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汤苏阳 女，1964年生，1987年毕业于锦州医学院医疗系，1998期部队中、青年人才基金班毕业，医学硕士。发表论文十余篇，参编专著一部。［摘要］目的：研究苦参碱(Matrine,简称Mat)对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法：将Mat以不同浓度梯度作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞，测MTT反应的A0值及LDH值，用免疫组织化学检测Mat用药前后的细胞核内增殖性抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达。结果：增生性瘢痕成纤维细胞在Mat0.25～100mg/ml范围内呈剂量依赖性增殖抑制，但LDH值无明显改变；PCNA的表达，在Mat作用后明显减弱。结论：Mat在体外能明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖而不引起细胞坏死性改变。
［关键词］苦参碱成纤维细胞增殖
［中图分类号］R619+.6［文献标识码］A［文章编号］1008-6455(2001)01-0006-03
THE INFLUENCE OF MATRINE ON THE GROWTH AND PROLIFERATION
OF SCAR-DERIVED FIBROBLASTS
TANG Su-yangCAI Bao-renHUANG Gao-sheng
Department of burn and plastic,205 Hospital of PLA(Jin Zhou 121001)china
［Abstract］Objective：To study the influence of Matrine on growth and proliferation of fibroblasts derived hgpertropnic scar.〖WT5"HZ〗Methods：The MTT OD value and the content of LDH was examined by biochemical analysis after Matrine was added to the monolayer culture system of scar-derived fibroblasts.The expressions of prolifrating cell nuclear antigen (PCNA)were examinedby immunochemied methed.Results：Mat at 0.10～100.mg/ml could decrease the MTT OD value in dose dependent manner amd could not increase the content of LDH significantly.The expression of PCNA in Mat groupswas highr than the control groups.Conclusion：Mat could inhibit the proliferation of derived hypertropnicscar fibroblasts rarely produce the toxicity on scar-derived fibroblasts.
［Key words］MatrineFibroblastProliferation
增生性瘢痕是创伤愈合的异常结局，可造成机体的形态改变和功能障碍。故研究创伤愈合、瘢痕形成的机制及其治疗一直是困绕整形外科的难题之一〔1〕。苦参类生物碱(Matrice 简称Mat)是以苦参碱为代表的、结构相似的一类生物碱。近年来，国内外在研究、使用苦参类生物碱的过程中发现其多方面的药理活性和临床功能，如：在中枢神经系统、心血管系统、免疫系统的作用，抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗纤维化疾病作用〔2〕。苦参碱也是我科多年以来使用的瘢痕软化膏的主要成分，其临床使用效果明显，能明显抑制瘢痕的增生，且使增生性瘢痕软化；目前无苦参碱对人增生性瘢痕作用的报道，但很可能是极具前途的治疗瘢痕增生的生物碱。通过体外培养的瘢痕成纤维细胞作为实验对象，观察苦参碱对其增殖的影响，为探讨苦参碱对瘢痕的治疗作用提供依据。
1材料和方法
1.1材料苦参碱标准品：由中国生物制品、药品检定所提供；DMEM，胰蛋白酶：由美国Gibco公司生产；新生牛血清：由杭州四季青生物工程材料研究所生产；DMSO由上海Sangen公司生产；MTT由美国Sigma公司生产。Ⅰ抗鼠抗人PCNA单克隆抗体，Ⅱ抗DokA Envision+〔TM〕购于丹麦DAKO公司，DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.2方法手术中取增生性瘢痕组四例，年龄2～25岁，在无菌条件下经漂洗、剪碎，培养于含200ml/L新生牛血清的DMEM培养液中，置37℃，CO2孵箱中培养，待长成致密单层后用2.5g/L胰蛋白酶消化，以1∶3传代。实验所用的细胞为第4～9代细胞。实验分成11组，药物浓度单位为mg/ml，详见附表。
