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摘要：目的 探讨在-20±5℃的条件下保存，保存时间1年之后是否对乙肝病毒 DNA荧光定量检测的影响。方法 1份结果为n×103的标本分装成若干份，分成A组和B组，先检测A组，随机的与日常标本检测，B组是1年后再随机与日常的标本进行检测，查看HBV DNA定量检测结果的变化。结论 据本实验室的实验结果来看，在-20±5℃的条件下保存标本1年后，再进行乙肝病毒 DNA定量检测，将检测结果进行配对t检验，结果有显著的差异，P<0.001。所以想要保存时间更长的标本来做相关的研究，需要选择更合适的条件和方式来保存标本，才能让标本的检测结果更加稳定。
关键词：-20±5℃;乙肝病毒 DNA;1年;定量
【中图分类号】R512.3 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）04-328-01
肝炎仍是我国目前常见的传染病，最常见的是乙型性肝炎，乙型肝炎病毒感染是主要的原因，主要的传播途径是经血液传播。被乙型肝炎病毒感染后，更容易引起肝功能的异常，从而导致肝硬化、肝癌等疾病，危害性较大。目前临床上常用的方法有胶体金法、化学发光法、酶联免疫法、PCR法等，来检测是否被乙型肝炎病毒感染及治疗的效果，由于PCR法的灵敏性和特异性较高，所以本方法在临床上比较受欢迎 。根据各个实验室的实际情况的不同，有些实验室是常温下保存，有些是4℃的条件下保存，保存时间也不一致，有报道血清标本室温下保存短期保存3d、4℃保存7d对PCR检测HBV DNA含量无显著的差异[4]，-20℃条件下保存3个月对HBV DNA荧光定量检测结果无显著影响[1]。但是遇到特殊情况或者科研的需要，往往需要把标本保存更长的时间再进行检测，如果保存时间长达1年是否对HBV DNA的检测结果产生影响。
1.实验方法
1.1标本的处理和保存 取一份检测结果为n×103的标本，冻融至室温之后，用EP分装，分装之后保存于-20±5℃的冰箱内，每次的取出一支与日常的标本同时做实验。实验选用的试剂是圣湘生物科技股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒，实验方法是实时荧光定量PCR的方法，实验的操作步骤严格按照试剂的说明书进行。
1.2实验的步骤
1.2.1试剂的准备 （在试剂准备区进行）
1.2.1.1取出包装盒中的各组分和同一批号的核酸释放剂，室温放置，将其温度平衡至室温后，混匀后备用
1.2.1.2根据待测标本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品的数量，按比例（反应液38ul/人份+酶混合液2ull/人份+内标0.2ull/人份）取相应量的反應液、酶混合液及内标，充分混匀配成PCR混合液，瞬时离心备用
1.2.2 标本处理及加样（在样本处理区进行）
1.3从-20±5℃的冰箱中取一支已分装好的标本，室温放置，将其温度平衡至室温
1.4取相应数量的PCR反应管，每管加5ul的核酸释放剂后加5ul的标本，静置10min，加配好的PCR混合液40ul，盖上管盖，2000rPm离心30秒。
1.4.1 PCR扩增（在扩增与分析区进行）
1.4.1.1将PCR反应管加入扩增仪样品槽，按对应的设置阴性对照、阳性对照、定量参考品及待测标本，并设置样本名称和定量参考品的浓度
1.4.1.2选择对应的循环参数，进行实验
1.4.2结果分析
反应结束后，根据分析后图像的相关的数值，调整阈值线，使得各项参数符合质量控制的要求，将实验的结果传至LIS系统上
2.两组实验的结果
A组的实验从2020年1月至2020年4月，总共做了20次。B组的实验从2021年3月至2021年4月，总共做了23次，取结果最接近的20次结果与A组进行比较，两组的检测结果如下表所示：
3.结论
