发生率为53.13%，TSHR启动子甲基化发生率高于NIS的启动子甲基化（P<0.01）；TSHR与NIS启动子区甲基化之间正相关（r=0.356，P<0.01），见表2。
3 讨论
近年来，随着表观遗传学研究进展，基因甲基化在细胞分子生物学与肿瘤的发生发展中的作用越来越受到各个领域的重视[11]。学界普遍认为肿瘤抑制基因失活，原因有突变、等位基因丢失，抑癌基因与功能基因启动子区异常甲基化也是常见而重要的原因，可以导致转录“沉默”，甚至可能抑癌基因失活的唯一机制[12，13]，导致细胞功能缺失或“突变”形式恶性生长[14]，已经成为肿瘤病因学的研究热点。 促甲状腺激素受体（TSHR）是甲状腺细胞的主要功能受体，分布于甲状腺滤泡上皮细胞膜上[15，16]。受TSH激活的TSHR对NIS基因转录调节具有双重意义以维持稳定，进而影响甲状腺癌的血管新生、增殖等分化过程[17]。钠碘转运体是一种位于甲状腺滤泡细胞膜的糖蛋白，介导将活化的碘离子转送至胞内，这是甲状腺激素生物合成关键的基础步骤[18]。人类的NIS（hNIS）基因定位于19p13.2-p12[19]。位于转录起始点前的NIS上游增强子区（NUE）NIS基因的调控区域是NIS转录所必需的[20]。
Venkataraman等[21]在1999年提出在分化型甲状腺癌中存在NIS区启动子区的异常甲基化。采用MSP方法检测了23例甲状腺癌样本的NIS启动子甲基化状态，发现NIS的表达情况与甲状腺癌的临床分期存在关联，中晚期病例中的NIS阳性表达量相对较低。他们还试验使用去甲基化药物——地西他滨（5-杂氮-2-脱氧胞苷）处理hNIS mRNA的7个人类甲状腺细胞系，发现其中4个细胞系的hNIS mRNA恢复表达，且有2个细胞系中碘化物转运恢复。地西他滨在甲状腺癌细胞系中诱导NIS mRNA表达和恢复碘摄取的能力进一步证实启动子区甲基化是NIS表达缺失的可能机制。这与部分侵袭性强的甲状腺癌对内分泌治疗耐药以及碘摄取率低情况相符，警示甲状腺癌的侵袭性可能与基因启动子区异常甲基化相关。本试验结果还提示大于45岁的老年人组中基因发生甲基化相对较多，其中NIS组的差异更为明显，提示甲基化与年龄存在一定相关性。
长久以来，甲状腺癌的手术范围一直是外科争论的领域，部分高侵袭性甲状腺癌常见局部淋巴结转移和多原发病灶，而不加选择的对于所有甲状腺癌病例全选择全甲状腺切除未免陷入“过度治疗”的误区。如何选择合适的“肿瘤标记物”鉴别甲状腺肿瘤的侵袭性程度，指导甲状腺癌的诊治一直都是本研究所涉及的两个甲状腺功能基因甲基化均与肿瘤侵袭性病理表现相关，但敏感性与特异性尚待提高。我们设想甲状腺术前细针穿刺时，在明确甲状腺乳头状癌的诊断前提下，另取少量组织提取DNA分析肿瘤侵袭性相关分子水平标记物，可资临床手术方式选择参考。结合目前甲状腺手术前常规行细针穿刺活检的前提，我们考虑将来可能在术前穿刺标本细胞学检测基础上进行甲状腺癌高危因素分子标记物检测，为术中是否行全甲状腺切除以及行颈部淋巴结清扫提供参考依据，当然这还需要寻找更多和更有效的检测候选位点。国内也有学者[22]报道TSHR、NIS 基因甲基化与多种肿瘤高侵袭性相关，但因为研究组例数不多，未取得显著性差异。
本试验选取128例舟山海岛地区居民中甲状腺乳头状癌的标本中，检测TSHR与NIS两种功能基因启动子区甲基化程度，发现PTC组织中上述两种基因的启动子区甲基化均显著高于癌旁组织。另外，将TSHR与NIS甲基化情况与多个病理参数比较后，发现功能基因甲基化与多病灶、颈淋巴结转移等多个高危侵袭因素相关，提示联合多位点基因甲基化检测具有甲状腺癌全切除分子标记物的潜在可能。
分析TSHR基因与NIS甲基化相关性后显示甲状腺乳头状癌组织中TSHR启动子甲基化发生显著高于NIS的启动子甲基化（P<0.01）；分析两者间关联性，发现TSHR与NIS基因的启动子甲基化呈正相关（P<0.01）。本研究近期发现hMLH1基因甲基化同样是甲状腺乳头状癌的多发分子事件，且与TSHR及NIS之间相关性弱；提示甲状腺的功能基因与抑癌基因均存在启动子区异常甲基化，提示甲状腺癌中多种基因的甲基化与否与某种共同因素有关，不同位点基因的甲基化间存在相关关联影响的网络效应证据尚不充足[23]。基于甲状腺乳头状癌中存在多位点基因甲基化表现，加之部分基因甲基化与BRAF突变关系已经得到证实，我们推测BRAF基因突变，导致丝裂原活化蛋白激酶等分子通路持续性激活，进一步导致了多个基因位点的甲基化，但还需要进一步深入研究来验证[24-26]。
