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摘要:分离纯化栀子(Gardenia jasminoides Ellis.)新鲜果实中的内生真菌,用插片法观察菌种的菌丝、孢子囊以及孢子等特征,探讨栀子内生真菌群落多样性。结果表明,从栀子果实中分离获得了42株内生真菌,初步鉴定为1目1科9属,交链孢霉属(Alternaria spp.)1株,占2.38%;青霉属(Penicillium spp.)3株,占7.14%;曲霉属(Aspergillus spp.)3株,占714%;轮枝霉属(Verticillium spp.)3株,占7.14%;瓶梗青霉属(Paecilomyces spp.)2株,占4.76%;穗霉属(Spicaria spp.)2株,占476%;头孢霉属(Cephalosporium spp.)1株,占2.38%;粘帚霉属(Gliocladium spp.)1株,占2.38%;双曲孢霉属(Nakataea spp.)26株,占61.9%。其中双曲孢霉属为优势菌群。
关键词:栀子;内生真菌;分离;鉴定
中图分类号: S567.1+90.1文献标志码: A文章编号:1002-1302(2014)02-0298-03
收稿日期:2013-07-18
基金项目:江西省教育厅科技计划(编号:GJJ12537);江西中医药大学博士启动基金;江西中医药大学重点学科青年教师扶持项目。
作者简介:林贵兵(1981—),男,四川自贡人,博士,讲师,主要从事中药资源研究。E-mail:linguibing897@gmail.com。栀子为茜草科栀子属植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis.)干燥成熟的果实,是一种常见的中药,也是江西省道地药材之一,具有泻火除烦、清热利湿、凉血消毒等功效,外敷可治扭伤瘀肿,主要用于治疗黄疸型传染性肝炎、胆囊炎等症。栀子主要生于海拔1 000 m以下的低坡红壤土地,不耐寒[1]。目前关于栀子的研究主要集中在地理环境、气候条件、采收期不同对栀子药材品质的影响方面[2~6],栀子内生菌群对其品质的影响研究还未见报道。可以采用组织学方法、严格进行表面消毒的植物组织块分离方法,以及植物组织直接扩增微生物DNA方法来证明内生菌的内生性[7]。内生菌群可以通过产生生长素、增进宿主植物营养元素吸收来促进宿主生长,增强宿主抗旱、抗高温、抗虫害等抗逆性,部分内生真菌能够促进药用植物次生代谢产物的合成,产生与宿主相同或相似的药用活性成分[8]。本研究分离纯化栀子新鲜果实中的内生真菌,用插片法观察菌种的菌丝、孢子囊以及孢子等特征,探讨栀子内生真菌群落的多样性。
1材料与方法
1.1材料
2012年10月采自江西中医药大学神农园药用植物栀子的新鲜果实,经刘勇副教授鉴定为茜草科栀子属植物栀子。江西省南昌市属中亚热带湿润季风气候,气候湿润温和,日照充足,年均气温17.0~17.7 ℃,年均降水量1 600~1 700 mm,年均相对湿度为78.5%。
1.2方法
1.2.1内生真菌的分离采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)与混合抗生素(80万单位青霉素钠与硫酸庆大青霉素注射液4万单位混合溶解)培养分离栀子果实的内生真菌。将新鲜健康的栀子果实用自来水冲洗干净,再用无菌水洗 2~3次,用0.1%次氯酸钠溶液浸泡 1 min,再用75%乙醇处理5 min,对果实表面进行消毒,再用无菌水冲洗4~5次。削去外皮,取少量果肉置于培养基中,28 ℃ 下恒温培养 7~10 d。待组织块周围长出白色菌丝后,用接种针挑起,纯化菌种。
1.2.2内生真菌鉴定将菌种置于PDA培养基中,采用插片法在28 ℃下恒温培养7~10 d,观察其产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色,参考《真菌鉴定手册》[9]鉴定内生真菌。
2结果与分析
2.1内生真菌种群
2.1.1交链孢霉属(Alternaria spp.)菌落生长迅速,初期为黑色,随后有灰白色棉絮状菌生长,背面灰黑色。营养菌丝有分隔。分生孢子梗暗色,通常较短,单生或分枝简单,直或略弯曲,有隔。分生孢子暗色,横隔1~6个,纵隔0~5个,倒棍棒形、椭圆形或卵形,顶端常延长为喙状,经常向顶着生成链(图1)。