近年来，各实验室的实验条件都有了很大的改善，使得实验的标本保存的时间更长，有报道-20℃保存标本3个月对HBV-DNA荧光定量检测无显著的影响[1]，但是若遇到特殊情况或科研的需要，往往需将标本保存更长的时间，收集一定数量的标本来进行研究探讨，但是保存时间长达1年以上是否对实验结果有影响，需要进一步的研究探讨。由上述的实验结果来看，-20±5℃的条件下保存标本，1年以后用同样的试剂和方法进行HBV DNA定量荧光检测，A组20次的平均值是4.836×103IU/ml，B组20次的平均CT值是2.646×103IU/m，虽然结果都是10的3次方，但是结果还是有明显的下降，将两组数据进行配对t检验，P<0.001，结果有显著的差异。这样的结果可能对于临床治疗用药及效果监测的影响不是特别大，但要是用于科研或者特殊需要，还是有很大的影响。检测结果下降的原因可能是：（1）这两组实验是在不同的仪器上进行的，由于仪器的性能有所差异导致实验结果的差异。下次研究最好能在同一台仪器上进行，而且仪器需要定期校准，校准合格、仪器状态良好的情况下进行实验。（2）由于标本保存时间较长，中途可能出现停电导致冰箱内温度的变化，标本存在反复冻融的情况，从而导致HBV DNA荧光定量检测的结果有所下降。（3）标本保存时间比较长，乙型肝炎病毒的DNA在一定程度上可能会有所降解，降解的幅度与保存时间长短的关系有待研究。另外，在-20℃与-70℃两种不同的条件下保存，核酸的稳定性关系，也有待于研究。（4）可能是选择研究标本的原因，此次选择定量值是n×103的标本，本试剂盒的定量线性范围是1.0×102～5.0×109IU/ml，在此范围内，此标本浓度值相对来说是低值，检测值下降可能会比较明显，如果选择中值、高值的标本下降可能没这么明显，为了让检测结果更具可比性，还应该选择中值和高值的标本一起平行试验进行分析。所以如果科研或者特殊需要的情况下，需要将标本保存更长的时间来检测HBV DNA的含量，就需选择更合适的条件和方式来保存标本，使得结果更加的稳定，更具科研价值，为我国乙肝病毒的检测和乙型肝炎的患者的治疗及监测做贡献。
参考文献
[1]胡玉弘 陈玲玲 冯军.标本存放时间对荧光定量PCR结果的影响.中国医学创新 2010年8月第7卷第24期
[2]庄养林1，熊丽红1，张鹏飞1，王芳1，陈丹2.溶血、脂肪血及保存条件对HBV DNA、HIV RNA核酸检测的影响.天津医药 2017年10月第45卷第10期
[3]郑建中1 王 青2 王凤华2 王丽萍3.标本因素对荧光定量PCR法测定乙肝病毒DNA的影响.医学检验与临床 2008年第19卷第5期
[4]马彩云.标本因素对HBV DNA测定的影响.中外健康文摘 2011年11月第8卷第42期
[5]崔永利.核酸检测法对血液标本内乙肝病毒的检测价值分析.影像学及诊断检验 2021年3月第5期
广西科技大学第一附属医院 广西柳州 545002
关键词：-20±5℃;乙肝病毒 DNA;1年;定量
【中图分类号】R512.3 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）04-328-01
肝炎仍是我国目前常见的传染病，最常见的是乙型性肝炎，乙型肝炎病毒感染是主要的原因，主要的传播途径是经血液传播。被乙型肝炎病毒感染后，更容易引起肝功能的异常，从而导致肝硬化、肝癌等疾病，危害性较大。目前临床上常用的方法有胶体金法、化学发光法、酶联免疫法、PCR法等，来检测是否被乙型肝炎病毒感染及治疗的效果，由于PCR法的灵敏性和特异性较高，所以本方法在临床上比较受欢迎 。根据各个实验室的实际情况的不同，有些实验室是常温下保存，有些是4℃的条件下保存，保存时间也不一致，有报道血清标本室温下保存短期保存3d、4℃保存7d对PCR检测HBV DNA含量无显著的差异[4]，-20℃条件下保存3个月对HBV DNA荧光定量检测结果无显著影响[1]。但是遇到特殊情况或者科研的需要，往往需要把标本保存更长的时间再进行检测，如果保存时间长达1年是否对HBV DNA的检测结果产生影响。
1.实验方法
1.1标本的处理和保存 取一份检测结果为n×103的标本，冻融至室温之后，用EP分装，分装之后保存于-20±5℃的冰箱内，每次的取出一支与日常的标本同时做实验。实验选用的试剂是圣湘生物科技股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒，实验方法是实时荧光定量PCR的方法，实验的操作步骤严格按照试剂的说明书进行。
1.2实验的步骤
1.2.1试剂的准备 （在试剂准备区进行）
1.2.1.1取出包装盒中的各组分和同一批号的核酸释放剂，室温放置，将其温度平衡至室温后，混匀后备用
