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【摘要】 目的：研究结肠癌组织白细胞介素-10（IL-10）和干扰素-γ（IFN-γ）的基因表达及其相关的启动子区甲基化状态。方法：随机选取2011年1月-2014年6月80例结肠癌患者组织为结肠癌组、80例相应癌旁组织为癌旁组和100例正常健康者结肠组织为对照组。采用亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性PCR和实时荧光定量PCR检测对IL-10和IFN-γ基因的甲基化状况进行检测，分析其与结肠癌主要临床特征之间的关系。结果：三组组织的IL-10和IFN-γ mRNA 水平之间比较，差异均有统计学意义（P<0.05），其中结肠癌组和癌旁组组织的IL-10 mRNA均高于对照组（P<0.05），结肠癌组和癌旁组组织的IFN-γ mRNA均低于对照组（P<0.05）；三组IL-10基因启动子区-110，-185位点甲基化率比较，差异均有有统计学意义（P<0.05），其中结肠癌组和癌旁组组织的IL-10基因启动子区-110均高于对照组（P<0.05），结肠癌组组织的IL-10基因启动子区-185低于对照组（P<0.05）；IFN-γ基因启动子区甲基化率结肠癌组>癌旁组>对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：IL-10和IFN-γ基因启动子区甲基化状态影响其在结肠癌组织中的表达，结肠癌患者处于TH2极化状态，与结肠癌发生发展密切相关。
【关键词】 结肠肿瘤； DNA甲基化； 组织； 干扰素-γ； 白细胞介素-10
结肠癌患者机体内免疫微环境的变化已经受到人们的重视，其中辅助性T细胞（Th）亚群Th1/Th2的失衡在恶性肿瘤免疫逃逸与免疫耐受中非常重要[1]。在哺乳动物细胞基因组中，约有3%～5%的胞嘧啶被甲基化，基因甲基化异常与结肠癌变化密切相关[2]，因此制定结肠癌Th1、Th2相关细胞因子DNA甲基化谱对结肠癌的早期诊断有重要意义。本文通过检测结肠癌患者结肠组织中Th1/Th2型细胞因子白细胞介素-10（IL-10）和干扰素-γ（IFN-γ）基因启动子区甲基化状态及转录活性，旨在探讨DNA甲基化与基因表达的关系及其在结肠癌中的作用，为结肠癌的诊断和治疗提供新的靶点。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机选取2011年1月-2014年6月本院住院部就诊的80例结肠癌患者组织为结肠癌组、80例相应癌旁组织为癌旁组和100例正常结肠组织为对照组。结肠癌患者年龄34～75岁，中位年龄49岁，男55例，女25例，病理类型均为鳞癌，根据WHO标准分级[3]，高分化鳞癌14例，中分化鳞癌42例，低分化鳞癌24例。对照组32～75岁，中位年龄49岁。收集三组患者的结肠组织标本，其中对照组标本来源于结肠息肉组织，结肠癌组标本来源于结肠活检和手术治疗，癌旁组标本来源于结肠癌旁组织手术，结肠癌患者所有手术标本均经过本院病理学专家明确诊断，在患者手术中取病理标本，标本放入液氮中速冻后-80 ℃条件下保存待检，样本获得了伦理委员会批准并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 目标标本相关的DNA和RNA提取 均按试剂盒说明书提供的方法提取三组结肠组织DNA与RNA，并采用琼脂糖凝胶电泳并鉴定DNA和RNA完整性。
1.2.2 IL-10和IFN-γ基因启动子区甲基化检测 按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit试剂盒（购自美国Zymoresearch公司）操作说明对DNA进行甲基化修饰及纯化。在NCBI线上检索IFN-γ（J00219）和IL-10（AF418271）基因启动子区序列，Methyl Primer Express V2.0软件进行分析核对参考物[4]，亚硫酸氢盐测序法（BSP）检测IL-10基因启动子。基化特异性PCR（MSP）检测IFN-γ基因启动子区非甲基化及甲基化基因，IL-10和IFN-γ基因启动子区序列一甲基化特异性PCR和RT-PCR 引物序列如表1所示。基化结果判断：出现甲基化特异性引物扩增产物判断定为甲基化，仅非甲基化特异性引物扩增产物判断定为非甲基化。
