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【摘要】
目的:考察川楝子醇提物体外细胞毒性。方法:将川楝子醇提物倍比稀释后与小鼠肝细胞接触培养,通过显微镜观察其形态,采用MTT法量化细胞毒性,计算相对增殖率。结果:川楝子醇提物对肝细胞的生长抑制作用无统计学差异（P＞0.05），川楝子醇提物肝细胞毒性级别为0级。结论:川楝子醇提物无明显的肝细胞毒性。
【关键词】川楝子醇提物;细胞毒性; MTT法
【中图分类号】R104.45 【文献标识码】B 【文章编号】1005-0515(2011)10-0417-02
川楝子(FructusToosendan) 是临床常用中药。据《中国药典》2010 年版所载为楝科植物川楝 (Melia toosendanSieb. et Zucc.) 的干燥成熟果实，有肝小毒。本文用MTT法考察川楝子醇提物对肝细胞的毒性程度。
1材料与方法
1.1 材料与试剂。
小鼠，1640培养液，小牛血清，噻唑蓝，CO2恒温培養箱，酶标仪，显微镜。
2 实验方法
2.1 供试品溶液制备:用含10%血清的1640培养基将供试品稀释至所需浓度。
2.2 细胞接种:用机械分离法，将小鼠肝脏剪碎，研磨，使肝细胞从肝组织上脱落,获肝细胞，制成单个细胞悬液。用含10%血清的1640培养液种植消化并稀释，将细胞密度调整为1×106个/ml，接种到96孔培养板，每孔接种200μl细胞悬液。置CO2培养箱37℃培养使细胞贴壁24h。
2.3MTT法:取8ml供试品，倍比稀释成6个不同浓度。设细胞对照组和6个不同浓度供试品组（从高到低浓度依次为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组），每组8个复孔。在各孔中分别加入100μL培养液及100μL不同浓度的供试品稀释液，置CO2培养箱继续培养72h。置显微镜下观察细胞形态（图1）。每孔加入MTT溶液50μL，37℃孵育4h。置显微镜下观察细胞形态（图2）。弃去孔内培养基和MTT溶液，再加入DMSO 200μL，混匀10min，采用酶标仪，在492nm和630nm处分别测定吸光度A值，用各孔A492nm-对应孔A630nm，取平行4孔差值计算各组平均值。按下式计算细胞相对增殖率：
细胞相对增殖率（RGR）=A/A0×100%
式中：A为供试品组吸光度；A0为细胞对照组吸光度均值。
2.4统计方法。
实验数据采用SPSS11.0统计处理，计量数据A值以（X±s）表示，采用t检验进行比较。
3结果
3.1细胞形态学观察。
显微镜下观察，肝细胞呈贴壁生长，细胞多呈圆形、三角形、梭形，胞浆丰富，细胞核有单或双核，呈圆形或椭圆形。在每孔加入MTT溶液37℃孵育4h后,细胞生长密集,其形态和核相均没有发生改变。结果见图1 、图2。
3.2 药物对细胞相对增殖的影响。
与细胞对照组相比，不同浓度供试品组吸光度值均明显升高，有统计学意义（分别为P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。结果见表1。
表1细胞对照组和不同浓度供试品A值比较（X±s）
组别A值 细胞相对增值率
（%）
细胞对照组0.50±0.29——
Ⅰ组1.29±0.25**259
Ⅱ组1.21±0.19**242
Ⅲ组0.96±0.47* 191
Ⅳ组1.27±0.60* 255
Ⅴ组1.17±0.59* 235
Ⅵ组1.51±0.17*** 303
注：与细胞对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
4 结论
川楝子乙醇提取物无肝细胞毒性。
5 讨论
细胞活性和增殖状况的测定是评价药物毒性过程不可或缺的步骤。MTT法是最为简单、迅速和高敏感性的检测细胞活性与生长增殖的方法。其原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶物——甲臜，并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，同时也可计算细胞相对增值率（RGR）或抑制率。本实验结果表明，川楝子醇提物有明显的促进肝细胞生长增殖作用。RGR与药物毒性级别的对应关系为：当RGR大于或等于100%时，级别为0级；当RGR在75%~99%时，级别为1级；当RGR在50%~74%时，级别为2级；当RGR在25%~49%时，级别为3级；当RGR在1%~24%时，级别为4级；当细胞无增值率时，级别为5级。本实验结果显示，不同浓度供试品RGR值均高于100%。可见，川楝子醇提物对肝细胞无明显的毒性。
参考文献
［1］ 周继春,杨海燕,徐晓月,何燕.柴胡注射液体外细胞毒性研究［J］.药物分析杂志，2010；30（9）：1809-1812
［2］蒋青锋,陈志良,包杰,刘喜荣,武金宝.银杏内酯纳米粒细胞毒性研究［J］.中国医药指南，2010；8（24）：23-25
