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【摘要】 目的：研究腺苷脱氨酶2（Adenosine deaminase 2，ADA2）在结核性胸积液总ADA活性所占比例，及其在结核性胸积液胸膜组织中的细胞来源。方法：测定确诊的32例x结核性胸积液ADA2的总ADA和ADA2活性，以ADA2抗体为一抗，用免疫组化方法检测ADA2在结核性胸积液胸膜组织中的细胞来源。结果：ADA2活性占总ADA的74.8%。结核性胸积液胸膜组织的ADA2免疫组化，可见朗格汉斯巨细胞、上皮样细胞和巨噬细胞被深染，胞浆和胞膜有大量的棕黄色沉着。结论：结核性胸积液的ADA活性主要由ADA2构成，ADA2源自巨噬细胞、上皮样细胞和朗格汉斯巨细胞。
【关键词】 结核性胸积液； 腺苷脱氨酶； 同工酶； 腺苷脱氨酶2； 免疫组化
Study on the Activity and Immunohistochemistry of Adenosine Deaminase 2 in Tuberculosis Pleural Effusion/LI Fang-zhi，HUANG Guang-xiong，LU Feng-yue.//Medical Innovation of China，2015，12（18）：039-040
【Abstract】 Objective：To investigate the proportion of Adenosine deaminase 2（ADA2） in total ADA activity of the tuberculosis pleural effusion and its cellular source in pleural tissue.Method：The total ADA and ADA2 activity from thirty-two tuberculosis patients’ effusions were measured.The cellular source of ADA2 were examined by immunohistochemistry method using CECR1 antibody.Result：The ADA2 contributed 74.8% to the total ADA.The immunohistochemistry of ADA2 in the pleural tissues of tuberculous pleural effusion showed that langhans cells，epithelioid cells and macrophages were stained deeply.Their cytoplasm and membrane were deposited by yellow granules.Conclusion：ADA2 is primarily responsible for total ADA activity in tuberculosis pleural effusion and it is secreted by macrophages，epithelioid cells and langhans cells.
【Key words】 Tuberculosis pleural effusion； Adenosine deaminase； Isoenzymes； Adenosine deaminase 2； Immunohistochemistry
First-author’s address：Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou 510095，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.18.014
胸积液中腺苷脱氨酶（ADA） 活性升高是诊断结核性胸积液重要的辅助指标之一。ADA有2 种同工酶：ADA1 和ADA2。结核性胸积液ADA活性的升高主要是由ADA同工酶ADA2增高所致，所以ADA2检测在结核性胸积液的诊断有重要作用[1]。Ungerer等[2]检测正常人全身细胞，发现仅单核巨噬细胞有ADA2。本研究通过检测结核性胸腔积液总ADA 和ADA2活性，并用免疫组化方法检测ADA2在结核性胸积液胸膜组织细胞中的细胞分布，以进一步了解ADA2的细胞来源和其在结核性胸积液中的作用机理。
1 资料与方法
1.1 一般资料 32例本院结核性胸积液患者，经细菌学或病理活检确诊，胸积液性质为渗出液。
1.2 方法 红-9-（2-羟基-3-壬烷基）腺嘌呤（EHNA）能完全抑制ADA1活性，但不能抑制ADA2活性，参照Muraoka等[3]使用的方法，将每份胸积液标本分成2管，第一管直接测量ADA活性，即为总ADA（ADA1+ADA2），第二管加入EHNA后测量所得的ADA活性为ADA2活性，采用迈克公司腺苷脱氨酶（ADA）检测试剂盒，罗氏P80自动生化仪测定；ADA2（也称为CECR1）兔抗人多克隆抗体购自Sigma公司，巨噬细胞表面标志物CD68兔抗人多克隆抗体购自博士德公司，辣根过氧化酶标记Envision二步法二抗，购自Dako公司。以免疫组化（Envision二步法）作结核性胸积液胸膜组织的ADA2和巨噬细胞表面标志物CD68的免疫组化：同一蜡块组织以3 ?m间距连切两份，一份以ADA2抗体为一抗工作液作实验对象，另一份以巨噬细胞表面标志物CD68抗体代替ADA2抗体作为一抗的免疫组化为阳性对照。