1.3 统计学处理 数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以 （x±s）表示，采用t检验，计数资料采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组结肠组织IL-10和IFN-γ mRNA的表达比较 三组IL-10和IFN-γ mRNA 水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05），其中结肠癌组和癌旁组IL-10 mRNA均高于对照组（P<0.05），IFN-γ mRNA均低于对照组（P<0.05），结果见表2。
2.2 三组IL-10和IFN-γ基因启动子区甲基化率比较 三组结肠组织IL-10基因启动子区-320、-350、
-352、-373位点甲基化率进行相互比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；三组结肠组织基因启动子区-110、-185位点甲基化率进行相互比较，差异均有统计学意义（P<0.05），其中结肠癌组和癌旁组IL-10基因启动子区-110均高于健康对照组（P<0.05），结肠癌组IL-10基因启动子区-185低于健康对照组（P<0.05），结果见表3；IFN-γ基因启动子区甲基化率结肠癌组>癌旁组>对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），结果见表3；三组结肠组织提取DNA的IFN-γ基因启动子区甲基化状态见电泳图1。
2.3 IL-10基因启动子区 通过在线的TFSEARCH软件分析发现，IL-10基因启动子区包含有STAT3或Ets-1、HSF、CCAAT-box、HSF与AP-4、ER共5个转录因子结合域，见图2。
3 讨论
机体Th1介导的细胞免疫在体内抑制肿瘤生发展中扮演的重要角色，而Th1向Th1漂移，将造成机体免疫抑制状态，使肿瘤能够逃避免疫监视[5-6]。IFN-γ是Th1类分泌的主要较早抗肿瘤细胞因子之一，且协助肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导Th0细胞向Th1极化；IL-10是Th2类分泌免疫抑制细胞因子，是一种抑制或者下调的Th1型免疫反应的细胞因子，具有多种抑制抗肿瘤免疫应答的物生作用，使肿瘤细胞免疫耐受。IL-10高表达则促进机体肿瘤细胞生长发育。笔者研究结果表明，结肠癌患者IL-10表达水平明显比健康者强，抗肿瘤相关的IFN-γ则低表达，这说明，机体正处于明显的Th1/Th2失衡状态，Th0细胞向Th2漂移极化现象，T细胞对肿瘤抗原肽的无能状态，这是结肠癌患者免疫监视功能严重低下的最主要原因。 DNA甲基化主要在mRNA转录基因水平抑制细胞因子基因的表达，CpG岛甲基化与其所在基因的表达呈反比，即CpG岛甲基化程度越高，mRNA基因表达水平越低，反之则越高[7-8]。本研究对三组不同结肠组织的IL-10和IFN-γ基因的甲基化状态进行在线的TFSEARCH软件分析，结肠癌患者结肠癌组织IL-10基因启动子区-185位点甲基化率明显较低，使IFN-γ甲基化率异常性增高，这与张磊昌等[9]相关研究报道一致，说明DNA甲基化导致基因表达异常，丧失对细胞生长的抑制作用及对异常细胞的诱导凋亡作用，造成免疫功能低下，促使癌细胞的过度增殖，从而可能导致了肿瘤的发生。
DNA甲基化在生物界是一种正常的自然修饰方式，在DNA甲基转移酶的催化下，将甲基转移到特定碱基上的过程DNA甲基化引起抑癌基因转录抑制，其中约70%～80%的甲基化发生在CpG序列上，结肠癌组织IL-10基因CpG岛的甲基化率较低，这与结肠癌细胞中发现IL-10基因的转录因子SP1、CCAAT-box、STAT3和Ets-1有关[9-10]。因此，本研究采用BSP进一步论证了甲基化对IL-10基因的转录活性的影响，在结肠癌组织中IL-10基因启动子高甲基化的发生率明显高于正常健康组织，IL-10的表达调控受多种因素的影响，IL-10的DNA甲基化修饰在这个过程中起重要作用[11-12]。笔者通过DNA序列的转录因子结合位点预测，发现结肠癌组的IL-10的DNA甲基-110、-185位点的甲基化率明显高于对照组，他们影响5个转录因子位点相结合活性，从而造成结肠癌的IL-10基因启动因子活性增高致使IL-10基因高的表达，并且负调控IFN-γ mRNA的表达，对结肠癌细胞的增生、凋亡、分化起负性调控作用，使结肠癌细胞免疫耐受，逃避机体免疫监视。
综上所述，IL-10和IFN-γ基因启动子区甲基化状态使IL-10基因高的表达和IFN-γ mRNA低的表达，使结肠癌患者处于明显的Th1/Th2失衡状态，Th0细胞向Th2漂移极化现象，与结肠癌发生发展密切相关。
参考文献
[1] 陈远崇，陈竹雨.结直肠癌患者血清Th1/Th2细胞因子水平变化及其临床意义研究[J].中国全科医学杂志社，2011，14（12）：4136-4138.