结合上述研究结果，甲状腺乳头状癌中常见TSHR与NIS基因启动子区异常甲基化，在甲状腺癌的发生发展过程中发挥着重要作用[27，28]。甲状腺功能基因TSHR、NIS启动区甲基化是甲状腺癌的多发现象，可能是导致甲状腺癌内分泌治疗耐药与甲状腺细胞摄碘率下降的原因，提示异常甲基化在甲状腺癌发病机制中的重要作用，为其个性化诊治提供了客观的实验依据。甲状腺乳头状癌中TSHR、NIS甲基化高发与侵袭的相关性可资作为分子肿瘤标记物指导甲状腺癌早期诊断和手术方式。
[参考文献]
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[关键词] 甲状腺乳头状癌（PTC）；钠/碘协同转运体（NIS）；促甲状腺素受体（TSHR）；甲基化；实时荧光定量甲基化-PCR
[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）21-0001-05
[Abstract] Objective To investigate the methylation status of the promoter region of NIS and TSHR gene promoter region in papillary thyroid carcinomas（PTC），and relation between Methylation of TSHR and NIS gene promoter region correlated and aggressiveness. Methods The promoter region of TSHR and NIS 5’-CpG island methylation of tumor tissue and corresponding adjacent thyroid tissues were detected by real time methylation- specific PCR（qMSP）. The relationship between methylation status and clinical pathological parameters were analyzed. In addition，the correlation between methylation of two genes was studied. Results The rate of methylation of TSHR and NIS were higher than adjacent tissues（P<0.01）.Significant correlation existed among TSHR gene promoter 5’-CpG island methylation with lesions numbers， local invasion， lymph node metastasis respectively（P<0.05），but not with clinical stage， gender and age.Similarly，Significant correlation existed among NIS methylation with patient age，lesions numbers， lymph node metastasis and clinical stage，respectively（P<0.05）， but not with tumor size， local invasion andgender. Relationship between NIS methylation and TSHR methylation in Papillary Thyroid Carcinomas：（1）The methylation rates of TSHR gene was significantly higher than that of NIS in PTC（P<0.01）；（2）The relationship of methylation status of the promoter region of TSHR and NIS in PTC was positive correlation（P<0.01）. Conclusion Methylations of TSHR and NIS gene in promoter region are common molecular events， which make significant role in the development of PTC，may enhance tumor aggressiveness.
