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摘要：分离纯化栀子（Gardenia jasminoides Ellis.）新鲜果实中的内生真菌，用插片法观察菌种的菌丝、孢子囊以及孢子等特征，探讨栀子内生真菌群落多样性。结果表明，从栀子果实中分离获得了42株内生真菌，初步鉴定为1目1科9属，交链孢霉属（Alternaria spp.）1株，占2.38%；青霉属（Penicillium spp.）3株，占7.14%；曲霉属（Aspergillus spp.）3株，占714%；轮枝霉属（Verticillium spp.）3株，占7.14%；瓶梗青霉属（Paecilomyces spp.）2株，占4.76%；穗霉属（Spicaria spp.）2株，占476%；头孢霉属（Cephalosporium spp.）1株，占2.38%；粘帚霉属（Gliocladium spp.）1株，占2.38%；双曲孢霉属（Nakataea spp.）26株，占61.9%。其中双曲孢霉属为优势菌群。
关键词：栀子；内生真菌；分离；鉴定
中图分类号： S567.1+90.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0298-03
收稿日期：2013-07-18
基金项目：江西省教育厅科技计划（编号：GJJ12537）；江西中医药大学博士启动基金；江西中医药大学重点学科青年教师扶持项目。
作者简介：林贵兵（1981—），男，四川自贡人，博士，讲师，主要从事中药资源研究。E-mail：linguibing897@gmail.com。栀子为茜草科栀子属植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis.）干燥成熟的果实，是一种常见的中药，也是江西省道地药材之一，具有泻火除烦、清热利湿、凉血消毒等功效，外敷可治扭伤瘀肿，主要用于治疗黄疸型传染性肝炎、胆囊炎等症。栀子主要生于海拔1 000 m以下的低坡红壤土地，不耐寒[1]。目前关于栀子的研究主要集中在地理环境、气候条件、采收期不同对栀子药材品质的影响方面[2～6]，栀子内生菌群对其品质的影响研究还未见报道。可以采用组织学方法、严格进行表面消毒的植物组织块分离方法，以及植物组织直接扩增微生物DNA方法来证明内生菌的内生性[7]。内生菌群可以通过产生生长素、增进宿主植物营养元素吸收来促进宿主生长，增强宿主抗旱、抗高温、抗虫害等抗逆性，部分内生真菌能够促进药用植物次生代谢产物的合成，产生与宿主相同或相似的药用活性成分[8]。本研究分离纯化栀子新鲜果实中的内生真菌，用插片法观察菌种的菌丝、孢子囊以及孢子等特征，探讨栀子内生真菌群落的多样性。
1材料与方法
1.1材料
2012年10月采自江西中医药大学神农园药用植物栀子的新鲜果实，经刘勇副教授鉴定为茜草科栀子属植物栀子。江西省南昌市属中亚热带湿润季风气候，气候湿润温和，日照充足，年均气温17.0～17.7 ℃，年均降水量1 600～1 700 mm，年均相对湿度为78.5%。
1.2方法
1.2.1内生真菌的分离采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）与混合抗生素（80万单位青霉素钠与硫酸庆大青霉素注射液4万单位混合溶解）培养分离栀子果实的内生真菌。将新鲜健康的栀子果实用自来水冲洗干净，再用无菌水洗 2～3次，用0.1%次氯酸钠溶液浸泡 1 min，再用75%乙醇处理5 min，对果实表面进行消毒，再用无菌水冲洗4～5次。削去外皮，取少量果肉置于培养基中，28 ℃ 下恒温培养 7～10 d。待组织块周围长出白色菌丝后，用接种针挑起，纯化菌种。
1.2.2内生真菌鉴定将菌种置于PDA培养基中，采用插片法在28 ℃下恒温培养7～10 d，观察其产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色，参考《真菌鉴定手册》[9]鉴定内生真菌。
2结果与分析
2.1内生真菌种群
2.1.1交链孢霉属（Alternaria spp.）菌落生长迅速，初期为黑色，随后有灰白色棉絮状菌生长，背面灰黑色。营养菌丝有分隔。分生孢子梗暗色，通常较短，单生或分枝简单，直或略弯曲，有隔。分生孢子暗色，横隔1～6个，纵隔0～5个，倒棍棒形、椭圆形或卵形，顶端常延长为喙状，经常向顶着生成链（图1）。