[2]陈绍勤，陈志华，林素勇，等.5-杂氮-2’-脱氧胞苷对人结直肠癌HCT216细胞KISS2基因表达及侵袭迁移的影响[J].肿瘤， 2014，34（1）：26-32.
[3]王广华.腹腔镜结肠癌手术应用于结肠癌不同分期的合理性探究[J].中国实用医药，2012，7（28）：89.
[4] Subramaniam M M，Chan J Y，Soong R，et a1.RUNX3 inactivation by frequent promoter hypermethylation and protein misloealization constitute an early event in breast cancer progression[J].Breast Cancer Res Treat，2009，113（1）：l13-121.
[5] 木尔扯尔，文彬，黄一凡.β-catenin 与 wisp-1在结肠癌中的表达及意义[J].现代肿瘤医学，2014，22（2）：366-370.
[6]何文.外周血T细胞亚群检测在恶性肿瘤中的应用[J].临床医学，2012，32（4）：98-99.
[7]林昀，张云丽，胡昕，等.PEG10基因在肝癌组织中高表达的分子机制及其功能的研究[J].肿瘤，2013，33（1）：28-35.
[8]杨涛，邵江河，李启英.树突状细胞联合CIK 细胞应用于恶性实体瘤治疗的临床疗效观察[J].肿瘤，2010，30（8）：700-705.
[9]张磊昌，何纯钢，曹云飞，等.散发性结直肠癌组织p33ING1b启动子甲基化情况及其意义[J].中国全科医学，2014，17（14）：1617-1620.
[10]高燕，张厚德，林菊生，等.人肝癌父系表达基因10的遗传印记状态[J].中华肝脏病杂志， 2O10，18（12）：894-899.
[11]金奎，陈雄飞，周宁新.DC联合CIK免疫治疗术后晚期胆管癌72例疗效观察[J].中国全科医学，2014，17（14）：1617-1620.
[12] Zhang Y，Lyver E R，Nakamaru-Ogiso E，et al.Dre2，aconserved eukaryotic Fe/S cluster protein，functions in cytosotic Fe/S protein biogenesis[J].Mol Cell Biol，2008，28（12）：5569-5582.