[Key words] Papillary thyroid carcinomas（PTC）； Thyroid stimulating hormone receptor（TSHR）； Na /I- symporter，（NIS）； Methylation； Real time methylation-specific PCR （qMSP）
近年来甲状腺癌显著增高，已成为发病率增长速度最快的实体恶性肿瘤之一[1]。天津市肿瘤医院头颈肿瘤科的调查资料显示，天津等沿海地区是甲状腺癌的高发地区，发病率明显高于内陆地区，且有继续上升趋势，近20年来由0.8/10万上升至2.5/10万。浙江省甲状腺癌报告平均发病率为8.37/10万，死亡率随年龄增加而上升，2007～2011年甲状腺癌发病率每年以接近30%的速度快速上升，已经成为发病率上升最快的肿瘤之一[2]。美国国立癌症研究院2010年发布数据表明全美的甲状腺癌年发病数已经超过40 000例，累积患病数超过400 000例[3]。 甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinomas，PTC）是甲状腺恶性肿瘤中最常见类型[4]，目前对其发病原因尚有较大争议，认为与辐射以及遗传学改变和外环境变化等多种因素相关，现已经公认促甲状腺激素受体（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）与钠碘转运体（Na /I- symporter， NIS）在甲状腺癌的发生和发展中起着重要作用[5-7]。
促甲状腺素受体（TSHR）是甲状腺特异蛋白，位于细胞膜表面。TSH通过与TSHR结合发挥作用，通过激活细胞内信号传导途径上调钠/碘协同转运体的表达，发挥对碘代谢功能的调节作用。TSH-TSHR信号系统相关蛋白在甲状腺癌的发生和发展中起着重要作用[8，9]。NIS位于甲状腺细胞滤泡上皮基底膜上，主要负责将血中的碘转运到甲状腺细胞内，是维持甲状腺胞内高碘浓度的结构基础。
若上述两种功能蛋白功能异常，将干扰甲状腺滤泡上皮细胞对于碘元素的细胞外摄取、细胞内浓聚和利用[5]。近年来，有研究表明甲状腺乳头状癌中存在着NIS基因表达降低或“沉默”，可能是PTC癌变及导致临床放射性碘治疗失败的直接原因[6]。
我们计划收集128例甲状腺乳头状癌组织及对应癌旁正常组织，采用甲基化特异性聚合链反应（qMSP）检测中NIS和TSHR启动子区甲基化情况，并探讨甲基化与病理侵袭性的相关性。
1 材料与方法
1.1 材料来源
全部研究病例来自浙江省舟山医院甲状腺癌根治术的甲状腺乳头状癌病例128例，年龄16～75岁，平均42.6 岁，其中男21例，女107例。收集甲状腺肿瘤石蜡切片与临床病理学分期等资料，单个病灶70例，多发病灶58例；T1（肿瘤大小≤2 cm）82例，T1以上（肿瘤直径>2 cm）46例；肿瘤局限腺内型68例，腺外侵犯（侵犯包膜）60例；同时伴有颈部淋巴结（含气管前淋巴结）转移61例，无淋巴结转移67例；Ⅰ/Ⅱ期合计83例，Ⅲ/Ⅳ期45例。肿瘤分期参照美国癌症联合委员会（AJCC）标准[10]。标本均经病理组织学HE切片证实为甲状腺乳头状癌，并经两位病理医生审核确证。选取原发性乳头状甲状腺癌病例入组，排除其他类型甲状腺恶性肿瘤及转移性癌。
1.2 DNA提取
在光学显微镜下取得目标肿瘤细胞以及肿瘤边缘旁开3 mm组织（癌旁组织），获取约4000个目标细胞后，蛋白酶消化，将提取纯化的微量DNA放入Ependorf管，恒温孵育3 d后终止反应，收集基因组DNA。
1.3 甲基化测定