1.2.1.2根据待测标本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品的数量，按比例（反应液38ul/人份+酶混合液2ull/人份+内标0.2ull/人份）取相应量的反應液、酶混合液及内标，充分混匀配成PCR混合液，瞬时离心备用
1.2.2 标本处理及加样（在样本处理区进行）
1.3从-20±5℃的冰箱中取一支已分装好的标本，室温放置，将其温度平衡至室温
1.4取相应数量的PCR反应管，每管加5ul的核酸释放剂后加5ul的标本，静置10min，加配好的PCR混合液40ul，盖上管盖，2000rPm离心30秒。
1.4.1 PCR扩增（在扩增与分析区进行）
1.4.1.1将PCR反应管加入扩增仪样品槽，按对应的设置阴性对照、阳性对照、定量参考品及待测标本，并设置样本名称和定量参考品的浓度
1.4.1.2选择对应的循环参数，进行实验
1.4.2结果分析
反应结束后，根据分析后图像的相关的数值，调整阈值线，使得各项参数符合质量控制的要求，将实验的结果传至LIS系统上
2.两组实验的结果
A组的实验从2020年1月至2020年4月，总共做了20次。B组的实验从2021年3月至2021年4月，总共做了23次，取结果最接近的20次结果与A组进行比较，两组的检测结果如下表所示：
3.结论
近年来，各实验室的实验条件都有了很大的改善，使得实验的标本保存的时间更长，有报道-20℃保存标本3个月对HBV-DNA荧光定量检测无显著的影响[1]，但是若遇到特殊情况或科研的需要，往往需将标本保存更长的时间，收集一定数量的标本来进行研究探讨，但是保存时间长达1年以上是否对实验结果有影响，需要进一步的研究探讨。由上述的实验结果来看，-20±5℃的条件下保存标本，1年以后用同样的试剂和方法进行HBV DNA定量荧光检测，A组20次的平均值是4.836×103IU/ml，B组20次的平均CT值是2.646×103IU/m，虽然结果都是10的3次方，但是结果还是有明显的下降，将两组数据进行配对t检验，P<0.001，结果有显著的差异。这样的结果可能对于临床治疗用药及效果监测的影响不是特别大，但要是用于科研或者特殊需要，还是有很大的影响。检测结果下降的原因可能是：（1）这两组实验是在不同的仪器上进行的，由于仪器的性能有所差异导致实验结果的差异。下次研究最好能在同一台仪器上进行，而且仪器需要定期校准，校准合格、仪器状态良好的情况下进行实验。（2）由于标本保存时间较长，中途可能出现停电导致冰箱内温度的变化，标本存在反复冻融的情况，从而导致HBV DNA荧光定量检测的结果有所下降。（3）标本保存时间比较长，乙型肝炎病毒的DNA在一定程度上可能会有所降解，降解的幅度与保存时间长短的关系有待研究。另外，在-20℃与-70℃两种不同的条件下保存，核酸的稳定性关系，也有待于研究。（4）可能是选择研究标本的原因，此次选择定量值是n×103的标本，本试剂盒的定量线性范围是1.0×102～5.0×109IU/ml，在此范围内，此标本浓度值相对来说是低值，检测值下降可能会比较明显，如果选择中值、高值的标本下降可能没这么明显，为了让检测结果更具可比性，还应该选择中值和高值的标本一起平行试验进行分析。所以如果科研或者特殊需要的情况下，需要将标本保存更长的时间来检测HBV DNA的含量，就需选择更合适的条件和方式来保存标本，使得结果更加的稳定，更具科研价值，为我国乙肝病毒的检测和乙型肝炎的患者的治疗及监测做贡献。
参考文献
[1]胡玉弘 陈玲玲 冯军.标本存放时间对荧光定量PCR结果的影响.中国医学创新 2010年8月第7卷第24期
[2]庄养林1，熊丽红1，张鹏飞1，王芳1，陈丹2.溶血、脂肪血及保存条件对HBV DNA、HIV RNA核酸检测的影响.天津医药 2017年10月第45卷第10期
[3]郑建中1 王 青2 王凤华2 王丽萍3.标本因素对荧光定量PCR法测定乙肝病毒DNA的影响.医学检验与临床 2008年第19卷第5期
[4]马彩云.标本因素对HBV DNA测定的影响.中外健康文摘 2011年11月第8卷第42期
[5]崔永利.核酸检测法对血液标本内乙肝病毒的检测价值分析.影像学及诊断检验 2021年3月第5期
广西科技大学第一附属医院 广西柳州 545002