2.1.2青霉属(Penicillium spp.)菌落灰色或灰白色,绒毛状、蛛网状或棉絮状,背面黑色,菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出,无足细胞,暗色,有横隔膜,菌丝单个发生或成束。分生孢子串生,孢子光滑,单胞,褐色,球形或卵圆形 (图2)。
2.1.3曲霉属(Aspergillus spp.)菌落为褐色或黄色颗粒状, 背面黄色或棕色。菌丝无色、淡色或表面凝集有色物质,有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞(足细胞)中垂直生出,大多数无隔膜,光滑或粗糙,上部较粗大,顶端膨大成球形、椭圆形、半圆形或棍棒形的泡囊,从泡囊的表面以放射状生出小梗或仅在泡囊顶部产生小梗,小梗单层或在顶部再分枝成2个或多个小梗。分生孢子串生于小梗顶端,呈辐射状排列或丛集成柱形,着色、形状、大小、纹饰变化很大(图3)。
2.1.4轮枝霉属(Verticillium spp.)菌落生长早期呈灰色,绒毛状,周围有褐色颗粒物长出,后期有白色棉絮状菌长出,背面接种处黑色,周围浅黄色。或菌落生长早期呈灰色,后渐暗,棉絮状,背面黑色。分生孢子梗细长,轮生分枝。分生孢子为梗孢子,卵圆形或椭圆形,褐色,单胞,单生或顶生成小的潮湿簇,成向基的链(图4)。
2.1.5瓶梗青霉属(Paecilomyces spp.)菌落生长早期呈灰绿色,凝聚灰绿色粉状物质,后有灰白色棉絮状菌长出。或菌落暗灰色,棉絮状,背面黑色,菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出,无足细胞,暗色,有横隔膜,菌丝单个发生或成束。分生孢子串生,孢子光滑,单胞,褐色,球形或卵圆形,成向基的链,有2种形态(图5)。 2.1.6穗霉属(Spicaria spp.)菌落生长早期呈青灰色,粉状,后期有白色棉絮状菌生长,背面黄色,菌丝有隔。分生孢子梗分枝多,顶部生轮辐射状排列且松散的小梗。分生孢子串生,暗色(图6)。
2.1.7头孢霉属(Cephalosporium spp.)菌落生长早期呈橙黄色,黏稠状,背面也是橙黄色,菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中生出,直立,短小,顶端生球形、长椭圆形或卵形的分生孢子。分生孢子相继断脱,由分泌的胶状物黏着成小球形,无色,单细胞(图7)。
2.1.8粘帚霉属(Gliocladium spp.)菌落生长早期呈灰色,绒毛状,背面黑色,菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出,无足细胞,暗色,有横隔膜,菌丝单个发生或成束,分生孢子串生,孢子光滑,褐色,球形或卵圆形,该属形态与青霉属相似,但分生孢子结集于子实体所分泌的黏液中(图8)。
2.1.9双曲孢霉属(Nakataea spp.)菌落生长早期呈白色,棉絮状,生长局限,后期分泌无色透明油状物,背面黄色,
菌丝无隔。分生孢子梗单生或丛生,榄褐色,有隔膜,单生或偶尔在顶部分枝,细长。分生孢子生于顶端,梭形,向一方或作“S”形弯曲,两端细胞小而尖,无色或淡色,中部细胞暗褐色(图9)。
2.2内生真菌种群统计分析
本研究共分离出42株菌,初步鉴定为1目1科9属,交链孢霉属1株,占2.38%;青霉属3株,占7.14%;曲霉属3株,占714%;轮枝霉属3株,占7.14%;瓶梗青霉属2株,占4.76%;穗霉属2株,占4.76%;头孢霉属1株,占238%;粘帚霉属1株,占238%;双曲孢霉属26株,占61.9%。其中双曲孢霉属Nakataea spp.为优势菌群。
3结论与讨论
本研究用PDA培养基分离栀子新鲜果实内生真菌,得到内生真菌种群,共分离出42株菌,其中双曲孢霉属为优势菌群,反映了栀子中内生真菌生物多样性。但本方法具有一定的局限性,目前许多学者用植物提取液加入培养基中分离内生真菌群落。内生真菌种群受植物种类、不同生长发育阶段、生态环境等因子的作用,对药用植物特别是药材的品质形成具有重要影响,与植物的生长发育、抗逆性、化学组分有密切关系[10]。
参考文献:
[1]罗光明,陈岩,张晓云,等. 不同品种及产地栀子水溶性成分指纹图谱研究[J]. 中成药,2008,30(4):475-479.
