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摘 要：通过对燕麦成品优势菌的培养、筛选、分离和纯化，建立新的检测阈值并验证，结果表明，在36℃、GB4789.2-2016规定的正常检测接种量的培养条件下，检测培养40h后，当菌落总数小于270cfu时，菌落总数项目检测结果<10000cfu，食品安全符合国家标准规定。将燕麦片成品优势菌株经过筛选、分离纯化和培养后，重新接种于平板计数琼脂培养基，对其生长特性进行研究，以期缩短燕麦菌落总数检测时间，为行业标准技术参数的更新提供参考。
关键词：燕麦;优势菌;菌落总数;菌落检测
中图分类号 TS210.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）12-0125-3
燕麦作为一种新兴的健康食品，其功能性成分包括但不限于β-葡聚糖、燕麦硒、燕麦酚酸、生物碱、可溶性膳食纤维、类黄酮、植酸、亚油酸、α-亚麻酸等，具有独特的营养优势。当前，随着燕麦片生产工艺的逐步成熟和改进，其成品的检测技术不断向前发展，将推动麦类相关检验技术的更新，进而影响到燕麦和其他麦类行业相关检测标准的建立与完善。为此，本研究开展了燕麦片成品优势菌株的筛选实验。
1 材料与方法
1.1 供试材料 采用公司实验室筛选的燕麦优势菌株。主要试剂和仪器如表1和表2所示，其他设备和材料按照GB4789.2-2016中第3章节的要求购买使用。供应培养基：采用GB4789.28-2013规定的平板计数琼脂培养基。pH自然，121℃高压灭菌15min备用。
1.2 样品处理 利用GB4789.1-2016三级采样方法和样品处理方法，对燕麦成品进行随机抽样。将25g燕麦片溶解于225mL生理盐水（10倍稀释度），接种量实验以此比例为基准进行浓缩;菌落数量测定实验，根据需要同步展开若干个10倍梯度稀释培养观察过程，以保证测定结果的准确性。
1.3 燕麦优势菌株的筛选 首先，对燕麦片成品优势菌株进行初步培养和筛选，采用朔州市朔煤古城食品有限公司车间生产的燕麦片成品作为待检样品，按照国标GB4789.1-2016和GB19640-2016中规定的取样方法进行取样，其中n=5，c=2，m=104，M=105。采用国标GB4789.2-2016中操作要求的方法对样品进行处理，进行菌落总数测定的实验操作。采用外径约为95mm、内径约为90mm的玻璃培养平皿，倾倒培养基厚度控制在0.35～0.45mm，接种后在超净工作台正置约15min后，在恒温培养箱倒置培养48h。然后挑取形态完整、菌落邊缘清晰的优势菌，梯度稀释平板法进一步分离纯化并重复试验。之后针对再培养的优势菌株进行均匀涂布接种培养，分别观察燕麦片大小片成品共6批次样品。优势菌落形态均呈现表面白色圆形，边缘整齐光滑，有酵母菌特有香气，符合酵母菌的菌落形态常见特征，判定为酵母菌。之后采用GB4789.15-2016霉菌与酵母计数中提及的选择性培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基（简称PDA）培养，生物显微镜涂片观察，得到的分离纯化后的菌株作为检测出发菌株。
1.4 燕麦菌株生长特性指标的测量 结合燕麦产成品国标检测要求，并充分考虑到酵母菌的菌落形态特性，边缘整齐，易于观察，对每个被均匀稀释涂布的平皿出现的酵母菌落进行观察。验证实验之前的实验过程中，设立5组平行实验，菌落生长特性指标结果，表示为酵母菌落个数平均结果（cfu/皿）。验证试验采用GB4789.2-2016中的规定方法，进行菌落总数测定实验。
2 结果与分析