目的:考察川楝子醇提物体外细胞毒性。方法:将川楝子醇提物倍比稀释后与小鼠肝细胞接触培养,通过显微镜观察其形态,采用MTT法量化细胞毒性,计算相对增殖率。结果:川楝子醇提物对肝细胞的生长抑制作用无统计学差异（P＞0.05），川楝子醇提物肝细胞毒性级别为0级。结论:川楝子醇提物无明显的肝细胞毒性。
【关键词】川楝子醇提物;细胞毒性; MTT法
【中图分类号】R104.45 【文献标识码】B 【文章编号】1005-0515(2011)10-0417-02
川楝子(FructusToosendan) 是临床常用中药。据《中国药典》2010 年版所载为楝科植物川楝 (Melia toosendanSieb. et Zucc.) 的干燥成熟果实，有肝小毒。本文用MTT法考察川楝子醇提物对肝细胞的毒性程度。
1材料与方法
1.1 材料与试剂。
小鼠，1640培养液，小牛血清，噻唑蓝，CO2恒温培養箱，酶标仪，显微镜。
2 实验方法
2.1 供试品溶液制备:用含10%血清的1640培养基将供试品稀释至所需浓度。
2.2 细胞接种:用机械分离法，将小鼠肝脏剪碎，研磨，使肝细胞从肝组织上脱落,获肝细胞，制成单个细胞悬液。用含10%血清的1640培养液种植消化并稀释，将细胞密度调整为1×106个/ml，接种到96孔培养板，每孔接种200μl细胞悬液。置CO2培养箱37℃培养使细胞贴壁24h。
2.3MTT法:取8ml供试品，倍比稀释成6个不同浓度。设细胞对照组和6个不同浓度供试品组（从高到低浓度依次为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组），每组8个复孔。在各孔中分别加入100μL培养液及100μL不同浓度的供试品稀释液，置CO2培养箱继续培养72h。置显微镜下观察细胞形态（图1）。每孔加入MTT溶液50μL，37℃孵育4h。置显微镜下观察细胞形态（图2）。弃去孔内培养基和MTT溶液，再加入DMSO 200μL，混匀10min，采用酶标仪，在492nm和630nm处分别测定吸光度A值，用各孔A492nm-对应孔A630nm，取平行4孔差值计算各组平均值。按下式计算细胞相对增殖率：
细胞相对增殖率（RGR）=A/A0×100%
式中：A为供试品组吸光度；A0为细胞对照组吸光度均值。
2.4统计方法。
实验数据采用SPSS11.0统计处理，计量数据A值以（X±s）表示，采用t检验进行比较。
3结果
3.1细胞形态学观察。
显微镜下观察，肝细胞呈贴壁生长，细胞多呈圆形、三角形、梭形，胞浆丰富，细胞核有单或双核，呈圆形或椭圆形。在每孔加入MTT溶液37℃孵育4h后,细胞生长密集,其形态和核相均没有发生改变。结果见图1 、图2。
3.2 药物对细胞相对增殖的影响。
与细胞对照组相比，不同浓度供试品组吸光度值均明显升高，有统计学意义（分别为P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。结果见表1。
表1细胞对照组和不同浓度供试品A值比较（X±s）
组别A值 细胞相对增值率
（%）
细胞对照组0.50±0.29——
Ⅰ组1.29±0.25**259
Ⅱ组1.21±0.19**242
Ⅲ组0.96±0.47* 191
Ⅳ组1.27±0.60* 255
Ⅴ组1.17±0.59* 235
Ⅵ组1.51±0.17*** 303
注：与细胞对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
4 结论
川楝子乙醇提取物无肝细胞毒性。
5 讨论
细胞活性和增殖状况的测定是评价药物毒性过程不可或缺的步骤。MTT法是最为简单、迅速和高敏感性的检测细胞活性与生长增殖的方法。其原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶物——甲臜，并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，同时也可计算细胞相对增值率（RGR）或抑制率。本实验结果表明，川楝子醇提物有明显的促进肝细胞生长增殖作用。RGR与药物毒性级别的对应关系为：当RGR大于或等于100%时，级别为0级；当RGR在75%~99%时，级别为1级；当RGR在50%~74%时，级别为2级；当RGR在25%~49%时，级别为3级；当RGR在1%~24%时，级别为4级；当细胞无增值率时，级别为5级。本实验结果显示，不同浓度供试品RGR值均高于100%。可见，川楝子醇提物对肝细胞无明显的毒性。
参考文献
［1］ 周继春,杨海燕,徐晓月,何燕.柴胡注射液体外细胞毒性研究［J］.药物分析杂志，2010；30（9）：1809-1812
［2］蒋青锋,陈志良,包杰,刘喜荣,武金宝.银杏内酯纳米粒细胞毒性研究［J］.中国医药指南，2010；8（24）：23-25