[2]奉延旗,李磊,刘冰. GAP基地与普通产地栀子中栀子苷的含量比较[J]. 中南药学,2007,5(4):339-341.
[3]段启,庄义修,陈华师. HPLC法测定不同产地栀子中栀子苷含量[J]. 亚太传统医药,2009,5(6):20-21.
[4]韩建萍,陈士林,张文生,等. 不同产地栀子药材HPLC指纹图谱研究[J]. 世界科学技术:中医药现代化,2007,9(4):56-60.
[5]唐灿,李云鹏,张彦燕,等. 不同采收期对江西栀子熊果酸含量的影响[J]. 时珍国医国药,2008,19(8):1927-1928.
[6]赵静,游国钧,李辉. 不同采收时期栀子中栀子苷的含量测定[J]. 中医药导报,2007,13(7):102,127.
[7]胡凤,程玉鹏,王振月,等. 药用植物内生真菌研究现状及其应用前景[J]. 生物技术通讯,2008,19(5):781-783.
[8]华永丽,欧阳少林,陈美兰,等. 药用植物内生真菌研究进展[J]. 世界科学技术:中医药现代化,2008,10(4):105-111.
[9]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海:上海科学技术出版社,1979.
[10]江曙,钱大玮,段金廒,等. 植物内生菌与道地药材的相关性研究[J]. 中草药,2008,39(8):1268-1272.
关键词:栀子;内生真菌;分离;鉴定
中图分类号: S567.1+90.1文献标志码: A文章编号:1002-1302(2014)02-0298-03
收稿日期:2013-07-18
基金项目:江西省教育厅科技计划(编号:GJJ12537);江西中医药大学博士启动基金;江西中医药大学重点学科青年教师扶持项目。
作者简介:林贵兵(1981—),男,四川自贡人,博士,讲师,主要从事中药资源研究。E-mail:linguibing897@gmail.com。栀子为茜草科栀子属植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis.)干燥成熟的果实,是一种常见的中药,也是江西省道地药材之一,具有泻火除烦、清热利湿、凉血消毒等功效,外敷可治扭伤瘀肿,主要用于治疗黄疸型传染性肝炎、胆囊炎等症。栀子主要生于海拔1 000 m以下的低坡红壤土地,不耐寒[1]。目前关于栀子的研究主要集中在地理环境、气候条件、采收期不同对栀子药材品质的影响方面[2~6],栀子内生菌群对其品质的影响研究还未见报道。可以采用组织学方法、严格进行表面消毒的植物组织块分离方法,以及植物组织直接扩增微生物DNA方法来证明内生菌的内生性[7]。内生菌群可以通过产生生长素、增进宿主植物营养元素吸收来促进宿主生长,增强宿主抗旱、抗高温、抗虫害等抗逆性,部分内生真菌能够促进药用植物次生代谢产物的合成,产生与宿主相同或相似的药用活性成分[8]。本研究分离纯化栀子新鲜果实中的内生真菌,用插片法观察菌种的菌丝、孢子囊以及孢子等特征,探讨栀子内生真菌群落的多样性。
1材料与方法
1.1材料
2012年10月采自江西中医药大学神农园药用植物栀子的新鲜果实,经刘勇副教授鉴定为茜草科栀子属植物栀子。江西省南昌市属中亚热带湿润季风气候,气候湿润温和,日照充足,年均气温17.0~17.7 ℃,年均降水量1 600~1 700 mm,年均相对湿度为78.5%。
1.2方法
