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摘 要 从生长于沈抚污灌区的野生东方蓼、狗尾草、稗草、山莴苣等植物组织中分离纯化出46株植物内生菌，经用含Cd2+培养基筛选，得到对重金属镉具有较强抗性的细菌菌株EB12-6。观察其形态特征，研究对Cd2+去除情况以及温度、pH、O2、NaCl对菌株生长的影响，结果表明：EB12-6菌株为好氧革兰氏阴性菌，有鞭毛；在pH为7.5，37℃温度，培养时间36 h，初始Cd2+浓度为20 mg/L条件下，对Cd2+去除率可达63.88%。
关键词 镉抗性；植物内生菌；细菌；菌株；Cd2+去除
中图分类号：S156.99；X53 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.22.029
知网出版网址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20160904.0043.032.html 网络出版时间：2016-9-4 0：43：00
重金属污染是指由重金属或其化合物造成的环境污染，是最严重、最难治理的环境问题之一，重金属污染的严重性和普遍性早已引起了国内外的广泛关注。镉是生物毒性最强的重金属，被列为五大毒物[镉（Cd）、汞（Hg）、砷（As）、铬（Cr）、铅（Pb）]之首[1-5]。极微量的镉就可对人体造成伤害，它可通过食物链在植物体、动物体、人体内大量富集，具有稳定、积累和不易消除等特点，危害人和动物健康，甚至造成死亡[6-8]。由于镉等重金属污染毒理机制和生物效应的复杂性，对重金属污染问题的研究已成为土壤学、环境科学、生态学等的重点、难点和热点。
植物内生菌是指在植物体内完成其生活史的部分或全部，但又不引起任何病症，并与宿主建立互惠共生关系的一类微生物。内生菌普遍存在于目前已研究过的各种高等植物中，它们在植物体内进行生命活动时，能产生多种活性物质，这些物质能对宿主植物的产生巨大的影响。有研究表明，内生菌能促进宿主生长，提高宿主抗逆性，增强宿主竞争力[9]。近年来，研究植物内生菌与植物间的互作，探讨植物内生菌对于环境污染的修复作用及机制，利用植物和其内生细菌来降解环境污染物并应用于生產实践已成为学术界研究的热点。内生菌作为生物防治资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业、医药、卫生领域有着巨大的应用潜力[10-11]。
本研究对污灌区野生植物体内的植物内生菌进行分离纯化，采用Cd2+富集方法从中筛选对镉有抗性的菌株，研究其形态、生长特性以及对Cd2+去除情况，以便为进一步探索内生菌与宿主植物的协同作用、提高植物修复效率提供理论支持，为利用植物内生菌处理重金属污染工作奠定基础[12-15]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物
2010年9月于辽宁抚顺市李石开发区沈抚污灌区采集野生植物：东方蓼、狗尾草、稗草、山莴苣、北柴胡、大花鬼针草等，取样后于48 h内用其根茎健康组织进行植物内生菌的富集和分离。
1.1.2 培养基
分离用培养基：固体牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基。
筛选用培养基：在配制牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基的过程中分别加入CdCl2，使培养基中含Cd2+浓度分别为25， 50， 100， 150 mg/L。
1.2 方法
1.2.1 内生菌菌株的分离、纯化
取所采集植株的根、茎分别用流水冲洗干净，用75%酒精浸泡1 min，无菌水冲洗3～4次，0.1%升汞浸泡5 min，无菌水冲洗3～4次。用无菌解剖剪刀或无菌手术刀将根、茎组织切成5～10 mm大小组织块，分别贴于牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基平板上，同时将最后一遍冲洗的无菌水取适量涂布平板，分别于37℃、28℃环境下培养数天，若无菌水涂布的平板无杂菌生长，则将正常处理的平板上长出的菌落按常规方法纯化后保存备用。
