【摘 要】
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目的 利用酵母双杂交系统鉴定巨噬细胞移动抑制因子(MIF)与Ⅱ型穿膜蛋白CD74胞外片段间可能的相互作用区域.方法 利用分子克隆技术,分别构建以pGBKT7为载体的人全长MIF、MIF~
【机 构】
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广东省人民医院医学研究中心/广东省心血管病研究所
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目的 利用酵母双杂交系统鉴定巨噬细胞移动抑制因子(MIF)与Ⅱ型穿膜蛋白CD74胞外片段间可能的相互作用区域.方法 利用分子克隆技术,分别构建以pGBKT7为载体的人全长MIF、MIF~(50-65)、MIF~(1-50/65-115)的重组诱饵质粒,以pGADT7为载体的人CD74~(73-232)、CD74~(73-109)、CD74~(109-149)、CD74~(149-232)的重组激活域(AD)质粒.用PEG/LiAC法将上述重组诱饵质粒分别与重组AD质粒两两共转化感受态酵母菌AH109,分别观察在SD/-Trp-Len、含X-α-gal的SD/-Trp-Leu-Ade-His培养基上生长情况.结果 限制性内切酶酶切和DNA测序证实所构建的重组质粒全部正确.3种重组诱饵质粒转化的酵母菌AH109均可在SD/-trp上生长,4种重组AD质粒转化的酵母菌AH109均可在SD/-len上生长,而且上述转化的酵母菌AH109均无自身转录激活活性.只有MIF、MIF~(50-65)、MIF~(1-50/-65-115)与CD74~(73-232)表达质粒共转化的酵母菌AH109可在SD/-Trp-Leu-Ade-His培养基上生长,能激活MEL1报告基因,使X-α-gal变蓝.结论 MIF能以功能域MIF~(50-65)非依赖性方式与完整的CD74胞外片段相互结合.进行细胞信号转导.
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