（收稿日期：2014-12-09） （本文编辑：陈丹云）
【关键词】 结肠肿瘤； DNA甲基化； 组织； 干扰素-γ； 白细胞介素-10
结肠癌患者机体内免疫微环境的变化已经受到人们的重视，其中辅助性T细胞（Th）亚群Th1/Th2的失衡在恶性肿瘤免疫逃逸与免疫耐受中非常重要[1]。在哺乳动物细胞基因组中，约有3%～5%的胞嘧啶被甲基化，基因甲基化异常与结肠癌变化密切相关[2]，因此制定结肠癌Th1、Th2相关细胞因子DNA甲基化谱对结肠癌的早期诊断有重要意义。本文通过检测结肠癌患者结肠组织中Th1/Th2型细胞因子白细胞介素-10（IL-10）和干扰素-γ（IFN-γ）基因启动子区甲基化状态及转录活性，旨在探讨DNA甲基化与基因表达的关系及其在结肠癌中的作用，为结肠癌的诊断和治疗提供新的靶点。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机选取2011年1月-2014年6月本院住院部就诊的80例结肠癌患者组织为结肠癌组、80例相应癌旁组织为癌旁组和100例正常结肠组织为对照组。结肠癌患者年龄34～75岁，中位年龄49岁，男55例，女25例，病理类型均为鳞癌，根据WHO标准分级[3]，高分化鳞癌14例，中分化鳞癌42例，低分化鳞癌24例。对照组32～75岁，中位年龄49岁。收集三组患者的结肠组织标本，其中对照组标本来源于结肠息肉组织，结肠癌组标本来源于结肠活检和手术治疗，癌旁组标本来源于结肠癌旁组织手术，结肠癌患者所有手术标本均经过本院病理学专家明确诊断，在患者手术中取病理标本，标本放入液氮中速冻后-80 ℃条件下保存待检，样本获得了伦理委员会批准并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 目标标本相关的DNA和RNA提取 均按试剂盒说明书提供的方法提取三组结肠组织DNA与RNA，并采用琼脂糖凝胶电泳并鉴定DNA和RNA完整性。
1.2.2 IL-10和IFN-γ基因启动子区甲基化检测 按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit试剂盒（购自美国Zymoresearch公司）操作说明对DNA进行甲基化修饰及纯化。在NCBI线上检索IFN-γ（J00219）和IL-10（AF418271）基因启动子区序列，Methyl Primer Express V2.0软件进行分析核对参考物[4]，亚硫酸氢盐测序法（BSP）检测IL-10基因启动子。基化特异性PCR（MSP）检测IFN-γ基因启动子区非甲基化及甲基化基因，IL-10和IFN-γ基因启动子区序列一甲基化特异性PCR和RT-PCR 引物序列如表1所示。基化结果判断：出现甲基化特异性引物扩增产物判断定为甲基化，仅非甲基化特异性引物扩增产物判断定为非甲基化。
1.3 统计学处理 数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以 （x±s）表示，采用t检验，计数资料采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组结肠组织IL-10和IFN-γ mRNA的表达比较 三组IL-10和IFN-γ mRNA 水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05），其中结肠癌组和癌旁组IL-10 mRNA均高于对照组（P<0.05），IFN-γ mRNA均低于对照组（P<0.05），结果见表2。
2.2 三组IL-10和IFN-γ基因启动子区甲基化率比较 三组结肠组织IL-10基因启动子区-320、-350、
-352、-373位点甲基化率进行相互比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；三组结肠组织基因启动子区-110、-185位点甲基化率进行相互比较，差异均有统计学意义（P<0.05），其中结肠癌组和癌旁组IL-10基因启动子区-110均高于健康对照组（P<0.05），结肠癌组IL-10基因启动子区-185低于健康对照组（P<0.05），结果见表3；IFN-γ基因启动子区甲基化率结肠癌组>癌旁组>对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），结果见表3；三组结肠组织提取DNA的IFN-γ基因启动子区甲基化状态见电泳图1。
2.3 IL-10基因启动子区 通过在线的TFSEARCH软件分析发现，IL-10基因启动子区包含有STAT3或Ets-1、HSF、CCAAT-box、HSF与AP-4、ER共5个转录因子结合域，见图2。
3 讨论