1.2.2 抗镉内生菌菌株的筛选
将已分离纯化的活化内生菌液按5%（V/V）接种量分别接种于含Cd2+浓度为25， 50， 100， 150 mg/L的牛肉膏蛋白胨培养液或PDA培养液中，37℃或24℃，120 r/min条件下振荡培养，将振荡培养后的培养液分别稀释到10-3， 10-4， 10-5倍涂布在含Cd2+浓度为20 mg/L的相应培养基平板上，挑取单菌落，如此反复得到抗镉内生菌菌株。将已得到的抗镉菌株接种于斜面固体培养基上，置4℃冰箱保存。
1.2.3 Cd2+去除率的测定
采用原子吸收分光光度法测定Cd2+浓度。将培养液4000 r/min离心20 min除去菌体，残留的上清液用于测定Cd2+浓度，以不含菌的含Cd2+培养液为对照[8]。
Cd2+去除率%=[（C0-C）/C0]×100%
其中为C0为Cd2+的初始浓度（mg/L），C为Cd2+的残留浓度（mg/L）。
1.2.4 抗镉内生菌EB12-6菌株的形态学观察
1.2.4.1 菌落形态
采用稀释涂布法将所分离得到的抗镉内生菌接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37℃培养1～2 d，观察其菌落特征。
1.2.4.2 菌体形态
分别采用单染色法、革兰氏染色法、鞭毛染色法等对抗镉内生菌进行染色观察和描述，同时采用显微镜直接测定法测定菌体大小。
1.2.5 抗镉内生菌EB12-6菌株生长特性的测定
1.2.5.1生长曲线的测定
将抗镉内生菌接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，置37℃，120 r/min培养，分别于0， 4， 8， 12， 24， 48， 60， 72， 84， 96 h测定OD600值，以未接菌的培养液作为对照。依据所测数据绘制生长曲线。 1.2.5.2最适培养温度的测定
将抗镉内生菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，分别置于12℃、25℃、37℃、45℃、50℃恒温振荡器，120 r/min，培养 36 h，测定OD600值。
1.2.5.3初始pH值对EB12-6菌株生长的影响
将牛肉膏蛋白胨培养液分别调制pH为4， 5， 5.5， 6， 6.5， 7， 7.5， 8， 8.5， 9， 10，分别接种抗镉内生菌，置于37℃，120 r/min振荡培养36 h，分别测其OD600值。
1.2.5.4不同装液量对EB12-6菌株生长的影响
将将抗镉内生菌接种于装液量为50， 75， 100， 150 mL的250 mL三角瓶中，37℃，120 r/min振荡培养36 h，分别测其OD600值。
1.2.5.5NaCl浓度对EB12-6菌株生长的影响
将抗镉内生菌接种于含NaCl浓度为0.5%， 1%， 2%， 3%， 5%， 10%的牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃，120 r/min振荡培养36 h，分别测其OD600值。
2 结果与分析
2.1 抗镉内生菌株的分离纯化及筛选
经组织分离法分离纯化得到46株植物内生菌，其中23株细菌、23株真菌。经用含Cd2+培养基筛选，得到6株对重金属镉具有抗性的菌株，其中4株真菌（EF12-2、EF12-4、EF12-6、EF12-9），2株细菌（EB12-6、EB12-9）。
2.2 Cd2+去除率的测定
采用原子吸收分光光度法测定已筛选得到的6株内生菌的Cd2+去除效果见表1。由表1可见，2株内生细菌对Cd2+的去除效果较好，去除率均达60%以上，而4株内生真菌的Cd2+的去除作用相对较弱。根据对Cd2+的去除作用效果，最终选取内生细菌EB12-6菌株进行深入的实验研究。
2.3 EB12-6菌株形态特征