1.2.1内生真菌的分离采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)与混合抗生素(80万单位青霉素钠与硫酸庆大青霉素注射液4万单位混合溶解)培养分离栀子果实的内生真菌。将新鲜健康的栀子果实用自来水冲洗干净,再用无菌水洗 2~3次,用0.1%次氯酸钠溶液浸泡 1 min,再用75%乙醇处理5 min,对果实表面进行消毒,再用无菌水冲洗4~5次。削去外皮,取少量果肉置于培养基中,28 ℃ 下恒温培养 7~10 d。待组织块周围长出白色菌丝后,用接种针挑起,纯化菌种。
1.2.2内生真菌鉴定将菌种置于PDA培养基中,采用插片法在28 ℃下恒温培养7~10 d,观察其产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色,参考《真菌鉴定手册》[9]鉴定内生真菌。
2结果与分析
2.1内生真菌种群
2.1.1交链孢霉属(Alternaria spp.)菌落生长迅速,初期为黑色,随后有灰白色棉絮状菌生长,背面灰黑色。营养菌丝有分隔。分生孢子梗暗色,通常较短,单生或分枝简单,直或略弯曲,有隔。分生孢子暗色,横隔1~6个,纵隔0~5个,倒棍棒形、椭圆形或卵形,顶端常延长为喙状,经常向顶着生成链(图1)。
2.1.2青霉属(Penicillium spp.)菌落灰色或灰白色,绒毛状、蛛网状或棉絮状,背面黑色,菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出,无足细胞,暗色,有横隔膜,菌丝单个发生或成束。分生孢子串生,孢子光滑,单胞,褐色,球形或卵圆形 (图2)。
2.1.3曲霉属(Aspergillus spp.)菌落为褐色或黄色颗粒状, 背面黄色或棕色。菌丝无色、淡色或表面凝集有色物质,有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞(足细胞)中垂直生出,大多数无隔膜,光滑或粗糙,上部较粗大,顶端膨大成球形、椭圆形、半圆形或棍棒形的泡囊,从泡囊的表面以放射状生出小梗或仅在泡囊顶部产生小梗,小梗单层或在顶部再分枝成2个或多个小梗。分生孢子串生于小梗顶端,呈辐射状排列或丛集成柱形,着色、形状、大小、纹饰变化很大(图3)。
2.1.4轮枝霉属(Verticillium spp.)菌落生长早期呈灰色,绒毛状,周围有褐色颗粒物长出,后期有白色棉絮状菌长出,背面接种处黑色,周围浅黄色。或菌落生长早期呈灰色,后渐暗,棉絮状,背面黑色。分生孢子梗细长,轮生分枝。分生孢子为梗孢子,卵圆形或椭圆形,褐色,单胞,单生或顶生成小的潮湿簇,成向基的链(图4)。
2.1.5瓶梗青霉属(Paecilomyces spp.)菌落生长早期呈灰绿色,凝聚灰绿色粉状物质,后有灰白色棉絮状菌长出。或菌落暗灰色,棉絮状,背面黑色,菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出,无足细胞,暗色,有横隔膜,菌丝单个发生或成束。分生孢子串生,孢子光滑,单胞,褐色,球形或卵圆形,成向基的链,有2种形态(图5)。 2.1.6穗霉属(Spicaria spp.)菌落生长早期呈青灰色,粉状,后期有白色棉絮状菌生长,背面黄色,菌丝有隔。分生孢子梗分枝多,顶部生轮辐射状排列且松散的小梗。分生孢子串生,暗色(图6)。