2.1 不同培养温度对酵母菌落生长特性的影响 燕麦片成品在平板计数培养基培养下的优势菌为酵母菌，酵母菌理论最适生长温度为20～30℃。由于国标要求检测方法的额定培养温度为36℃，为了探测36℃培养条件下的燕麦优势酵母菌株的生长情况，实验设定温度梯度为3℃，实验中采用梯度稀释法。设立同一样品的菌悬液，相同稀释度、相同接种量、不同温度条件下进行培养，观察所得结果见表3。由表3可知，燕麦优势酵母菌株菌落长势的最佳培养温度在30～33℃附近。不同培养温度对燕麦优势酵母菌株菌落个数影响力比例为30℃∶33℃∶36℃∶39℃≈2∶1.81∶1.49∶1。
2.3 不同初始接种量对菌落生长特性的影响 实验中采用梯度稀释法，设立同一样品、相同稀释度的菌悬液，不同倍数接种量条件下进行培养后观察。与温度和时间单因素实验不同的是，为了更好地对接种量进行控制，本次实验采用的是单独批次的燕麦片成品稀释液，采用的培养基是PCA培养基，测定的是菌落总数。所得结果见5表。由表5可知，不同初始接种量对燕麦优势酵母菌株菌落总数影响力比例为n×1∶n×2∶n×3∶n×4≈1∶1.83∶3.83∶8.38。
3 燕麦菌落总数检测新阈值的设立与验证
综上所述，燕麦优势酵母菌最佳培养温度为30℃，培养时间48h后仍然保持较旺生长，燕麦片成品检测样接种量与菌落总数结果接近倍数关系。以此为据，设定新的检测阈，采用平板计数琼脂培养基培养40h展开第1次观测，而后继续培养至48h，再观察1次。记录的都是菌落总数。与接种量单因素实验同步展开验证实验，根据设立阈值，每个接种量分别设计5组平行实验并观测整理菌落总数结果均值。
检测阈值设立方式如下：结合上述影响力比例数据，设定培养温度36℃，培养时间40h，接种量为1倍，阈值300cfu;培养温度36℃，培养时间40h，接种量为2倍，阈值550cfu;培养温度36℃，培养时间40h，接种量为3倍，阈值1150cfu;培养时间40h，接种量为4倍，阈值2520cfu（这里的1倍接种量指的是25g燕麦片溶于225mL无菌生理盐水，移液枪吸取1mL，接种在平板上，标记为10倍稀释度的接种量，接种量若干倍就是通过上述基础更改料液比进行浓缩，每次吸取1mL进行接种的量，下文同）。
验证实验结果为：培养温度36℃，培养时间40h，接种量为1倍，40h结果均值270cfu，48h结果均值1500cfu;培养温度36℃，培养时间40h，接种量为2倍，结果均值490cfu，48h结果均值2800cfu;培养温度36℃，培养时间40h，接种量为3倍，结果均值980cfu，48h结果均值5400cfu;培养时间40h，接种量为4倍，结果均值1900cfu，48h结果均值9850cfu，均未超过设立的检测阈值，也符合GB19640-2016规定的菌落总数测定项合格标准，新检测阈值建立成功。
4 结论与讨论
通过本实验发现，在36℃，GB4789.2-2016规定的正常检测接种量的培养条件下，检测培养40h，如果菌落总数小于270cfu，则本次菌落总数项目检测结果<10000cfu，食品安全符合国家标准规定。本实验中，设立检测阈值用的是针对燕麦优势酵母菌株的选择性培养基，而验证检测阈值的时候用的是平板计数琼脂培养基，使结果更接近真实工作检测流程发生的结果。通过锁定优势菌以及观察其生长特性，从而给设定新检测阈值打下基础。此外，通过验证实验发现，高浓缩倍数的接种量并未带来同比例的菌落总数增益效果，可能是由于燕麦成品中的β-葡聚糖的抗真菌作用[1-3]。因此，通过新检测阈值的设立与验证，可以为燕麦行业菌落总数项目检测提供一定的参考依据。
参考文献
[1]张美俊，杨武德，王超，等.燕麦β-葡聚糖含量及其检测方法研究进展[J].山西农业科学，2019，47（04）：690-694.
[2]姜月红，李晓林，孙健，等.（1，3）-β-D葡聚糖水平在抗菌药物治疗白色念珠菌病疗效中的评价作用[J].中国医药科学，2019，9（05）：22-24，38.