EB12-6在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落特征是：菌落呈乳白色规则圆形，边缘整齐，表面光滑。EB12-6菌体呈短杆状，长度为0.9～1.25 ?m，宽度为0.65～0.85 ?m；无芽孢、荚膜，有鞭毛，革兰氏染色阴性。
2.4 EB12-6菌株生长特性
2.4.1 EB12-6菌株生长曲线
EB12-6菌株生长曲线见图1。由图1可以看出，菌株在0～4 h处于延迟期，4～36 h为对数增长期，36～48 h为稳定期，48～96 h为衰亡期。
2.4.2 温度对EB12-6菌株生长的影响
由表2可见，温度对EB12-6菌株生长影响显著，EB0901菌株在12～45℃时均能良好生长，在10～12℃时生长迟缓，当培养温度超过37℃后，菌株的生长受到明显的抑制，在50℃以上基本不生长，生长适宜温度为25～45℃，最适生长温度为37℃。
2.4.3 初始pH对EB12-6菌株生长的影响
初始pH值对EB12-6菌株生长有明显影响，当pH值为4时，该菌株基本不生长，在pH5～10时均可生长，其中，pH值为6～8时出现生长高峰，在pH值为7.5时，生长最好。EB12-6菌株可在中性偏碱性条件下生长（见表3）。
2.4.4 不同装液量对EB12-6菌株生长的影响
不同装液量对EB12-6菌株生长有一定影响（见表4）。随着装液量的增加，菌体的增长呈下降趋势，即当装液量增加时，菌体生长所需的氧气含量减少，而氧气含量的多少影响菌体的生长，说明EB12-6为好氧菌。
2.4.5 不同NaCl浓度对EB12-6菌株生长的影响
由表5可以看出，不同NaCl浓度对EB12-6菌株的生长有较大影响，在NaCl浓度为0.5%～5%时均可生长，在0.5%～3%时生长良好，当NaCl浓度大于3%时，菌株生长速度下降，当NaCl浓度为10%时，菌体几乎不生长。由此可见，EB12-6菌株具有一定的耐盐性。
3 结论与讨论
从污灌区生长的植物体内分离纯化46株植物内生菌，经用含Cd2+培养基筛选得到6株抗镉植物内生菌，其中2株内生细菌、4株内生真菌。6株内生菌的Cd2+去除率不同，内生细菌的抗镉能力较强，均达到60%以上。由此可见，在污灌区生长的植物体内存在有多种内生菌（细菌和真菌），有的内生菌对某些造成污染的因素（如重金属镉）具有抗性，有的则没有，而具有抗性的内生菌其抗性强弱也有差别。
镉抗性细菌菌株EB12-6在pH7.5，37℃，培养36 h，培养基初始Cd2+浓度为20 mg/L条件下，对Cd2+去除率达63.88%，但作为内生菌，当其侵染植物体与植物体共生联合作用时，对环境镉的去除作用效果和作用机理以及该菌株是否对其他重金属如铅、铜、镍、锌也具有一定的抗性，还有待深入研究。
生长于沈抚污灌区的野生植物对石油烃、重金属等有一定的吸收作用，具有较强的胁迫抗性，而这是否得益于其体内存在的抗胁迫内生菌，尚难确定。内生菌与植物之间的互作影响及机制已成为当今生态学、微生物学和植物生理学探究的热点问题[9-12]，深入研究和开发植物内生菌资源，利用内生菌与其宿主植物联合修复重金属污染具有重要的理论研究意义和实践应用价值。
参考文献：
[1] 金忠民，郝宇，刘丽杰，等.一株铅镉抗性菌株的分离鉴定及其生物学特性[J].环境工程学报，2015（7）：3551-3557.
[2] 刘志培，刘双江.我国污染土壤生物修复技术的发展及现状[J].生物工程学报，2015（6）：901-916.
[3] 聂锦霞，陈明，蔡青云，等.赣南某矿区土壤中抗镉菌株的分离筛选及对镉的吸附特性[J].有色金属工程，2015（4）：85-89.
[4] 金忠民，郝宇，刘丽杰，等.扎龙湿地土壤中抗性菌株对Pb和Cd去除率与其生理生化特性的相关性及通径分析[J].环境污染与防治，2015（7）：66-70.
[5] 陈永华，向捷，吴晓芙，等.三株耐铅锌菌的分离、鉴定及其吸附能力[J].生态学杂志，2015（9）：2665-2672.
[6] 安婧，宫晓双，魏树和.重金属污染土壤超积累植物修复关键技术的发展[J].生态学杂志，2015（11）：3261-3270.
[7] 卢福芝，李启虔，刘王辉，等.抗重金属镉微生物特性的研究[J].河池学院学报，2015（5）：34-39.