机体Th1介导的细胞免疫在体内抑制肿瘤生发展中扮演的重要角色，而Th1向Th1漂移，将造成机体免疫抑制状态，使肿瘤能够逃避免疫监视[5-6]。IFN-γ是Th1类分泌的主要较早抗肿瘤细胞因子之一，且协助肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导Th0细胞向Th1极化；IL-10是Th2类分泌免疫抑制细胞因子，是一种抑制或者下调的Th1型免疫反应的细胞因子，具有多种抑制抗肿瘤免疫应答的物生作用，使肿瘤细胞免疫耐受。IL-10高表达则促进机体肿瘤细胞生长发育。笔者研究结果表明，结肠癌患者IL-10表达水平明显比健康者强，抗肿瘤相关的IFN-γ则低表达，这说明，机体正处于明显的Th1/Th2失衡状态，Th0细胞向Th2漂移极化现象，T细胞对肿瘤抗原肽的无能状态，这是结肠癌患者免疫监视功能严重低下的最主要原因。 DNA甲基化主要在mRNA转录基因水平抑制细胞因子基因的表达，CpG岛甲基化与其所在基因的表达呈反比，即CpG岛甲基化程度越高，mRNA基因表达水平越低，反之则越高[7-8]。本研究对三组不同结肠组织的IL-10和IFN-γ基因的甲基化状态进行在线的TFSEARCH软件分析，结肠癌患者结肠癌组织IL-10基因启动子区-185位点甲基化率明显较低，使IFN-γ甲基化率异常性增高，这与张磊昌等[9]相关研究报道一致，说明DNA甲基化导致基因表达异常，丧失对细胞生长的抑制作用及对异常细胞的诱导凋亡作用，造成免疫功能低下，促使癌细胞的过度增殖，从而可能导致了肿瘤的发生。
DNA甲基化在生物界是一种正常的自然修饰方式，在DNA甲基转移酶的催化下，将甲基转移到特定碱基上的过程DNA甲基化引起抑癌基因转录抑制，其中约70%～80%的甲基化发生在CpG序列上，结肠癌组织IL-10基因CpG岛的甲基化率较低，这与结肠癌细胞中发现IL-10基因的转录因子SP1、CCAAT-box、STAT3和Ets-1有关[9-10]。因此，本研究采用BSP进一步论证了甲基化对IL-10基因的转录活性的影响，在结肠癌组织中IL-10基因启动子高甲基化的发生率明显高于正常健康组织，IL-10的表达调控受多种因素的影响，IL-10的DNA甲基化修饰在这个过程中起重要作用[11-12]。笔者通过DNA序列的转录因子结合位点预测，发现结肠癌组的IL-10的DNA甲基-110、-185位点的甲基化率明显高于对照组，他们影响5个转录因子位点相结合活性，从而造成结肠癌的IL-10基因启动因子活性增高致使IL-10基因高的表达，并且负调控IFN-γ mRNA的表达，对结肠癌细胞的增生、凋亡、分化起负性调控作用，使结肠癌细胞免疫耐受，逃避机体免疫监视。
综上所述，IL-10和IFN-γ基因启动子区甲基化状态使IL-10基因高的表达和IFN-γ mRNA低的表达，使结肠癌患者处于明显的Th1/Th2失衡状态，Th0细胞向Th2漂移极化现象，与结肠癌发生发展密切相关。
参考文献
[1] 陈远崇，陈竹雨.结直肠癌患者血清Th1/Th2细胞因子水平变化及其临床意义研究[J].中国全科医学杂志社，2011，14（12）：4136-4138.
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[5] 木尔扯尔，文彬，黄一凡.β-catenin 与 wisp-1在结肠癌中的表达及意义[J].现代肿瘤医学，2014，22（2）：366-370.
[6]何文.外周血T细胞亚群检测在恶性肿瘤中的应用[J].临床医学，2012，32（4）：98-99.
[7]林昀，张云丽，胡昕，等.PEG10基因在肝癌组织中高表达的分子机制及其功能的研究[J].肿瘤，2013，33（1）：28-35.
[8]杨涛，邵江河，李启英.树突状细胞联合CIK 细胞应用于恶性实体瘤治疗的临床疗效观察[J].肿瘤，2010，30（8）：700-705.
[9]张磊昌，何纯钢，曹云飞，等.散发性结直肠癌组织p33ING1b启动子甲基化情况及其意义[J].中国全科医学，2014，17（14）：1617-1620.
[10]高燕，张厚德，林菊生，等.人肝癌父系表达基因10的遗传印记状态[J].中华肝脏病杂志， 2O10，18（12）：894-899.
[11]金奎，陈雄飞，周宁新.DC联合CIK免疫治疗术后晚期胆管癌72例疗效观察[J].中国全科医学，2014，17（14）：1617-1620.
[12] Zhang Y，Lyver E R，Nakamaru-Ogiso E，et al.Dre2，aconserved eukaryotic Fe/S cluster protein，functions in cytosotic Fe/S protein biogenesis[J].Mol Cell Biol，2008，28（12）：5569-5582.
（收稿日期：2014-12-09） （本文编辑：陈丹云）