1.3 阳性判断标准 实验结果判定以胞质内和胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性。用PBS代替ADA2抗体作为一抗的免疫组化为阴性对照。CD68抗体代替ADA2抗体作为一抗的免疫组化为阳性对照。
1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果
2.1 患者ADA1与ADA2情况比较 患者结核性胸积液中总ADA为（51.88±23.02）U/L，ADA1为（13.04±7.94）U/L，ADA2为（38.84±18.71），ADA2活性占总ADA的74.8%，ADA2活性高于ADA1，差异有统计学意义（t=8.48，P<0.01）。
2.2 结核性胸积液活检的胸膜组织免疫组化结果 PBS代替一抗（ADA2抗体）免疫组化的阴性对照，显示胸膜组织的各种细胞无棕黄色颗粒沉着。结核性胸积液胸膜组织的ADA2免疫组化（图1），可见巨噬细胞、朗格汉斯巨细胞和上皮样细胞被深染，胞浆和胞膜有大量的棕黄色沉着，淋巴细胞、成纤维细胞和其他细胞无棕黄色沉着；结核性胸积液胸膜组织的ADA2（图2）和巨噬细胞表面标志物CD68（图3）的免疫组化均可见巨噬细胞、朗格汉斯巨细胞和上皮样细胞被深染，胞浆和胞膜有大量的棕黄色沉着，其他细胞无棕黄色沉着。图2和图3的染色效果相似。
3 讨论
本研究显示结核性胸腔积液总ADA活性中，ADA2平均占74.8%，其总ADA活性主要是由ADA2所构成，提示结核性胸腔积液总ADA活性升高主要由ADA2所致。胸膜组织ADA2免疫组化结果和巨噬细胞表面标志物CD68免疫组化结果相似，巨噬细胞、朗格汉斯巨细胞和上皮样细胞被深染棕黄色，显示ADA2来源于巨噬细胞、上皮样细胞和朗格汉斯巨细胞。结核性炎症渗出的细胞常以单核细胞为主，单核细胞经血管进入组织后演变为巨噬细胞，活化的巨噬细胞吞食消化结核分枝杆菌后转化而成上皮样细胞，多个上皮样细胞融合成朗格汉斯巨细胞，而结核菌的菌体脂质促使巨噬细胞转变成上皮样细胞和朗格汉斯巨细胞，所以这些细胞都属同一细胞来源[4]。Zavialov等[5]报道单核细胞转化为巨噬细胞时会产生ADA2；而在炎症反应时，巨噬细胞能分泌ADA2[6]。ADA2能诱导单核细胞分化成巨噬细胞，并且使巨噬细胞和CD4+T细胞增殖，另一种同功酶ADA1则不能诱导单核细胞分化成巨噬细胞，在结核性胸积液中含有大量的巨噬细胞和CD4+T细胞[7]，宿主抗结核免疫主要是通过以T淋巴细胞介导、巨噬细胞为效应的细胞免疫反应，所以ADA2使巨噬细胞和CD4+T细胞增殖的作用可能有利于机体抗结核。结核性胸积液ADA2活性升高主要是由于宿主单核巨噬细胞、上皮样细胞、朗格汉斯巨细胞等和结核菌相互作用的结果。
综上所述，结核性胸积液的ADA活性主要由ADA2构成，ADA2源自巨噬细胞、上皮样细胞和朗格汉斯巨细胞。
参考文献
[1]田瑞雪.干扰素γ、白细胞介素12及腺苷脱氨酶同工酶对结核性胸腔积液的诊断价值[J].中华结核和呼吸杂志，2004，27（7）：6-9.
[2] Ungerer J P，Oosthuizen H M，Bissbort S H，et al.Serum adenosine deaminase：isoenzymes and diagnostic application[J].Clin Chem，1992，38（7）：1322-1326.
[3] Muraoka T，Katsuramaki T，Shiraishi H，et al.Automated enzymatic measurement of adenosine deaminase isoenzyme activities in serum[J].Anal Biochem，1990，187（2）：268-272.
[4] Van Crevel R，Ottenhoff T H，Van der Meer J W.Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis[J].Clin Microbiol Rev，2002，15（2）：294-309.
[5] Zavialov A V，Gracia E，Glaichenhaus N，et al.Human adenosine deaminase 2 induces differentiation of monocytes into macrophages and stimulates proliferation of T helper cells and macrophages[J].J Leukoc Biol，2010，88（2）：279-290.