2.1.7头孢霉属(Cephalosporium spp.)菌落生长早期呈橙黄色,黏稠状,背面也是橙黄色,菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中生出,直立,短小,顶端生球形、长椭圆形或卵形的分生孢子。分生孢子相继断脱,由分泌的胶状物黏着成小球形,无色,单细胞(图7)。
2.1.8粘帚霉属(Gliocladium spp.)菌落生长早期呈灰色,绒毛状,背面黑色,菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出,无足细胞,暗色,有横隔膜,菌丝单个发生或成束,分生孢子串生,孢子光滑,褐色,球形或卵圆形,该属形态与青霉属相似,但分生孢子结集于子实体所分泌的黏液中(图8)。
2.1.9双曲孢霉属(Nakataea spp.)菌落生长早期呈白色,棉絮状,生长局限,后期分泌无色透明油状物,背面黄色,
菌丝无隔。分生孢子梗单生或丛生,榄褐色,有隔膜,单生或偶尔在顶部分枝,细长。分生孢子生于顶端,梭形,向一方或作“S”形弯曲,两端细胞小而尖,无色或淡色,中部细胞暗褐色(图9)。
2.2内生真菌种群统计分析
本研究共分离出42株菌,初步鉴定为1目1科9属,交链孢霉属1株,占2.38%;青霉属3株,占7.14%;曲霉属3株,占714%;轮枝霉属3株,占7.14%;瓶梗青霉属2株,占4.76%;穗霉属2株,占4.76%;头孢霉属1株,占238%;粘帚霉属1株,占238%;双曲孢霉属26株,占61.9%。其中双曲孢霉属Nakataea spp.为优势菌群。
3结论与讨论
本研究用PDA培养基分离栀子新鲜果实内生真菌,得到内生真菌种群,共分离出42株菌,其中双曲孢霉属为优势菌群,反映了栀子中内生真菌生物多样性。但本方法具有一定的局限性,目前许多学者用植物提取液加入培养基中分离内生真菌群落。内生真菌种群受植物种类、不同生长发育阶段、生态环境等因子的作用,对药用植物特别是药材的品质形成具有重要影响,与植物的生长发育、抗逆性、化学组分有密切关系[10]。
参考文献:
[1]罗光明,陈岩,张晓云,等. 不同品种及产地栀子水溶性成分指纹图谱研究[J]. 中成药,2008,30(4):475-479.
[2]奉延旗,李磊,刘冰. GAP基地与普通产地栀子中栀子苷的含量比较[J]. 中南药学,2007,5(4):339-341.
[3]段启,庄义修,陈华师. HPLC法测定不同产地栀子中栀子苷含量[J]. 亚太传统医药,2009,5(6):20-21.
[4]韩建萍,陈士林,张文生,等. 不同产地栀子药材HPLC指纹图谱研究[J]. 世界科学技术:中医药现代化,2007,9(4):56-60.
[5]唐灿,李云鹏,张彦燕,等. 不同采收期对江西栀子熊果酸含量的影响[J]. 时珍国医国药,2008,19(8):1927-1928.
[6]赵静,游国钧,李辉. 不同采收时期栀子中栀子苷的含量测定[J]. 中医药导报,2007,13(7):102,127.
[7]胡凤,程玉鹏,王振月,等. 药用植物内生真菌研究现状及其应用前景[J]. 生物技术通讯,2008,19(5):781-783.
[8]华永丽,欧阳少林,陈美兰,等. 药用植物内生真菌研究进展[J]. 世界科学技术:中医药现代化,2008,10(4):105-111.
[9]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海:上海科学技术出版社,1979.
[10]江曙,钱大玮,段金廒,等. 植物内生菌与道地药材的相关性研究[J]. 中草药,2008,39(8):1268-1272.