采用实时荧光定量甲基化特异性PCR（qMSP）法检测TSHR与NIS启动子区5’-CpG 甲基化状态，亚硫酸氢钠法修饰DNA并纯化回收，按照TSHR与NIS基因序列分别设计TSHR与NIS基因5’-CpG特异甲基化和非甲基化引物成。甲基化判定方法由计算甲基化百分率决定，甲基化百分率（M%）=100×（目标基因甲基化DNA拷贝数/甲基化加非甲基化拷贝数之和）。M% >25.0判定为甲基化。
1.4 统计学分析
采用SPSS 18.0统计软件对NIS及TSHR启动区基因的异常甲基化在甲状腺乳头状癌组织中表达情况，并且从多角度对于上述甲状腺乳头状癌病理侵袭性相关参数与基因启动子区异常甲基化之间的相关性进行学分析。两组间数据采用χ2检验或Fisher’s确切概率法进行分析，相关性分析时使用Spearman秩相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两种基因启动子区域5’-CpG岛甲基化状况
在128例PTC 肿瘤组织标本中，TSHR基因与NIS基因异常甲基化的发生率分别为53.13%（68/128）和34.38%（44/128），癌旁组织中，分别有10例（7.81%）与9例（7.03%）检出甲基化基因。与癌旁对照组织相比，甲状腺乳头状癌组织中，两种基因的甲基化差异均有统计学意义（P<0.01）。
2.2 PTC肿瘤组织中TSHR与NIS基因启动子区5’-CpG岛甲基化与临床病理参数之间的相关性分析
2.2.1 TSHR甲基化与临床病理参数之间的相关性分析 ①TSHR甲基化在不同年龄、性别以及肿块大小之间差异无统计学意义；②多病灶、侵犯腺体外、颈淋巴结转移者TSHR甲基化阳性率高，组间差异均有高度统计学意义（P<0.01）；③Ⅲ/Ⅳ期的TSHR基因甲基化阳性率高于Ⅰ/Ⅱ期组，但两组间差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2.2 NIS甲基化与临床病理参数之间的相关性分析 ①NIS甲基化在不同年龄之间差异有高度统计学意义；②与性别、肿块大小、局部侵犯包膜与否差异无统计学意义；③多病灶、颈淋巴结转移者NIS甲基化阳性率高，组间差异均有高度统计学意义（P<0.01）；Ⅲ/Ⅳ期的TSHR基因甲基化阳性率高于Ⅰ/Ⅱ期组，较早与较晚期两组间差异有高度统计学意义（P<0.01）。见表1。
2.3甲状腺乳头状癌中TSHR基因与NIS基因启动子区5’-CpG岛甲基化的相关性分析
肿瘤组织中TSHR与NIS基因甲基化率比较及二者关联性：128例肿瘤标本中，肿瘤组织中TSHR与NIS基因甲基化的总发生率为60.15%（77/128），与癌旁正常组织比较有显著差异（P<0.01）；TSHR基因甲基化的发生率为53.13%，TSHR启动子甲基化发生率高于NIS的启动子甲基化（P<0.01）；TSHR与NIS启动子区甲基化之间正相关（r=0.356，P<0.01），见表2。
3 讨论
近年来，随着表观遗传学研究进展，基因甲基化在细胞分子生物学与肿瘤的发生发展中的作用越来越受到各个领域的重视[11]。学界普遍认为肿瘤抑制基因失活，原因有突变、等位基因丢失，抑癌基因与功能基因启动子区异常甲基化也是常见而重要的原因，可以导致转录“沉默”，甚至可能抑癌基因失活的唯一机制[12，13]，导致细胞功能缺失或“突变”形式恶性生长[14]，已经成为肿瘤病因学的研究热点。 促甲状腺激素受体（TSHR）是甲状腺细胞的主要功能受体，分布于甲状腺滤泡上皮细胞膜上[15，16]。受TSH激活的TSHR对NIS基因转录调节具有双重意义以维持稳定，进而影响甲状腺癌的血管新生、增殖等分化过程[17]。钠碘转运体是一种位于甲状腺滤泡细胞膜的糖蛋白，介导将活化的碘离子转送至胞内，这是甲状腺激素生物合成关键的基础步骤[18]。人类的NIS（hNIS）基因定位于19p13.2-p12[19]。位于转录起始点前的NIS上游增强子区（NUE）NIS基因的调控区域是NIS转录所必需的[20]。