[6] Conlon B A，Law W R.Macrophages are a source of extracellular adenosine deaminase-2 during inflammatory responses[J].Clin Exp Immunol，2004，138（1）：14-20.
[7] Valdes L，Pose A，San J E，et al.Tuberculous pleural effusions[J].Eur J Intern Med，2003，14（2）：77-88.
（收稿日期：2015-01-16） （本文编辑：陈丹云）
【关键词】 结核性胸积液； 腺苷脱氨酶； 同工酶； 腺苷脱氨酶2； 免疫组化
Study on the Activity and Immunohistochemistry of Adenosine Deaminase 2 in Tuberculosis Pleural Effusion/LI Fang-zhi，HUANG Guang-xiong，LU Feng-yue.//Medical Innovation of China，2015，12（18）：039-040
【Abstract】 Objective：To investigate the proportion of Adenosine deaminase 2（ADA2） in total ADA activity of the tuberculosis pleural effusion and its cellular source in pleural tissue.Method：The total ADA and ADA2 activity from thirty-two tuberculosis patients’ effusions were measured.The cellular source of ADA2 were examined by immunohistochemistry method using CECR1 antibody.Result：The ADA2 contributed 74.8% to the total ADA.The immunohistochemistry of ADA2 in the pleural tissues of tuberculous pleural effusion showed that langhans cells，epithelioid cells and macrophages were stained deeply.Their cytoplasm and membrane were deposited by yellow granules.Conclusion：ADA2 is primarily responsible for total ADA activity in tuberculosis pleural effusion and it is secreted by macrophages，epithelioid cells and langhans cells.
【Key words】 Tuberculosis pleural effusion； Adenosine deaminase； Isoenzymes； Adenosine deaminase 2； Immunohistochemistry
First-author’s address：Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou 510095，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.18.014
胸积液中腺苷脱氨酶（ADA） 活性升高是诊断结核性胸积液重要的辅助指标之一。ADA有2 种同工酶：ADA1 和ADA2。结核性胸积液ADA活性的升高主要是由ADA同工酶ADA2增高所致，所以ADA2检测在结核性胸积液的诊断有重要作用[1]。Ungerer等[2]检测正常人全身细胞，发现仅单核巨噬细胞有ADA2。本研究通过检测结核性胸腔积液总ADA 和ADA2活性，并用免疫组化方法检测ADA2在结核性胸积液胸膜组织细胞中的细胞分布，以进一步了解ADA2的细胞来源和其在结核性胸积液中的作用机理。
1 资料与方法
1.1 一般资料 32例本院结核性胸积液患者，经细菌学或病理活检确诊，胸积液性质为渗出液。
1.2 方法 红-9-（2-羟基-3-壬烷基）腺嘌呤（EHNA）能完全抑制ADA1活性，但不能抑制ADA2活性，参照Muraoka等[3]使用的方法，将每份胸积液标本分成2管，第一管直接测量ADA活性，即为总ADA（ADA1+ADA2），第二管加入EHNA后测量所得的ADA活性为ADA2活性，采用迈克公司腺苷脱氨酶（ADA）检测试剂盒，罗氏P80自动生化仪测定；ADA2（也称为CECR1）兔抗人多克隆抗体购自Sigma公司，巨噬细胞表面标志物CD68兔抗人多克隆抗体购自博士德公司，辣根过氧化酶标记Envision二步法二抗，购自Dako公司。以免疫组化（Envision二步法）作结核性胸积液胸膜组织的ADA2和巨噬细胞表面标志物CD68的免疫组化：同一蜡块组织以3 ?m间距连切两份，一份以ADA2抗体为一抗工作液作实验对象，另一份以巨噬细胞表面标志物CD68抗体代替ADA2抗体作为一抗的免疫组化为阳性对照。