[3]申旺，叶丽燕，杨文丽，等.血浆（1，3）-β-D-葡聚糖在侵袭性真菌感染临床诊治中的应用评价[J].中华医院感染学杂志，2018，28（09）：1288-129. （责编：张宏民）
关键词：燕麦;优势菌;菌落总数;菌落检测
中图分类号 TS210.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）12-0125-3
燕麦作为一种新兴的健康食品，其功能性成分包括但不限于β-葡聚糖、燕麦硒、燕麦酚酸、生物碱、可溶性膳食纤维、类黄酮、植酸、亚油酸、α-亚麻酸等，具有独特的营养优势。当前，随着燕麦片生产工艺的逐步成熟和改进，其成品的检测技术不断向前发展，将推动麦类相关检验技术的更新，进而影响到燕麦和其他麦类行业相关检测标准的建立与完善。为此，本研究开展了燕麦片成品优势菌株的筛选实验。
1 材料与方法
1.1 供试材料 采用公司实验室筛选的燕麦优势菌株。主要试剂和仪器如表1和表2所示，其他设备和材料按照GB4789.2-2016中第3章节的要求购买使用。供应培养基：采用GB4789.28-2013规定的平板计数琼脂培养基。pH自然，121℃高压灭菌15min备用。
1.2 样品处理 利用GB4789.1-2016三级采样方法和样品处理方法，对燕麦成品进行随机抽样。将25g燕麦片溶解于225mL生理盐水（10倍稀释度），接种量实验以此比例为基准进行浓缩;菌落数量测定实验，根据需要同步展开若干个10倍梯度稀释培养观察过程，以保证测定结果的准确性。
1.3 燕麦优势菌株的筛选 首先，对燕麦片成品优势菌株进行初步培养和筛选，采用朔州市朔煤古城食品有限公司车间生产的燕麦片成品作为待检样品，按照国标GB4789.1-2016和GB19640-2016中规定的取样方法进行取样，其中n=5，c=2，m=104，M=105。采用国标GB4789.2-2016中操作要求的方法对样品进行处理，进行菌落总数测定的实验操作。采用外径约为95mm、内径约为90mm的玻璃培养平皿，倾倒培养基厚度控制在0.35～0.45mm，接种后在超净工作台正置约15min后，在恒温培养箱倒置培养48h。然后挑取形态完整、菌落邊缘清晰的优势菌，梯度稀释平板法进一步分离纯化并重复试验。之后针对再培养的优势菌株进行均匀涂布接种培养，分别观察燕麦片大小片成品共6批次样品。优势菌落形态均呈现表面白色圆形，边缘整齐光滑，有酵母菌特有香气，符合酵母菌的菌落形态常见特征，判定为酵母菌。之后采用GB4789.15-2016霉菌与酵母计数中提及的选择性培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基（简称PDA）培养，生物显微镜涂片观察，得到的分离纯化后的菌株作为检测出发菌株。
1.4 燕麦菌株生长特性指标的测量 结合燕麦产成品国标检测要求，并充分考虑到酵母菌的菌落形态特性，边缘整齐，易于观察，对每个被均匀稀释涂布的平皿出现的酵母菌落进行观察。验证实验之前的实验过程中，设立5组平行实验，菌落生长特性指标结果，表示为酵母菌落个数平均结果（cfu/皿）。验证试验采用GB4789.2-2016中的规定方法，进行菌落总数测定实验。
2 结果与分析
2.1 不同培养温度对酵母菌落生长特性的影响 燕麦片成品在平板计数培养基培养下的优势菌为酵母菌，酵母菌理论最适生长温度为20～30℃。由于国标要求检测方法的额定培养温度为36℃，为了探测36℃培养条件下的燕麦优势酵母菌株的生长情况，实验设定温度梯度为3℃，实验中采用梯度稀释法。设立同一样品的菌悬液，相同稀释度、相同接种量、不同温度条件下进行培养，观察所得结果见表3。由表3可知，燕麦优势酵母菌株菌落长势的最佳培养温度在30～33℃附近。不同培养温度对燕麦优势酵母菌株菌落个数影响力比例为30℃∶33℃∶36℃∶39℃≈2∶1.81∶1.49∶1。