1.2.1乳酸脱氢酶(LDH)的测定取对数生长期细胞，用24孔培养板培养，每孔接种2.5×104个细胞，置CO2孵箱内培养7d，每3d换液1次，按分组加入条件培养液后继续培养24h，取上清，用全自动生化分析仪测定LDH活性值。
1.2.2MTT比色法测定细胞增殖状况取对数生长期细胞，在96孔培养板中接种5×103个细胞+DMEM培养液200μL，置CO2孵箱内培养8h，吸弃上清，按分组加入条件培养液继续培养24h，加入MTT液10μL/孔振荡显色，自动酶联免疫分析仪测定A0值。(波长490nm)增殖抑制率(%)=〔1-(实验组吸光值-对照组吸光值)/对照组吸光值〕×100%〔3〕。
1.2.3PCNA检测取对数生长期细胞，将盖玻片置于6孔培养板内培养，每孔接种5×104个细胞，于CO2孵箱内培养24h后，分2组分别加入0.5～1.0mg/ml苦参碱条件培养液和空白加培养液组；培养24h后，用甲醇和丙酮固定，晾干24h后，中性树脂粘片，PBS冲洗振荡三次，每次5min，用1%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，甩干加Ⅰ抗，4℃过夜，复温1h，PBS冲洗振荡三次，每次5min。甩干加Ⅱ抗，放置37℃1h后，PBS冲洗振荡3次，每次5min。甩干，DAB显色。
2结果
2.1苦参碱对增生性瘢痕成纤维细胞乳酸脱氢酶(LDH)和增殖的影响加入苦参碱24h后，G1-G8各组中LDH值与对照组C比无显著差异(P＞0.05)，G9-G10组与对照组C比差异显著(P＜0.05)。加入苦参碱24h后，从成纤维细胞的MTT比色吸光值的结果得出，苦参碱对增生性瘢痕成纤维细胞作用的增殖抑制率：在0.25～100mg/ml范围内成剂量依赖性抑制作用。见附表。
附表Mat不同浓度组与细胞培养上清液LDH、细胞增殖抑制率的关系
2.2PCNA检测结果显示，对照组增生性瘢痕成纤维细胞的细胞核内可见高密度棕黄色阳性信号，而经苦参碱作用后，其成纤维细胞的细胞核内可见淡黄色阴性信号，PCNA表达较弱，见图1，2(见封三彩页图B1、2)。
3讨论
3.1多年以来，医学界一直在寻找治疗瘢痕的有效途径。苦参碱是具有生物调节作用的生物碱，化学结构式为四环喹嗪啶类稠合体，分子量为248.37，分子式为C15H24N2O。为证实苦参碱对瘢痕的治疗作用，本文通过体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞的MTT和LDH实验，验证苦参碱对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖呈剂量依赖性抑制作用，随着苦参碱浓度升高，细胞呈抑制状态，在0.5mg/ml～5.0mg/ml细胞增殖抑制率约50%；通过细胞培养上清中的乳酸脱氢酶的检测，证实苦参碱在0.10mg/ml～100mg/ml对增生性瘢痕成纤维细胞不产生毒性作用，当浓度超过150mg/ml～200mg/ml时对增生性瘢痕成纤维细胞有毒性作用，在200mg/ml浓度时可致发生细胞坏死性改变。
3.2在细胞周期中，一些蛋白质的合成对于细胞进入由G0/G1期进入S期是必不可少的，如，降钙素、非组蛋白、染色体蛋白和PCNA等，PCNA又称周期蛋白(cyclin)，首先由Miyachi提纯〔4〕，PCNA单抗是针对增殖细胞核抗原(prolideration cell nuclear antigen)的抗体，其功能是DNA多聚酶δ的辅助因子，它的出现明显与细胞增殖有关，在静止期其量很少，G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2、M期明显下降〔5，6〕。故PCNA是了解细胞增殖活性状态的重要指标。本实验结果表明经苦参碱作用后PCNA的表达明显减弱，说明苦参碱可抑制呈活性增殖状态的瘢痕成纤维细胞，使其DNA的合成明显减少，增殖受阻。上述结果验证苦参碱对瘢痕成纤维细胞的增殖活性有明显的抑制作用，其抑制机制的研究有待于进一步深入，为利用中药、开发治疗增生性瘢痕的新途径提供依据。
［参考文献］
1Sherrell GA,Robert.WB,Char les.HM,et al. Grabb and Smiths Plastic Surgery［M］. Fifth Edition Litpincatp-Raver.New.York,1999:3～13
2汤苏阳，蔡宝仁，黄高升.中医药治疗瘢痕的研究进展［J］.中国美容医学，2000；9(6)：469
3司徒镇强，吴军正，刘斌等.细胞培养［M］.北京：世界图书出版社，第一版，1996：168～179
4Miyach K Frizier MJ TANEM.Autoantibodies to a nuclear antigen in proliferation cell［J］.J Immunol;1987;121(6):2228
5Prelich G,Tan CK,Kostura M.Blundell PA et al.Functional identity of proliferation cell nuclear antigen and a DNA polymerase-§ auxiliary protein［J］.Nature:1987:326(6113):517