2.1.2青霉属（Penicillium spp.）菌落灰色或灰白色，绒毛状、蛛网状或棉絮状，背面黑色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出，无足细胞，暗色，有横隔膜，菌丝单个发生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，单胞，褐色，球形或卵圆形 （图2）。
2.1.3曲霉属（Aspergillus spp.）菌落为褐色或黄色颗粒状， 背面黄色或棕色。菌丝无色、淡色或表面凝集有色物质，有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞（足细胞）中垂直生出，大多数无隔膜，光滑或粗糙，上部较粗大，顶端膨大成球形、椭圆形、半圆形或棍棒形的泡囊，从泡囊的表面以放射状生出小梗或仅在泡囊顶部产生小梗，小梗单层或在顶部再分枝成2个或多个小梗。分生孢子串生于小梗顶端，呈辐射状排列或丛集成柱形，着色、形状、大小、纹饰变化很大（图3）。
2.1.4轮枝霉属（Verticillium spp.）菌落生长早期呈灰色，绒毛状，周围有褐色颗粒物长出，后期有白色棉絮状菌长出，背面接种处黑色，周围浅黄色。或菌落生长早期呈灰色，后渐暗，棉絮状，背面黑色。分生孢子梗细长，轮生分枝。分生孢子为梗孢子，卵圆形或椭圆形，褐色，单胞，单生或顶生成小的潮湿簇，成向基的链（图4）。
2.1.5瓶梗青霉属（Paecilomyces spp.）菌落生长早期呈灰绿色，凝聚灰绿色粉状物质，后有灰白色棉絮状菌长出。或菌落暗灰色，棉絮状，背面黑色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出，无足细胞，暗色，有横隔膜，菌丝单个发生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，单胞，褐色，球形或卵圆形，成向基的链，有2种形态（图5）。 2.1.6穗霉属（Spicaria spp.）菌落生长早期呈青灰色，粉状，后期有白色棉絮状菌生长，背面黄色，菌丝有隔。分生孢子梗分枝多，顶部生轮辐射状排列且松散的小梗。分生孢子串生，暗色（图6）。
2.1.7头孢霉属（Cephalosporium spp.）菌落生长早期呈橙黄色，黏稠状，背面也是橙黄色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中生出，直立，短小，顶端生球形、长椭圆形或卵形的分生孢子。分生孢子相继断脱，由分泌的胶状物黏着成小球形，无色，单细胞（图7）。
2.1.8粘帚霉属（Gliocladium spp.）菌落生长早期呈灰色，绒毛状，背面黑色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出，无足细胞，暗色，有横隔膜，菌丝单个发生或成束，分生孢子串生，孢子光滑，褐色，球形或卵圆形，该属形态与青霉属相似，但分生孢子结集于子实体所分泌的黏液中（图8）。
2.1.9双曲孢霉属（Nakataea spp.）菌落生长早期呈白色，棉絮状，生长局限，后期分泌无色透明油状物，背面黄色，
菌丝无隔。分生孢子梗单生或丛生，榄褐色，有隔膜，单生或偶尔在顶部分枝，细长。分生孢子生于顶端，梭形，向一方或作“S”形弯曲，两端细胞小而尖，无色或淡色，中部细胞暗褐色（图9）。
2.2内生真菌种群统计分析
本研究共分离出42株菌，初步鉴定为1目1科9属，交链孢霉属1株，占2.38%；青霉属3株，占7.14%；曲霉属3株，占714%；轮枝霉属3株，占7.14%；瓶梗青霉属2株，占4.76%；穗霉属2株，占4.76%；头孢霉属1株，占238%；粘帚霉属1株，占238%；双曲孢霉属26株，占61.9%。其中双曲孢霉属Nakataea spp.为优势菌群。
3结论与讨论
本研究用PDA培养基分离栀子新鲜果实内生真菌，得到内生真菌种群，共分离出42株菌，其中双曲孢霉属为优势菌群，反映了栀子中内生真菌生物多样性。但本方法具有一定的局限性，目前许多学者用植物提取液加入培养基中分离内生真菌群落。内生真菌种群受植物种类、不同生长发育阶段、生态环境等因子的作用，对药用植物特别是药材的品质形成具有重要影响，与植物的生长发育、抗逆性、化学组分有密切关系[10]。
参考文献：
[1]罗光明，陈岩，张晓云，等. 不同品种及产地栀子水溶性成分指纹图谱研究[J]. 中成药，2008，30（4）：475-479.