2.3 不同初始接种量对菌落生长特性的影响 实验中采用梯度稀释法，设立同一样品、相同稀释度的菌悬液，不同倍数接种量条件下进行培养后观察。与温度和时间单因素实验不同的是，为了更好地对接种量进行控制，本次实验采用的是单独批次的燕麦片成品稀释液，采用的培养基是PCA培养基，测定的是菌落总数。所得结果见5表。由表5可知，不同初始接种量对燕麦优势酵母菌株菌落总数影响力比例为n×1∶n×2∶n×3∶n×4≈1∶1.83∶3.83∶8.38。
3 燕麦菌落总数检测新阈值的设立与验证
综上所述，燕麦优势酵母菌最佳培养温度为30℃，培养时间48h后仍然保持较旺生长，燕麦片成品检测样接种量与菌落总数结果接近倍数关系。以此为据，设定新的检测阈，采用平板计数琼脂培养基培养40h展开第1次观测，而后继续培养至48h，再观察1次。记录的都是菌落总数。与接种量单因素实验同步展开验证实验，根据设立阈值，每个接种量分别设计5组平行实验并观测整理菌落总数结果均值。
检测阈值设立方式如下：结合上述影响力比例数据，设定培养温度36℃，培养时间40h，接种量为1倍，阈值300cfu;培养温度36℃，培养时间40h，接种量为2倍，阈值550cfu;培养温度36℃，培养时间40h，接种量为3倍，阈值1150cfu;培养时间40h，接种量为4倍，阈值2520cfu（这里的1倍接种量指的是25g燕麦片溶于225mL无菌生理盐水，移液枪吸取1mL，接种在平板上，标记为10倍稀释度的接种量，接种量若干倍就是通过上述基础更改料液比进行浓缩，每次吸取1mL进行接种的量，下文同）。
验证实验结果为：培养温度36℃，培养时间40h，接种量为1倍，40h结果均值270cfu，48h结果均值1500cfu;培养温度36℃，培养时间40h，接种量为2倍，结果均值490cfu，48h结果均值2800cfu;培养温度36℃，培养时间40h，接种量为3倍，结果均值980cfu，48h结果均值5400cfu;培养时间40h，接种量为4倍，结果均值1900cfu，48h结果均值9850cfu，均未超过设立的检测阈值，也符合GB19640-2016规定的菌落总数测定项合格标准，新检测阈值建立成功。
4 结论与讨论
通过本实验发现，在36℃，GB4789.2-2016规定的正常检测接种量的培养条件下，检测培养40h，如果菌落总数小于270cfu，则本次菌落总数项目检测结果<10000cfu，食品安全符合国家标准规定。本实验中，设立检测阈值用的是针对燕麦优势酵母菌株的选择性培养基，而验证检测阈值的时候用的是平板计数琼脂培养基，使结果更接近真实工作检测流程发生的结果。通过锁定优势菌以及观察其生长特性，从而给设定新检测阈值打下基础。此外，通过验证实验发现，高浓缩倍数的接种量并未带来同比例的菌落总数增益效果，可能是由于燕麦成品中的β-葡聚糖的抗真菌作用[1-3]。因此，通过新检测阈值的设立与验证，可以为燕麦行业菌落总数项目检测提供一定的参考依据。
参考文献
[1]张美俊，杨武德，王超，等.燕麦β-葡聚糖含量及其检测方法研究进展[J].山西农业科学，2019，47（04）：690-694.
[2]姜月红，李晓林，孙健，等.（1，3）-β-D葡聚糖水平在抗菌药物治疗白色念珠菌病疗效中的评价作用[J].中国医药科学，2019，9（05）：22-24，38.
[3]申旺，叶丽燕，杨文丽，等.血浆（1，3）-β-D-葡聚糖在侵袭性真菌感染临床诊治中的应用评价[J].中华医院感染学杂志，2018，28（09）：1288-129. （责编：张宏民）