6Rodrgo B,Heather MB.Existence of two population of cyclin/proliferating cell nuclear antigen duuing the cell cycle:Assiciation with DNA replication site［J］. Jcell Biol;1987;105(4):1549
收稿日期2000-10-24
编辑/樊延南
［关键词］苦参碱成纤维细胞增殖
［中图分类号］R619+.6［文献标识码］A［文章编号］1008-6455(2001)01-0006-03
THE INFLUENCE OF MATRINE ON THE GROWTH AND PROLIFERATION
OF SCAR-DERIVED FIBROBLASTS
TANG Su-yangCAI Bao-renHUANG Gao-sheng
Department of burn and plastic,205 Hospital of PLA(Jin Zhou 121001)china
［Abstract］Objective：To study the influence of Matrine on growth and proliferation of fibroblasts derived hgpertropnic scar.〖WT5"HZ〗Methods：The MTT OD value and the content of LDH was examined by biochemical analysis after Matrine was added to the monolayer culture system of scar-derived fibroblasts.The expressions of prolifrating cell nuclear antigen (PCNA)were examinedby immunochemied methed.Results：Mat at 0.10～100.mg/ml could decrease the MTT OD value in dose dependent manner amd could not increase the content of LDH significantly.The expression of PCNA in Mat groupswas highr than the control groups.Conclusion：Mat could inhibit the proliferation of derived hypertropnicscar fibroblasts rarely produce the toxicity on scar-derived fibroblasts.
［Key words］MatrineFibroblastProliferation
增生性瘢痕是创伤愈合的异常结局，可造成机体的形态改变和功能障碍。故研究创伤愈合、瘢痕形成的机制及其治疗一直是困绕整形外科的难题之一〔1〕。苦参类生物碱(Matrice 简称Mat)是以苦参碱为代表的、结构相似的一类生物碱。近年来，国内外在研究、使用苦参类生物碱的过程中发现其多方面的药理活性和临床功能，如：在中枢神经系统、心血管系统、免疫系统的作用，抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗纤维化疾病作用〔2〕。苦参碱也是我科多年以来使用的瘢痕软化膏的主要成分，其临床使用效果明显，能明显抑制瘢痕的增生，且使增生性瘢痕软化；目前无苦参碱对人增生性瘢痕作用的报道，但很可能是极具前途的治疗瘢痕增生的生物碱。通过体外培养的瘢痕成纤维细胞作为实验对象，观察苦参碱对其增殖的影响，为探讨苦参碱对瘢痕的治疗作用提供依据。
1材料和方法
1.1材料苦参碱标准品：由中国生物制品、药品检定所提供；DMEM，胰蛋白酶：由美国Gibco公司生产；新生牛血清：由杭州四季青生物工程材料研究所生产；DMSO由上海Sangen公司生产；MTT由美国Sigma公司生产。Ⅰ抗鼠抗人PCNA单克隆抗体，Ⅱ抗DokA Envision+〔TM〕购于丹麦DAKO公司，DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.2方法手术中取增生性瘢痕组四例，年龄2～25岁，在无菌条件下经漂洗、剪碎，培养于含200ml/L新生牛血清的DMEM培养液中，置37℃，CO2孵箱中培养，待长成致密单层后用2.5g/L胰蛋白酶消化，以1∶3传代。实验所用的细胞为第4～9代细胞。实验分成11组，药物浓度单位为mg/ml，详见附表。
1.2.1乳酸脱氢酶(LDH)的测定取对数生长期细胞，用24孔培养板培养，每孔接种2.5×104个细胞，置CO2孵箱内培养7d，每3d换液1次，按分组加入条件培养液后继续培养24h，取上清，用全自动生化分析仪测定LDH活性值。