[2]奉延旗，李磊，刘冰. GAP基地与普通产地栀子中栀子苷的含量比较[J]. 中南药学，2007，5（4）：339-341.
[3]段启，庄义修，陈华师. HPLC法测定不同产地栀子中栀子苷含量[J]. 亚太传统医药，2009，5（6）：20-21.
[4]韩建萍，陈士林，张文生，等. 不同产地栀子药材HPLC指纹图谱研究[J]. 世界科学技术：中医药现代化，2007，9（4）：56-60.
[5]唐灿，李云鹏，张彦燕，等. 不同采收期对江西栀子熊果酸含量的影响[J]. 时珍国医国药，2008，19（8）：1927-1928.
[6]赵静，游国钧，李辉. 不同采收时期栀子中栀子苷的含量测定[J]. 中医药导报，2007，13（7）：102，127.
[7]胡凤，程玉鹏，王振月，等. 药用植物内生真菌研究现状及其应用前景[J]. 生物技术通讯，2008，19（5）：781-783.
[8]华永丽，欧阳少林，陈美兰，等. 药用植物内生真菌研究进展[J]. 世界科学技术：中医药现代化，2008，10（4）：105-111.
[9]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979.
[10]江曙，钱大玮，段金廒，等. 植物内生菌与道地药材的相关性研究[J]. 中草药，2008，39（8）：1268-1272.
关键词：栀子；内生真菌；分离；鉴定
中图分类号： S567.1+90.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0298-03
收稿日期：2013-07-18
基金项目：江西省教育厅科技计划（编号：GJJ12537）；江西中医药大学博士启动基金；江西中医药大学重点学科青年教师扶持项目。
作者简介：林贵兵（1981—），男，四川自贡人，博士，讲师，主要从事中药资源研究。E-mail：linguibing897@gmail.com。栀子为茜草科栀子属植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis.）干燥成熟的果实，是一种常见的中药，也是江西省道地药材之一，具有泻火除烦、清热利湿、凉血消毒等功效，外敷可治扭伤瘀肿，主要用于治疗黄疸型传染性肝炎、胆囊炎等症。栀子主要生于海拔1 000 m以下的低坡红壤土地，不耐寒[1]。目前关于栀子的研究主要集中在地理环境、气候条件、采收期不同对栀子药材品质的影响方面[2～6]，栀子内生菌群对其品质的影响研究还未见报道。可以采用组织学方法、严格进行表面消毒的植物组织块分离方法，以及植物组织直接扩增微生物DNA方法来证明内生菌的内生性[7]。内生菌群可以通过产生生长素、增进宿主植物营养元素吸收来促进宿主生长，增强宿主抗旱、抗高温、抗虫害等抗逆性，部分内生真菌能够促进药用植物次生代谢产物的合成，产生与宿主相同或相似的药用活性成分[8]。本研究分离纯化栀子新鲜果实中的内生真菌，用插片法观察菌种的菌丝、孢子囊以及孢子等特征，探讨栀子内生真菌群落的多样性。
1材料与方法
1.1材料
2012年10月采自江西中医药大学神农园药用植物栀子的新鲜果实，经刘勇副教授鉴定为茜草科栀子属植物栀子。江西省南昌市属中亚热带湿润季风气候，气候湿润温和，日照充足，年均气温17.0～17.7 ℃，年均降水量1 600～1 700 mm，年均相对湿度为78.5%。
1.2方法