[8] 郑浩，张建坤，郑连爽，等.两株土壤耐镉细菌的筛选分离及与CdS-TGA纳米颗粒相互作用的研究[J].生命科学研究，2015（6）：505-511.
[9] 朱宇辰.镉抗性细菌Cupriavidus campinensis KQ46的分离鉴定及其镉抗性机制研究[D].南京：南京农业大学，2013.
[10] 薛永，王苑螈，姚泉洪，等.植物对土壤重金属镉抗性的研究进展[J].生态环境学报，2014（3）：528-534.
[11] 易泽夫，余杏，吴景.镉污染土壤修复技术研究进展[J].现代农业科技，2014（9）：251-253.
[12] 窦敏娜.两株抗镉细菌鉴定及抗性研究[J].甘肃科学学报，2014（4）：40-43.
[13] 金忠民，李丹，潘林，等.抗性菌株JB13强化高羊茅对铅镉的富集[J].北方园艺，2016（9）：75-78.
[14] 张凯凯，孙圆圆，徐玲玲，等.镉胁迫对一年生黑麦草生理生化特性的影响[J].山地农业生物学报，2016（1）：86-89.
[15] 卢福芝，李启虔，何海燕，等.一株抗镉真菌的分离鉴定及特性研究[J].环境工程，2016（4）：64-67，85.
（责任编辑：丁志祥）
关键词 镉抗性；植物内生菌；细菌；菌株；Cd2+去除
中图分类号：S156.99；X53 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.22.029
知网出版网址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20160904.0043.032.html 网络出版时间：2016-9-4 0：43：00
重金属污染是指由重金属或其化合物造成的环境污染，是最严重、最难治理的环境问题之一，重金属污染的严重性和普遍性早已引起了国内外的广泛关注。镉是生物毒性最强的重金属，被列为五大毒物[镉（Cd）、汞（Hg）、砷（As）、铬（Cr）、铅（Pb）]之首[1-5]。极微量的镉就可对人体造成伤害，它可通过食物链在植物体、动物体、人体内大量富集，具有稳定、积累和不易消除等特点，危害人和动物健康，甚至造成死亡[6-8]。由于镉等重金属污染毒理机制和生物效应的复杂性，对重金属污染问题的研究已成为土壤学、环境科学、生态学等的重点、难点和热点。
植物内生菌是指在植物体内完成其生活史的部分或全部，但又不引起任何病症，并与宿主建立互惠共生关系的一类微生物。内生菌普遍存在于目前已研究过的各种高等植物中，它们在植物体内进行生命活动时，能产生多种活性物质，这些物质能对宿主植物的产生巨大的影响。有研究表明，内生菌能促进宿主生长，提高宿主抗逆性，增强宿主竞争力[9]。近年来，研究植物内生菌与植物间的互作，探讨植物内生菌对于环境污染的修复作用及机制，利用植物和其内生细菌来降解环境污染物并应用于生產实践已成为学术界研究的热点。内生菌作为生物防治资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业、医药、卫生领域有着巨大的应用潜力[10-11]。
本研究对污灌区野生植物体内的植物内生菌进行分离纯化，采用Cd2+富集方法从中筛选对镉有抗性的菌株，研究其形态、生长特性以及对Cd2+去除情况，以便为进一步探索内生菌与宿主植物的协同作用、提高植物修复效率提供理论支持，为利用植物内生菌处理重金属污染工作奠定基础[12-15]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物
2010年9月于辽宁抚顺市李石开发区沈抚污灌区采集野生植物：东方蓼、狗尾草、稗草、山莴苣、北柴胡、大花鬼针草等，取样后于48 h内用其根茎健康组织进行植物内生菌的富集和分离。
1.1.2 培养基
分离用培养基：固体牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基。
筛选用培养基：在配制牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基的过程中分别加入CdCl2，使培养基中含Cd2+浓度分别为25， 50， 100， 150 mg/L。