1.2.2MTT比色法测定细胞增殖状况取对数生长期细胞，在96孔培养板中接种5×103个细胞+DMEM培养液200μL，置CO2孵箱内培养8h，吸弃上清，按分组加入条件培养液继续培养24h，加入MTT液10μL/孔振荡显色，自动酶联免疫分析仪测定A0值。(波长490nm)增殖抑制率(%)=〔1-(实验组吸光值-对照组吸光值)/对照组吸光值〕×100%〔3〕。
1.2.3PCNA检测取对数生长期细胞，将盖玻片置于6孔培养板内培养，每孔接种5×104个细胞，于CO2孵箱内培养24h后，分2组分别加入0.5～1.0mg/ml苦参碱条件培养液和空白加培养液组；培养24h后，用甲醇和丙酮固定，晾干24h后，中性树脂粘片，PBS冲洗振荡三次，每次5min，用1%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，甩干加Ⅰ抗，4℃过夜，复温1h，PBS冲洗振荡三次，每次5min。甩干加Ⅱ抗，放置37℃1h后，PBS冲洗振荡3次，每次5min。甩干，DAB显色。
2结果
2.1苦参碱对增生性瘢痕成纤维细胞乳酸脱氢酶(LDH)和增殖的影响加入苦参碱24h后，G1-G8各组中LDH值与对照组C比无显著差异(P＞0.05)，G9-G10组与对照组C比差异显著(P＜0.05)。加入苦参碱24h后，从成纤维细胞的MTT比色吸光值的结果得出，苦参碱对增生性瘢痕成纤维细胞作用的增殖抑制率：在0.25～100mg/ml范围内成剂量依赖性抑制作用。见附表。
附表Mat不同浓度组与细胞培养上清液LDH、细胞增殖抑制率的关系
2.2PCNA检测结果显示，对照组增生性瘢痕成纤维细胞的细胞核内可见高密度棕黄色阳性信号，而经苦参碱作用后，其成纤维细胞的细胞核内可见淡黄色阴性信号，PCNA表达较弱，见图1，2(见封三彩页图B1、2)。
3讨论
3.1多年以来，医学界一直在寻找治疗瘢痕的有效途径。苦参碱是具有生物调节作用的生物碱，化学结构式为四环喹嗪啶类稠合体，分子量为248.37，分子式为C15H24N2O。为证实苦参碱对瘢痕的治疗作用，本文通过体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞的MTT和LDH实验，验证苦参碱对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖呈剂量依赖性抑制作用，随着苦参碱浓度升高，细胞呈抑制状态，在0.5mg/ml～5.0mg/ml细胞增殖抑制率约50%；通过细胞培养上清中的乳酸脱氢酶的检测，证实苦参碱在0.10mg/ml～100mg/ml对增生性瘢痕成纤维细胞不产生毒性作用，当浓度超过150mg/ml～200mg/ml时对增生性瘢痕成纤维细胞有毒性作用，在200mg/ml浓度时可致发生细胞坏死性改变。
3.2在细胞周期中，一些蛋白质的合成对于细胞进入由G0/G1期进入S期是必不可少的，如，降钙素、非组蛋白、染色体蛋白和PCNA等，PCNA又称周期蛋白(cyclin)，首先由Miyachi提纯〔4〕，PCNA单抗是针对增殖细胞核抗原(prolideration cell nuclear antigen)的抗体，其功能是DNA多聚酶δ的辅助因子，它的出现明显与细胞增殖有关，在静止期其量很少，G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2、M期明显下降〔5，6〕。故PCNA是了解细胞增殖活性状态的重要指标。本实验结果表明经苦参碱作用后PCNA的表达明显减弱，说明苦参碱可抑制呈活性增殖状态的瘢痕成纤维细胞，使其DNA的合成明显减少，增殖受阻。上述结果验证苦参碱对瘢痕成纤维细胞的增殖活性有明显的抑制作用，其抑制机制的研究有待于进一步深入，为利用中药、开发治疗增生性瘢痕的新途径提供依据。
［参考文献］
1Sherrell GA,Robert.WB,Char les.HM,et al. Grabb and Smiths Plastic Surgery［M］. Fifth Edition Litpincatp-Raver.New.York,1999:3～13
2汤苏阳，蔡宝仁，黄高升.中医药治疗瘢痕的研究进展［J］.中国美容医学，2000；9(6)：469
3司徒镇强，吴军正，刘斌等.细胞培养［M］.北京：世界图书出版社，第一版，1996：168～179
4Miyach K Frizier MJ TANEM.Autoantibodies to a nuclear antigen in proliferation cell［J］.J Immunol;1987;121(6):2228
5Prelich G,Tan CK,Kostura M.Blundell PA et al.Functional identity of proliferation cell nuclear antigen and a DNA polymerase-§ auxiliary protein［J］.Nature:1987:326(6113):517
6Rodrgo B,Heather MB.Existence of two population of cyclin/proliferating cell nuclear antigen duuing the cell cycle:Assiciation with DNA replication site［J］. Jcell Biol;1987;105(4):1549
收稿日期2000-10-24
编辑/樊延南