1.2.1内生真菌的分离采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）与混合抗生素（80万单位青霉素钠与硫酸庆大青霉素注射液4万单位混合溶解）培养分离栀子果实的内生真菌。将新鲜健康的栀子果实用自来水冲洗干净，再用无菌水洗 2～3次，用0.1%次氯酸钠溶液浸泡 1 min，再用75%乙醇处理5 min，对果实表面进行消毒，再用无菌水冲洗4～5次。削去外皮，取少量果肉置于培养基中，28 ℃ 下恒温培养 7～10 d。待组织块周围长出白色菌丝后，用接种针挑起，纯化菌种。
1.2.2内生真菌鉴定将菌种置于PDA培养基中，采用插片法在28 ℃下恒温培养7～10 d，观察其产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色，参考《真菌鉴定手册》[9]鉴定内生真菌。
2结果与分析
2.1内生真菌种群
2.1.1交链孢霉属（Alternaria spp.）菌落生长迅速，初期为黑色，随后有灰白色棉絮状菌生长，背面灰黑色。营养菌丝有分隔。分生孢子梗暗色，通常较短，单生或分枝简单，直或略弯曲，有隔。分生孢子暗色，横隔1～6个，纵隔0～5个，倒棍棒形、椭圆形或卵形，顶端常延长为喙状，经常向顶着生成链（图1）。
2.1.2青霉属（Penicillium spp.）菌落灰色或灰白色，绒毛状、蛛网状或棉絮状，背面黑色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出，无足细胞，暗色，有横隔膜，菌丝单个发生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，单胞，褐色，球形或卵圆形 （图2）。
2.1.3曲霉属（Aspergillus spp.）菌落为褐色或黄色颗粒状， 背面黄色或棕色。菌丝无色、淡色或表面凝集有色物质，有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞（足细胞）中垂直生出，大多数无隔膜，光滑或粗糙，上部较粗大，顶端膨大成球形、椭圆形、半圆形或棍棒形的泡囊，从泡囊的表面以放射状生出小梗或仅在泡囊顶部产生小梗，小梗单层或在顶部再分枝成2个或多个小梗。分生孢子串生于小梗顶端，呈辐射状排列或丛集成柱形，着色、形状、大小、纹饰变化很大（图3）。
2.1.4轮枝霉属（Verticillium spp.）菌落生长早期呈灰色，绒毛状，周围有褐色颗粒物长出，后期有白色棉絮状菌长出，背面接种处黑色，周围浅黄色。或菌落生长早期呈灰色，后渐暗，棉絮状，背面黑色。分生孢子梗细长，轮生分枝。分生孢子为梗孢子，卵圆形或椭圆形，褐色，单胞，单生或顶生成小的潮湿簇，成向基的链（图4）。
2.1.5瓶梗青霉属（Paecilomyces spp.）菌落生长早期呈灰绿色，凝聚灰绿色粉状物质，后有灰白色棉絮状菌长出。或菌落暗灰色，棉絮状，背面黑色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出，无足细胞，暗色，有横隔膜，菌丝单个发生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，单胞，褐色，球形或卵圆形，成向基的链，有2种形态（图5）。 2.1.6穗霉属（Spicaria spp.）菌落生长早期呈青灰色，粉状，后期有白色棉絮状菌生长，背面黄色，菌丝有隔。分生孢子梗分枝多，顶部生轮辐射状排列且松散的小梗。分生孢子串生，暗色（图6）。