1.2 方法
1.2.1 内生菌菌株的分离、纯化
取所采集植株的根、茎分别用流水冲洗干净，用75%酒精浸泡1 min，无菌水冲洗3～4次，0.1%升汞浸泡5 min，无菌水冲洗3～4次。用无菌解剖剪刀或无菌手术刀将根、茎组织切成5～10 mm大小组织块，分别贴于牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基平板上，同时将最后一遍冲洗的无菌水取适量涂布平板，分别于37℃、28℃环境下培养数天，若无菌水涂布的平板无杂菌生长，则将正常处理的平板上长出的菌落按常规方法纯化后保存备用。
1.2.2 抗镉内生菌菌株的筛选
将已分离纯化的活化内生菌液按5%（V/V）接种量分别接种于含Cd2+浓度为25， 50， 100， 150 mg/L的牛肉膏蛋白胨培养液或PDA培养液中，37℃或24℃，120 r/min条件下振荡培养，将振荡培养后的培养液分别稀释到10-3， 10-4， 10-5倍涂布在含Cd2+浓度为20 mg/L的相应培养基平板上，挑取单菌落，如此反复得到抗镉内生菌菌株。将已得到的抗镉菌株接种于斜面固体培养基上，置4℃冰箱保存。
1.2.3 Cd2+去除率的测定
采用原子吸收分光光度法测定Cd2+浓度。将培养液4000 r/min离心20 min除去菌体，残留的上清液用于测定Cd2+浓度，以不含菌的含Cd2+培养液为对照[8]。
Cd2+去除率%=[（C0-C）/C0]×100%
其中为C0为Cd2+的初始浓度（mg/L），C为Cd2+的残留浓度（mg/L）。
1.2.4 抗镉内生菌EB12-6菌株的形态学观察
1.2.4.1 菌落形态
采用稀释涂布法将所分离得到的抗镉内生菌接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37℃培养1～2 d，观察其菌落特征。
1.2.4.2 菌体形态
分别采用单染色法、革兰氏染色法、鞭毛染色法等对抗镉内生菌进行染色观察和描述，同时采用显微镜直接测定法测定菌体大小。
1.2.5 抗镉内生菌EB12-6菌株生长特性的测定
1.2.5.1生长曲线的测定
将抗镉内生菌接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，置37℃，120 r/min培养，分别于0， 4， 8， 12， 24， 48， 60， 72， 84， 96 h测定OD600值，以未接菌的培养液作为对照。依据所测数据绘制生长曲线。 1.2.5.2最适培养温度的测定
将抗镉内生菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中，分别置于12℃、25℃、37℃、45℃、50℃恒温振荡器，120 r/min，培养 36 h，测定OD600值。
1.2.5.3初始pH值对EB12-6菌株生长的影响
将牛肉膏蛋白胨培养液分别调制pH为4， 5， 5.5， 6， 6.5， 7， 7.5， 8， 8.5， 9， 10，分别接种抗镉内生菌，置于37℃，120 r/min振荡培养36 h，分别测其OD600值。
1.2.5.4不同装液量对EB12-6菌株生长的影响
将将抗镉内生菌接种于装液量为50， 75， 100， 150 mL的250 mL三角瓶中，37℃，120 r/min振荡培养36 h，分别测其OD600值。
1.2.5.5NaCl浓度对EB12-6菌株生长的影响
将抗镉内生菌接种于含NaCl浓度为0.5%， 1%， 2%， 3%， 5%， 10%的牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃，120 r/min振荡培养36 h，分别测其OD600值。
2 结果与分析
2.1 抗镉内生菌株的分离纯化及筛选
经组织分离法分离纯化得到46株植物内生菌，其中23株细菌、23株真菌。经用含Cd2+培养基筛选，得到6株对重金属镉具有抗性的菌株，其中4株真菌（EF12-2、EF12-4、EF12-6、EF12-9），2株细菌（EB12-6、EB12-9）。
2.2 Cd2+去除率的测定