1.3 阳性判断标准 实验结果判定以胞质内和胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性。用PBS代替ADA2抗体作为一抗的免疫组化为阴性对照。CD68抗体代替ADA2抗体作为一抗的免疫组化为阳性对照。
1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果
2.1 患者ADA1与ADA2情况比较 患者结核性胸积液中总ADA为（51.88±23.02）U/L，ADA1为（13.04±7.94）U/L，ADA2为（38.84±18.71），ADA2活性占总ADA的74.8%，ADA2活性高于ADA1，差异有统计学意义（t=8.48，P<0.01）。
2.2 结核性胸积液活检的胸膜组织免疫组化结果 PBS代替一抗（ADA2抗体）免疫组化的阴性对照，显示胸膜组织的各种细胞无棕黄色颗粒沉着。结核性胸积液胸膜组织的ADA2免疫组化（图1），可见巨噬细胞、朗格汉斯巨细胞和上皮样细胞被深染，胞浆和胞膜有大量的棕黄色沉着，淋巴细胞、成纤维细胞和其他细胞无棕黄色沉着；结核性胸积液胸膜组织的ADA2（图2）和巨噬细胞表面标志物CD68（图3）的免疫组化均可见巨噬细胞、朗格汉斯巨细胞和上皮样细胞被深染，胞浆和胞膜有大量的棕黄色沉着，其他细胞无棕黄色沉着。图2和图3的染色效果相似。
3 讨论
本研究显示结核性胸腔积液总ADA活性中，ADA2平均占74.8%，其总ADA活性主要是由ADA2所构成，提示结核性胸腔积液总ADA活性升高主要由ADA2所致。胸膜组织ADA2免疫组化结果和巨噬细胞表面标志物CD68免疫组化结果相似，巨噬细胞、朗格汉斯巨细胞和上皮样细胞被深染棕黄色，显示ADA2来源于巨噬细胞、上皮样细胞和朗格汉斯巨细胞。结核性炎症渗出的细胞常以单核细胞为主，单核细胞经血管进入组织后演变为巨噬细胞，活化的巨噬细胞吞食消化结核分枝杆菌后转化而成上皮样细胞，多个上皮样细胞融合成朗格汉斯巨细胞，而结核菌的菌体脂质促使巨噬细胞转变成上皮样细胞和朗格汉斯巨细胞，所以这些细胞都属同一细胞来源[4]。Zavialov等[5]报道单核细胞转化为巨噬细胞时会产生ADA2；而在炎症反应时，巨噬细胞能分泌ADA2[6]。ADA2能诱导单核细胞分化成巨噬细胞，并且使巨噬细胞和CD4+T细胞增殖，另一种同功酶ADA1则不能诱导单核细胞分化成巨噬细胞，在结核性胸积液中含有大量的巨噬细胞和CD4+T细胞[7]，宿主抗结核免疫主要是通过以T淋巴细胞介导、巨噬细胞为效应的细胞免疫反应，所以ADA2使巨噬细胞和CD4+T细胞增殖的作用可能有利于机体抗结核。结核性胸积液ADA2活性升高主要是由于宿主单核巨噬细胞、上皮样细胞、朗格汉斯巨细胞等和结核菌相互作用的结果。
综上所述，结核性胸积液的ADA活性主要由ADA2构成，ADA2源自巨噬细胞、上皮样细胞和朗格汉斯巨细胞。
参考文献
[1]田瑞雪.干扰素γ、白细胞介素12及腺苷脱氨酶同工酶对结核性胸腔积液的诊断价值[J].中华结核和呼吸杂志，2004，27（7）：6-9.
[2] Ungerer J P，Oosthuizen H M，Bissbort S H，et al.Serum adenosine deaminase：isoenzymes and diagnostic application[J].Clin Chem，1992，38（7）：1322-1326.
[3] Muraoka T，Katsuramaki T，Shiraishi H，et al.Automated enzymatic measurement of adenosine deaminase isoenzyme activities in serum[J].Anal Biochem，1990，187（2）：268-272.
[4] Van Crevel R，Ottenhoff T H，Van der Meer J W.Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis[J].Clin Microbiol Rev，2002，15（2）：294-309.
[5] Zavialov A V，Gracia E，Glaichenhaus N，et al.Human adenosine deaminase 2 induces differentiation of monocytes into macrophages and stimulates proliferation of T helper cells and macrophages[J].J Leukoc Biol，2010，88（2）：279-290.
[6] Conlon B A，Law W R.Macrophages are a source of extracellular adenosine deaminase-2 during inflammatory responses[J].Clin Exp Immunol，2004，138（1）：14-20.
[7] Valdes L，Pose A，San J E，et al.Tuberculous pleural effusions[J].Eur J Intern Med，2003，14（2）：77-88.
（收稿日期：2015-01-16） （本文编辑：陈丹云）