Venkataraman等[21]在1999年提出在分化型甲状腺癌中存在NIS区启动子区的异常甲基化。采用MSP方法检测了23例甲状腺癌样本的NIS启动子甲基化状态，发现NIS的表达情况与甲状腺癌的临床分期存在关联，中晚期病例中的NIS阳性表达量相对较低。他们还试验使用去甲基化药物——地西他滨（5-杂氮-2-脱氧胞苷）处理hNIS mRNA的7个人类甲状腺细胞系，发现其中4个细胞系的hNIS mRNA恢复表达，且有2个细胞系中碘化物转运恢复。地西他滨在甲状腺癌细胞系中诱导NIS mRNA表达和恢复碘摄取的能力进一步证实启动子区甲基化是NIS表达缺失的可能机制。这与部分侵袭性强的甲状腺癌对内分泌治疗耐药以及碘摄取率低情况相符，警示甲状腺癌的侵袭性可能与基因启动子区异常甲基化相关。本试验结果还提示大于45岁的老年人组中基因发生甲基化相对较多，其中NIS组的差异更为明显，提示甲基化与年龄存在一定相关性。
长久以来，甲状腺癌的手术范围一直是外科争论的领域，部分高侵袭性甲状腺癌常见局部淋巴结转移和多原发病灶，而不加选择的对于所有甲状腺癌病例全选择全甲状腺切除未免陷入“过度治疗”的误区。如何选择合适的“肿瘤标记物”鉴别甲状腺肿瘤的侵袭性程度，指导甲状腺癌的诊治一直都是本研究所涉及的两个甲状腺功能基因甲基化均与肿瘤侵袭性病理表现相关，但敏感性与特异性尚待提高。我们设想甲状腺术前细针穿刺时，在明确甲状腺乳头状癌的诊断前提下，另取少量组织提取DNA分析肿瘤侵袭性相关分子水平标记物，可资临床手术方式选择参考。结合目前甲状腺手术前常规行细针穿刺活检的前提，我们考虑将来可能在术前穿刺标本细胞学检测基础上进行甲状腺癌高危因素分子标记物检测，为术中是否行全甲状腺切除以及行颈部淋巴结清扫提供参考依据，当然这还需要寻找更多和更有效的检测候选位点。国内也有学者[22]报道TSHR、NIS 基因甲基化与多种肿瘤高侵袭性相关，但因为研究组例数不多，未取得显著性差异。
本试验选取128例舟山海岛地区居民中甲状腺乳头状癌的标本中，检测TSHR与NIS两种功能基因启动子区甲基化程度，发现PTC组织中上述两种基因的启动子区甲基化均显著高于癌旁组织。另外，将TSHR与NIS甲基化情况与多个病理参数比较后，发现功能基因甲基化与多病灶、颈淋巴结转移等多个高危侵袭因素相关，提示联合多位点基因甲基化检测具有甲状腺癌全切除分子标记物的潜在可能。
分析TSHR基因与NIS甲基化相关性后显示甲状腺乳头状癌组织中TSHR启动子甲基化发生显著高于NIS的启动子甲基化（P<0.01）；分析两者间关联性，发现TSHR与NIS基因的启动子甲基化呈正相关（P<0.01）。本研究近期发现hMLH1基因甲基化同样是甲状腺乳头状癌的多发分子事件，且与TSHR及NIS之间相关性弱；提示甲状腺的功能基因与抑癌基因均存在启动子区异常甲基化，提示甲状腺癌中多种基因的甲基化与否与某种共同因素有关，不同位点基因的甲基化间存在相关关联影响的网络效应证据尚不充足[23]。基于甲状腺乳头状癌中存在多位点基因甲基化表现，加之部分基因甲基化与BRAF突变关系已经得到证实，我们推测BRAF基因突变，导致丝裂原活化蛋白激酶等分子通路持续性激活，进一步导致了多个基因位点的甲基化，但还需要进一步深入研究来验证[24-26]。
结合上述研究结果，甲状腺乳头状癌中常见TSHR与NIS基因启动子区异常甲基化，在甲状腺癌的发生发展过程中发挥着重要作用[27，28]。甲状腺功能基因TSHR、NIS启动区甲基化是甲状腺癌的多发现象，可能是导致甲状腺癌内分泌治疗耐药与甲状腺细胞摄碘率下降的原因，提示异常甲基化在甲状腺癌发病机制中的重要作用，为其个性化诊治提供了客观的实验依据。甲状腺乳头状癌中TSHR、NIS甲基化高发与侵袭的相关性可资作为分子肿瘤标记物指导甲状腺癌早期诊断和手术方式。
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