2.1.7头孢霉属（Cephalosporium spp.）菌落生长早期呈橙黄色，黏稠状，背面也是橙黄色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中生出，直立，短小，顶端生球形、长椭圆形或卵形的分生孢子。分生孢子相继断脱，由分泌的胶状物黏着成小球形，无色，单细胞（图7）。
2.1.8粘帚霉属（Gliocladium spp.）菌落生长早期呈灰色，绒毛状，背面黑色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出，无足细胞，暗色，有横隔膜，菌丝单个发生或成束，分生孢子串生，孢子光滑，褐色，球形或卵圆形，该属形态与青霉属相似，但分生孢子结集于子实体所分泌的黏液中（图8）。
2.1.9双曲孢霉属（Nakataea spp.）菌落生长早期呈白色，棉絮状，生长局限，后期分泌无色透明油状物，背面黄色，
菌丝无隔。分生孢子梗单生或丛生，榄褐色，有隔膜，单生或偶尔在顶部分枝，细长。分生孢子生于顶端，梭形，向一方或作“S”形弯曲，两端细胞小而尖，无色或淡色，中部细胞暗褐色（图9）。
2.2内生真菌种群统计分析
本研究共分离出42株菌，初步鉴定为1目1科9属，交链孢霉属1株，占2.38%；青霉属3株，占7.14%；曲霉属3株，占714%；轮枝霉属3株，占7.14%；瓶梗青霉属2株，占4.76%；穗霉属2株，占4.76%；头孢霉属1株，占238%；粘帚霉属1株，占238%；双曲孢霉属26株，占61.9%。其中双曲孢霉属Nakataea spp.为优势菌群。
3结论与讨论
本研究用PDA培养基分离栀子新鲜果实内生真菌，得到内生真菌种群，共分离出42株菌，其中双曲孢霉属为优势菌群，反映了栀子中内生真菌生物多样性。但本方法具有一定的局限性，目前许多学者用植物提取液加入培养基中分离内生真菌群落。内生真菌种群受植物种类、不同生长发育阶段、生态环境等因子的作用，对药用植物特别是药材的品质形成具有重要影响，与植物的生长发育、抗逆性、化学组分有密切关系[10]。
参考文献：
[1]罗光明，陈岩，张晓云，等. 不同品种及产地栀子水溶性成分指纹图谱研究[J]. 中成药，2008，30（4）：475-479.
[2]奉延旗，李磊，刘冰. GAP基地与普通产地栀子中栀子苷的含量比较[J]. 中南药学，2007，5（4）：339-341.
[3]段启，庄义修，陈华师. HPLC法测定不同产地栀子中栀子苷含量[J]. 亚太传统医药，2009，5（6）：20-21.
[4]韩建萍，陈士林，张文生，等. 不同产地栀子药材HPLC指纹图谱研究[J]. 世界科学技术：中医药现代化，2007，9（4）：56-60.
[5]唐灿，李云鹏，张彦燕，等. 不同采收期对江西栀子熊果酸含量的影响[J]. 时珍国医国药，2008，19（8）：1927-1928.
[6]赵静，游国钧，李辉. 不同采收时期栀子中栀子苷的含量测定[J]. 中医药导报，2007，13（7）：102，127.
[7]胡凤，程玉鹏，王振月，等. 药用植物内生真菌研究现状及其应用前景[J]. 生物技术通讯，2008，19（5）：781-783.
[8]华永丽，欧阳少林，陈美兰，等. 药用植物内生真菌研究进展[J]. 世界科学技术：中医药现代化，2008，10（4）：105-111.
[9]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979.
[10]江曙，钱大玮，段金廒，等. 植物内生菌与道地药材的相关性研究[J]. 中草药，2008，39（8）：1268-1272.