采用原子吸收分光光度法测定已筛选得到的6株内生菌的Cd2+去除效果见表1。由表1可见，2株内生细菌对Cd2+的去除效果较好，去除率均达60%以上，而4株内生真菌的Cd2+的去除作用相对较弱。根据对Cd2+的去除作用效果，最终选取内生细菌EB12-6菌株进行深入的实验研究。
2.3 EB12-6菌株形态特征
EB12-6在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落特征是：菌落呈乳白色规则圆形，边缘整齐，表面光滑。EB12-6菌体呈短杆状，长度为0.9～1.25 ?m，宽度为0.65～0.85 ?m；无芽孢、荚膜，有鞭毛，革兰氏染色阴性。
2.4 EB12-6菌株生长特性
2.4.1 EB12-6菌株生长曲线
EB12-6菌株生长曲线见图1。由图1可以看出，菌株在0～4 h处于延迟期，4～36 h为对数增长期，36～48 h为稳定期，48～96 h为衰亡期。
2.4.2 温度对EB12-6菌株生长的影响
由表2可见，温度对EB12-6菌株生长影响显著，EB0901菌株在12～45℃时均能良好生长，在10～12℃时生长迟缓，当培养温度超过37℃后，菌株的生长受到明显的抑制，在50℃以上基本不生长，生长适宜温度为25～45℃，最适生长温度为37℃。
2.4.3 初始pH对EB12-6菌株生长的影响
初始pH值对EB12-6菌株生长有明显影响，当pH值为4时，该菌株基本不生长，在pH5～10时均可生长，其中，pH值为6～8时出现生长高峰，在pH值为7.5时，生长最好。EB12-6菌株可在中性偏碱性条件下生长（见表3）。
2.4.4 不同装液量对EB12-6菌株生长的影响
不同装液量对EB12-6菌株生长有一定影响（见表4）。随着装液量的增加，菌体的增长呈下降趋势，即当装液量增加时，菌体生长所需的氧气含量减少，而氧气含量的多少影响菌体的生长，说明EB12-6为好氧菌。
2.4.5 不同NaCl浓度对EB12-6菌株生长的影响
由表5可以看出，不同NaCl浓度对EB12-6菌株的生长有较大影响，在NaCl浓度为0.5%～5%时均可生长，在0.5%～3%时生长良好，当NaCl浓度大于3%时，菌株生长速度下降，当NaCl浓度为10%时，菌体几乎不生长。由此可见，EB12-6菌株具有一定的耐盐性。
3 结论与讨论
从污灌区生长的植物体内分离纯化46株植物内生菌，经用含Cd2+培养基筛选得到6株抗镉植物内生菌，其中2株内生细菌、4株内生真菌。6株内生菌的Cd2+去除率不同，内生细菌的抗镉能力较强，均达到60%以上。由此可见，在污灌区生长的植物体内存在有多种内生菌（细菌和真菌），有的内生菌对某些造成污染的因素（如重金属镉）具有抗性，有的则没有，而具有抗性的内生菌其抗性强弱也有差别。
镉抗性细菌菌株EB12-6在pH7.5，37℃，培养36 h，培养基初始Cd2+浓度为20 mg/L条件下，对Cd2+去除率达63.88%，但作为内生菌，当其侵染植物体与植物体共生联合作用时，对环境镉的去除作用效果和作用机理以及该菌株是否对其他重金属如铅、铜、镍、锌也具有一定的抗性，还有待深入研究。
生长于沈抚污灌区的野生植物对石油烃、重金属等有一定的吸收作用，具有较强的胁迫抗性，而这是否得益于其体内存在的抗胁迫内生菌，尚难确定。内生菌与植物之间的互作影响及机制已成为当今生态学、微生物学和植物生理学探究的热点问题[9-12]，深入研究和开发植物内生菌资源，利用内生菌与其宿主植物联合修复重金属污染具有重要的理论研究意义和实践应用价值。
参考文献：
[1] 金忠民，郝宇，刘丽杰，等.一株铅镉抗性菌株的分离鉴定及其生物学特性[J].环境工程学报，2015（7）：3551-3557.
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[4] 金忠民，郝宇，刘丽杰，等.扎龙湿地土壤中抗性菌株对Pb和Cd去除率与其生理生化特性的相关性及通径分析[J].环境污染与防治，2015（7）：66-70.
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（责任编辑：丁志祥）